Name: ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶ ヒト多能性幹細胞のゲノム編集手法。電気穿孔を用いてAAVS1座にEGFPと抗生物質耐性を導入し、コロニー分離と遺伝子型解析で編集細胞を確立する。再生医療や疾患モデリング研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、ヘレンBateupに脳研究財団のシード・グラント（BRFSG-2014から02）によってサポートされていました。ディルクHockemeyerは、エリソン医学財団のエイジングの新学者で、グレン財団だけでなく、ザ・Shurlとケイクルチ財団によってサポートされています。 DHはまた、NIHの助成金1R01CA196884-01によってサポートされています。

この原稿に記載された手順を見直し、カリフォルニア大学バークレー校の幹細胞研究監視委員会によって承認されました。 1.編集するための幹細胞を準備します<ol><li>成長し、マイトマイシンC不活性化マウス胚性線維芽細胞の2.4×10 6細胞 /プレートを含む6ウェルプレート上での培養ヒト多能性幹細胞（hPSCs）（MEF）フィーダーは、ゼラチン32上に成長させました。ウェルあたりヒト胚性幹細胞培地（hESC媒体）3mlにhPSCsを維持し、37で成長 3％O 2/5％CO 2で℃のインキュベーター。 注意：このプロトコルの成功のためには、低酸素培養器でhPSCsを維持する必要はありません。しかし、それは時間と細胞数がそれに応じて調整する必要がありますので、hPSCsは、高O 2の環境でより速く増殖することに留意することが重要です。それはまた、低酸素に維持hPSCs自発分化33の下側速度を有することに留意すべきです。 <ol><li> TO 500ミリリットルのhESCメディアは380ミリリットルのDMEM / F12、75ミリリットルウシ胎児血清（FBS）を組み合わせて行い、25ミリリットルノックアウト血清代替（KSR）。グルタミン（1mMの最終濃度）を、5 mlの100×非必須アミノ酸、100単位/ mlのペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）（4 ngの/ mlの最終濃度）、および2-加えますメルカプトエタノール（5.5μMの最終濃度）。 </li></ol></li><li>ガラスピペット、真空を使用してメディアの全容量（3 ml）を除去することにより、メディアを変更します。 3ミリリットル暖かいhESC媒体が血清学的ピペットを使用して交換してください。 hPSCsが約50％コンフルエント（1日目）になるまで繰り返したメディアは毎日変更されます。 </li><li> 1日（1日目）を標的とする前に、古い培地を除去し、10μMのY-27632を補足した温かみのhESCのメディアを追加し、hESCのメディアを変更します。 </li><li>また、1日目に、DR4マウス（2.4×10 6細胞 /プレート）34から薬剤耐性MEFフィーダー細胞の2個の6ウェルまたは10センチメートルプレートに1を準備します。 注意：一般的には、6ウェルプレートは、広告されています彼らは多くのメディアに対応するように、10cmプレートの上にvantageous。 6ウェルプレートは、異なるウ​​ェルからの異なるクローンが独立していることを確認してください。しかし、10cmのプレートは、このプロセスのために利用可能な顕微鏡に応じて、簡単にピッキングを可能にします。 </li></ol> 2.編集多能性幹細胞<ol><li> 1.5mlチューブにCRISPR / Cas9 px330エンコーディングプラスミド（ 図1）のZFN 1と2、TALEN 1および2、または15μgの5μgの各ピペッティングし、トランスフェクション溶液を調製します。このチューブに修理プラスミドのピペット30μgのにも。最後に、チューブにピペット1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を300μlに音量を表示します。 注：300μlの下のトランスフェクション溶液の全容積を維持するために、300 ngの/μLの最小濃度で（任意のキットが適しています）ミディプレップとしてプラスミドを準備します。これは、プラスミドを線形化するために、フェノール/クロロホルム抽出を行う必要がない場合、またはendotoを使用することXIN無料プラスミドプレップキット。 </li><li>ガラスピペット、真空を使用してhPSCsからメディアを取り出します。細胞を洗浄するために、各ウェルにピペット2ミリリットル暖かい1×PBS。 </li><li>ガラスピペット、真空を使用してすぐに、PBSを削除します。各ウェル中の細胞に直接0.5 mlの0.25％トリプシン-EDTA溶液を加えます。インキュベーターに入れ、約10分間（37℃/ 5％CO 2/3％O 2）。またはフィーダー層まで、プレートを持ち上げを開始します。 </li><li>トリプシン反応を停止し、各ウェルに2ミリリットル暖かいesWashメディア（470ミリリットルDMEM / F12、25ミリリットルのFBS、100単位/ mlのP / S）を追加します。 </li><li>フィーダー細胞がシートとして外れていることを確認してください。全てのウェルを組み合わせ、十分に単50 mlのコニカルチューブにそれぞれの内容をピペット。 10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて粉砕物の細胞。これは、フィーダー層を破壊する必要はありません。 hPSCsは穏やかな粉砕により、フィーダー層の外れます。細胞懸濁液の約15ミリリットルがあるはずです。 </li><li> voluを持って来るためにチューブにesWashメディアの25ミリリットルを追加します。私は最大40 mlの全。大きなフィーダーチャンクが1〜2分間、チューブの底に沈降することを許可します。新しい50mlコニカルチューブに血清用ピペットと預金を使用してチューブから上清（〜38ミリリットル）を取り外します。 </li><li> 190×gで5分間スピンダウン。ガラスピペットと真空を用いてチューブから上清を取り除きます。細胞ペレットを乱さないようにしてください。 500μlの1×PBSで細胞を再懸濁します。以前調製したプラスミドのトランスフェクション溶液を用いて結合します。この段階で細胞をカウントします。エレクトロポレーションにつき5から10000000細胞を使用してください。 </li><li> 、4ミリメートルのエレクトロポレーションキュベットに全体800μlの懸濁物をピペットで3〜5分間氷上に置きます。 250 V、500μF、∞抵抗、および4ミリメートルキュベットサイズ：次のパラメータを使用してエレクトロポレーションシステムの指数関数プログラムを使用して電気穿孔細胞。エレクトロポレーション後、3分間バック氷上のキュベットを配置します。 注：エレクトロポレーションシステムにエレクトロポレーションの時定数を観察します。時定数細胞数及びDNAの純度に応じて変化します。記載された条件および遺伝子パルサーIIを使用した場合のトランスフェクションの成功は、通常、10〜14ミリ秒の時間定数を有します。時定数は、これらの値から変化した場合より低いエレクトロポレーション効率が発生する可能性があります。 </li><li>暖かいhESCのメディアは、10μMのY-27632を補足した18ミリリットル中にエレクトロポレーションした細胞を再懸濁します。プレート3 DR4フィーダー細胞との6ウェルプレートの各ウェルに、この単一細胞懸濁液1ml。インキュベーター（37℃/ 5％CO 2/3％O 2）に戻ります。 </li></ol>陽性コロニーの3選択<ol><li> 2日目、ガラスピペットと真空を使用してすべてのメディアを削除します。 10μMのY-27632を補足した温かみのhESC媒体3mlのと交換してください。 3日目、ガラスピペットと真空を使用してすべてのメディアを削除します。 Y-27632を含まない温かいhESC媒体3mlのと交換してください。 4日目、ガラスピペットと真空を使用してすべてのメディアを削除します。 3mlでのSelectIための抗生物質を補充した温かみのhESCのメディアを交換してくださいに。インキュベーター（37℃/ 5％CO 2/3％O 2）に戻ります。 注意：使用する抗生物質の種類は、カセットが修理テンプレートに含ま抵抗に依存します。 WIBR＃3 hPSCs（NIHレジストリ0079）、0.5 / mlのピ​​ューロマイシン、70μgの/ mlのG418（ジェネティシン）、および35 / mlのハイグロマイシンを操作する場合は正常に使用されてきました。選択のための濃度は、約1週間以内に野生型細胞を死滅させるのに必要な抗生物質の最小濃度を確立することによって経験的に決定されるべきです。 </li><li>日5-12、変化媒体毎日、抗生物質を補充した温かみのhESC媒体で古いメディアを毎回交換します。 注：細胞死を大量に期待しています。個々のコロニーを、8~10日の周りに明らかになるであろう。抗生物質を含まない正規のhESC媒体は、連続選択の12-14日後に使用することができます。細胞密度が高い場合、または細胞死が遅い場合には、培地の酸性化は避けるべきであり、それはメディアvo​​luを増加させる必要があるかもしれません私（4〜5ミリリットルまで）選択の最初の数日間。 </li></ol> 4.ピッキング選択したコロニー（日12-14） <ol><li>日12〜14のコロニーを観察します。解剖顕微鏡で選び、それらが分化し始めている細胞が含まれていないことを確実にするために準備ができているコロニーを観察します。おおよそのサイズは、800-1,200μMでなければなりません。コロニーは12日前にこのサイズに達すると、それは彼らが次に選んだすることをお勧めします。 注：各ターゲット実験では、目的の遺伝子型が分離されていることを確認するために必要な数のコロニーを選択します。例として、AAV-CAGGS-EGFP修理テンプレートとAAVS1編集は一貫して強固な統合が示されており、唯一の12〜24コロニーが約5〜10ヘテロ接合の標的クローンを得るために取りに行く必要がありました。他の標的の実験を採取するために多くのコロニー（ 表1）を必要とする場合があります。正しいターゲッティング事象の頻度は、SSの効率などの要因に依存しますDSB、インサートのサイズ、および選択戦略を導入するN。正しく適切に標的化クローンを得るために必要なコロニーの数を減少させる、標的部位に組み込まれたときにここに提示AAVS1遺伝子座の遺伝子トラップ法の場合には、選択マーカーは、発現されます。 </li><li>ピッキングの前に、MEFを12ウェルプレートを準備する1日（2.4×10 6細胞 /プレート、1つのウェルは、各コロニーのために使用されます選びました）。 </li><li>ピッキングの日に、ガラスピペットと真空を用いて12ウェルプレートにMEFからすべてのメディアを削除し、1ミリリットルのhESCのメディアと交換してください。またピッキングの日に、ピックアップしようとしている6ウェルプレート上のhESCのメディアを変更します。 </li><li>フィーダー層からの個々のコロニーを機械的に解離用ガラスピペットを引き出します。イン・フードブンゼンバーナーの上にピペットを下げ、ガラスが可鍛性になるまで展開点で軟化。すぐに炎から削除して、角度のポイントを作成離れてピペットを引き出します。ブレイク狭いチャネルを残して、曲がった軸から約2cmを指します。 1-2秒間炎に暴露することによって、チャネルの端部を磨きます。 注：鈍い先端は、潜在的に、その後の採集物を汚染する、メディアに各コロニーからの細胞のより多くの量を除去することができるよう必要に応じてコロニーをP20ピペットチップを選ぶが、これは、文化のクローン性を減少させることができます。 </li><li> P1000のフィルターピペットチップを取り、狭い端部に吸引電球を取り付けることによって、デバイスを選んで組み立てます。ワイド端に引っ張らガラスピペットを挿入します。 </li><li>組織培養フードに取り付けられた解剖顕微鏡のステージに選ばれるべきhPSCsの6ウェルプレートを置きます。ピッキング装置の電球を圧縮し、ゆっくりと10〜20の等しいサイズのピースに個々のコロニーを切除し、カット、メディアに作品をリリースしないように注意して。電球を解放することにより、ピペットにコロニーの切除したHPSC片を取ります。転送中にできるだけ少ないメディアを取るようにしてください。 </li><li> TRANSF12ウェルプレートMEFの1ウェルに、個々のコロニー、今壊れて植民地を解放し、ウェルに直接再び電球を圧縮えー。単一細胞由来のクローンの固有の識別を可能にするために、各ウェルにラベルを付けます。ガラスピペットを毎回変え、必要な数のコロニーを繰り返します。 注：ピッキングコロニーを学ぶのに時間がかかる場合があります。これは、対象となるコロニーを分離しようとする前にいくつかのコントロール細胞の実験の練習することをお勧めします。 </li><li>穏やかに、各ウェルの中央に細胞の蓄積を回避するために、第一プレートを揺動、インキュベーター（37℃/ 3％O 2/5％CO 2）で12ウェルプレートを返します。 </li><li>翌日とそれ以降の毎日は、ガラスピペット、真空を使用してメディアのフルボリュームを削除して、細胞が約50％コンフルエントになるまで温かいhESC媒体1.5mlのと交換してください（これは通常10〜12日かかります）。 </li><li> 10〜12日後、各ウェルから1〜2個のコロニーを選択し、再新しい12ウェルプレートに移すMEFpeatingは、レプリカプレートを生成するために、4.1から4.8を繰り返します。 </li><li>元のMEFプレートの各ウェルに残っているコロニーから（下記参照）のDNAを抽出します。 <ol><li>ガラスピペットと真空を使用して、すべてのウェルから培地を除去。ピペット1mlの細胞を洗浄し、各ウェルにPBSを1倍。ガラスピペット、真空を使用して、PBSを削除します。ピペット細胞溶解緩衝液250μlの（H 2 O中の最終濃度：10mMのトリスHCl、5mMのEDTA、0.2％SDS、200mMのNaCl、0.08 mg / mlのプロテイナーゼK）の各ウェルに。インキュベーターに入れ（37℃/ 3％O 2/5％CO 2）O / N。 </li><li>次の日、ピペットそれぞれの内容だけでなく、個々に1.5ミリリットルチューブ。ピペット各チューブにイソプロピルアルコール250μlのDNAを沈殿させました。精力的にチューブを振ります。白色の沈殿物が表示されるはずです。 </li><li>テーブルトップ遠心機で13,000 rpmで3分間、各チューブをスピンダウン。スピンダウンした後、液体廃棄物の中にデカントすることにより、上清を捨てます。小さなDNAペレットの底に付着したままにしておく必要がありチューブ。 DNAペレットを洗浄するために、各チューブに250μlの70％エタノールをピペット。勢いよく振ります。テーブルトップ遠心機で13,000 rpmで3分間、各チューブをスピンダウン。 </li><li>スピンダウンした後、液体廃棄物の中にデカントすることにより、上清を捨てます。小さなDNAペレットをチューブの底に付着したままにしてください。チューブ内に残された液体が存在しないので、上清の残りをピペット。 5〜10分間、ベンチトップ上で乾燥オープンチューブを残します。乾燥後、250μlのTE緩衝液中にDNAを再懸濁します。 DNAを溶解させるために6時間37℃で置きます。 </li></ol></li><li>あらかじめ最適化されたPCRまたはサザンブロット戦略を使用して、各サンプルを遺伝子型。 注意：AAVS1は、AAV-CAGGS-EGFP修理テンプレートを使用して標的とするため、サザンブロット戦略がら 、2009年4総合的なサザンブロット法プロトコルは、南部で見つけることができHockemeyerで見つけることができます2006年35のマルチプレックスPCRジェノタイピングのために。同じ実験を、プライマー及び条件がすることができます表2 36で見つかりました。 </li><li>適切に標的にされていない井戸を捨て、日々適切に標的細胞上のhESCのメディアを変更し続けています。彼らは約50％コンフルエントである場合、ダウン細胞凍結プロトコルを凍結については、以下を参照してください。 <ol><li>ある日、凍結前に、古い培地を除去し、10μMのY-27632を補足した温かみのhESCのメディアを追加し、hESCのメディアを変更します。 </li><li>凍結の日にある2つの15 mlのコニカルチューブにダウン凍結されている12ウェルプレートのウェル当たり、溶液Aと溶液Bの0.5 mlずつを準備します。氷の上でソリューションを配置します。溶液A：50％のhESCのメディアと、50％のFBS;溶液B：80％FBS、20％ジメチルスルホキシド（DMSO）。 </li><li>凍結前に、単一の細胞にHPSCコロニーを解離します。それに応じてボリュームをスケーリング、これを行うための手順2.2から2.8に従ってください。溶液Aを0.5mlで完全に再懸濁細胞ペレット</li><li>細胞懸濁液を均質にするために細胞懸濁液、上下ピペットに0.5ミリリットル溶液Bを追加します。タークE 2ミリリットルクライオチューブに細胞懸濁液（〜1ml）および預金の合計容量。しっかりとキャップをねじ込みます。 </li><li> -80℃の冷凍庫O / Nで置きクライオチューブ。凍結後の日は、-80℃の冷凍庫から凍結細胞を除去し、すぐに長期保存のために液体窒素タンクに置きます。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+targetable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with targetable nucleases.</a> Annu Rev Biochem. 83, 409-439 (2014).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Sci Transl Med. 6 (239), 239ps6(2014).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Bozas, A., Beumer, K. J., Trautman, J. K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+zinc-finger+nuclease-induced+gene+targeting+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of zinc-finger nuclease-induced gene targeting in drosophila.</a> Genetics. 182 (3), 641-651 (2009).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>DeKelver, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics%2C+proteomics%2C+and+regulatory+DNA+analysis+in+isogenic+settings+using+zinc+finger+nuclease-driven+transgenesis+into+a+safe+harbor+locus+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome.</a> Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).</li>
<li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., Doudna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, e00471(2013).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+the+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. the new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2Fcas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genomes+with+rare-cutting+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases.</a> Trends Genet. 12 (6), 224-228 (1996).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Sander, J. D., Maeder, M. L., Reyon, D., Voytas, D. F., Joung, J. K., Dobbs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZiFiT+%28zinc+finger+targeter%29%3A+An+updated+zinc+finger+engineering+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ZiFiT (zinc finger targeter): An updated zinc finger engineering tool.</a> Nucleic Acids Res. 38, W462-W468 (2010).</li>
<li>Carroll, D., Morton, J. J., Beumer, K. J., Segal, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+construction+and+in+vitro+testing+of+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1329-1341 (2006).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), e82(2011).</li>
<li>Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH+assembly+of+TALENs+for+high-throughput+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.</a> Nat Biotechnol. 30 (5), 460-465 (2012).</li>
<li>Sanjana, N. E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M. M., Feng, G., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nat Protoc. 7 (1), 171-192 (2012).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from neisseria meningitidis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Podhajska, A. J., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+the+FokI+endonuclease+to+a+universal+restriction+enzyme%3A+Cleavage+of+phage+M13mp7+DNA+at+predetermined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Conversion of the FokI endonuclease to a universal restriction enzyme: Cleavage of phage M13mp7 DNA at predetermined sites.</a> Gene. 40 (2-3), 175-182 (1985).</li>
<li>Costa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method for genetic modification of human embryonic stem cells using electroporation.</a> Nat Protoc. 2 (4), 792-796 (2007).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+viral+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors.</a> Cell. 136 (5), 964-977 (2009).</li>
<li>Wen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysregulation+in+a+human+iPS+cell+model+of+mental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders.</a> Nature. 515 (7527), 414-418 (2014).</li>
<li>Chiba, K., Hockemeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+site-specific+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human pluripotent stem cells using site-specific nucleases.</a> Methods Mol Biol. 1239, 267-280 (2015).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Ezashi, T., Das, P., Roberts, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+O2+tensions+and+the+prevention+of+differentiation+of+hES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (13), 4783-4788 (2005).</li>
<li>Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+strain+expressing+four+drug-selectable+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes.</a> Nucleic Acids Res. 25 (18), 3745-3746 (1997).</li>
<li>Southern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Southern+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Southern blotting.</a> Nat Protoc. 1 (2), 518-525 (2006).</li>
<li>Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., Vogt, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR%3A+Critical+parameters+and+step-by-step+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol.</a> BioTechniques. 23 (3), 504-511 (1997).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Sexton, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+molecular+identification+of+three+human+TPP1+functions+in+telomerase+action%3A+Recruitment%2C+activation%2C+and+homeostasis+set+point+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic and molecular identification of three human TPP1 functions in telomerase action: Recruitment, activation, and homeostasis set point regulation.</a> Genes Dev. 28 (17), 1885-1899 (2014).</li>
<li>Merkle, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+generation+of+knockin+human+pluripotent+stem+cells+lacking+undesired+mutations+at+the+targeted+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus.</a> Cell Rep. 11 (6), 875-883 (2015).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+parkinson+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li>
<li>Forster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+tissue+with+adult+stem+cell+properties+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human intestinal tissue with adult stem cell properties derived from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 838-852 (2014).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+specificity+of+TALE-based+genome+editing+using+an+expanded+RVD+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved specificity of TALE-based genome editing using an expanded RVD repertoire.</a> Nat Methods. , (2015).</li>
<li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (6), 1436-1443 (2008).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766(2014).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR%2FCas9+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Sci Rep. 4, 5400(2014).</li>
<li>Ousterout, D. G., Kabadi, A. M., Thakore, P. I., Majoros, W. H., Reddy, T. E., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 6, 6244(2015).</li>
</ol>

著者は全く競合する金融利益を宣言しません。

遺伝子編集されたヒト多能性幹細胞の均質な集団を単離するため、ここで提示された方法は、標的遺伝子座でのみ異なる同質遺伝子HPSC株を生成するための強力なアプローチです。これらの細胞は、ヒト細胞の分化および発生のメカニズムを探索するためだけでなく、制御の遺伝的環境の中で単一遺伝子疾患の病態生理を理解するための理想的なシステムです。ここで実証されるように、それはAAVS1遺伝子座での標的組込みを達成するために、3つの独立したSSNの設計戦略（ZFNは、TALENs、およびCRISPR / Cas9）を使用することが可能です。これらの方法のそれぞれが独自の長所と短所があります。電位のZFNの利点とは、ある程度、TALENsは個々ヌクレアーゼ42のDNA結合ドメインを改善するために、反復エンジニアリングを可能にするそれらの設計の柔軟性です。このヌクレアーゼの最適化は、CRIで達成可能であるものを超えてのZFNとTALENsの特異性を増加させることができますSPR / Cas9システム。このような選択性は、標的特異性の高い程度を必要とする臨床応用のために重要であり得ます。 CRISPR / Cas9システムの主な利点は、その使いやすさです。 TALENとZFNコンストラクションキットは、パブリック（ すなわち、Addgene〜21）が利用できるようにしてきたがpx330プラスミドを使用する場合にのみ必要なカスタマイズが20塩基対のオリゴヌクレオチド（あるとして、CRISPR / Cas9ベースのSSNは、構築する非常に容易ですデザイン14）。このシンプルさは、彼らの研​​究におけるゲノム編集を含めるように探している研究室のために有利であることがわかります。 遺伝子編集しHPSCラインを作成するためのヌクレオ43、などの代替トランスフェクション技術があります。しかし、エレクトロポレーションは、一貫して費用対効果4,5,25であることが示されています。ヌクレオはSSN効率ANの増加、直接核にCas9ガイドRNAのリボ核タンパク質複合体をトランスフェクトするために使用することができDの忠実度44。 MEFの上に成長hPSCsは、過剰な分化せずに多能性状態でhPSCsを維持するために、堅牢かつ安価な方法です。また、遺伝的に同一のコロニーの容易な単離を可能にします。あるいは、しかしながら、これらの培養条件は、フィーダベースの培養よりも高価になることができ、MEFのない培養hPSCsすることが可能です。さらに、全体のプロセスは非常にまれな編集イベントの単離または並列編集実験で多数の異なる細胞株の生成を可能にする、拡張可能です。 ここで説明するプロトコルは強固です。しかし、正しく編集したクローンを得ることができると効率に影響を与えるいくつかの重要なステップがあります。この方法のための最も重要なコンポーネントは、高品質のMEFと薬剤耐性のDR4のMEFをしています。単一hPSCsの生存が希薄で、低品質のMEFは未分化HPSCラインの分離を妨げます。第二に、Y-27632の使用でもあります異常な核型45を有する細胞に対して選択的な圧力を生成せずに、単一の細胞の生存を可能にするキー。第三に、十分な間隔コロニーを選ぶことは由来細胞株の遺伝的均質性を保証します。最後に、開口部は、複数のコロニーを新しいウェルに成長することを確認して、多くの小片にコロニーを破壊するのに十分に小さくなるようにガラスピペットを準備することが重要です。これは、遺伝子型決定のために単離したコロニーの原版を残し、文化の中で持っているレプリカプレートでよく間隔のサブクローンのピッキングが可能になります。このプロトコルで挑戦的な部分は、ガラスピペットの引き上げマニュアルです。これは、事前に実施されなければなりません。これは、ガラスピペットを必要としないクローンピッキングの複数の技術が存在することに留意すべきです。実験者は、彼らのために最も適したものを見つけるために奨励されています。 単純な修正によって克服することができるこのプロトコルには制限があります。 Oに意図された実験NLY編集された細胞を富化する別の方法を使用する必要があり、修理またはその修理テンプレート選択カセットを含まないものなしに関心の座を崩壊させます。陽性クローンを見つけるために選ばれなければならないコロニーの数は、選択の非存在下では大幅に増加することに注意してください。効率を改善する1つの戦略は、蛍光タンパク質を発現する非組み込みプラスミドを同時トランスフェクトすることです。細胞は2日間回復させた後、標的細胞は、蛍光活性化セルソーティングを使用して正の蛍光でソートし、29を再播種することができます。このプロセスは、エレクトロポレーションによりプラスミドでトランスフェクトされた細胞のために豊かにし、それによって細胞内での同時編集イベントの確率が高くなります。 ここに記載された技術は、同時に複数の遺伝子座14,46,47を標的とするために 、複数のガイドRNAを使用するように拡張することができます。多くのプロトコルは、hPSCsを区別するために設立されました異なる細胞型に、関心対象30の細胞型における種々の遺伝子操作を可能にします。全体的に、我々は関係なく、SSNの選択のhPSCsで効率的なゲノム編集の可能性を実証しました。我々は、この技術は、任意のゲノム遺伝子座での遺伝子編集された同質遺伝子HPSCラインを作成するように構成することができることを提案します。

ゲノム編集技術が急速に分子および細胞生物学の1のための標準的なツールに進化しています。 hPSCsは、遺伝的に無傷の初代ヒト細胞の自己再生ソースを表し、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）の遺伝子操作は、特に重要です。 hPSCsは、疾患のモデリングのための、または移植療法2,3のソースのような種々の細胞型に分化させることができます。ここでの実証は、AAVS1遺伝子座にレポーター構築物の標的組み込みのための内因性DNA修復機構に関連して、部位特異的ヌクレアーゼ（SSNの）の3つの異なるタイプを使用するプロトコルです。 hPSCsへのSSNのトランスフェクションの後、我々は、レポーターを保有する同質遺伝子の細胞集団を分離する方法を示します。 特に多能性細胞のゲノムを幹、ゲノムを操作する能力は、使用してのSSNは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写activatのユーティリティなどの新しい現象ではありません遺伝子編集またはのようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）が数年前に4-10実証されました。しかし、S。ピオゲネスCRISPR / Cas9技術11-13の出現により、遺伝子編集は14広くアクセスできるようになりました。すべてのSSNは、非相同末端結合（NHEJ）または相同性向かう修理（HDR）15のいずれかを使用して、内因性の細胞メカニズムによって修復された特定の標的部位1,4,5,11で二本鎖DNA切断（DSB）を導入。 HDRは、SSNと修復鋳型の同時トランスフェクションを介して導入される新規な要素を可能にしながら、NHEJは、誤りがちであり、遺伝子機能の喪失をもたらすフレームシフト変異を導入することができます。遺伝子編集を促進するDNA修復の基本原理は、各SSNのために大部分が同じであると考えられている一方で、プラットフォーム間のいくつかの違いに注意することができます。のZFNのデノボ設計は柔軟性およびヌクレアーゼの最適化16、公にのが使用することができます個々のZFNを設計するために利用可能な組立ライブラリおよびスクリーニングツールは、時間がかかることがあります。 ZFN媒介性標的化のための所望の遺伝子座が決定されると、ZFN対は、オンラインツールZiFit 17を設計することができます。設計後、ZFNはモジュール式には、プラスミドクローニング18のいくつかのラウンドを通じて組み立てることができます。また、事前検証済みのZFN 19、市販の多くがあります。 TALEヌクレアーゼは、オンラインツールと公に利用可能なコンポーネント17,20を用いて設計することができます。例えば、TALENsは急速FLASHアセンブリ21またはPCRベースの階層的なゴールデンゲートアセンブリ 22 を使用してを通じて、5 TALEリピートのブロックから組み立てることができます。 SSNの設計およびCRISPR / Cas9を使用して、建設の速度やすさ、広くアクセス可能なツールを編集するゲノムをしました。ガイドRNAの多重化は単一の構築物14でいくつかの遺伝子座を標的とするようにするためのショートガイドRNAを媒介CRISPR / Cas9の標的化もできます。デザイン標的遺伝子座に近接し、遺伝子編集のためのCas9のprotospacer隣接モチーフ（S.用NGGトリヌクレオチドはCas9をpyrogenes PAM）の識別のみを必要とします。 px330プラスミド14にPAMの20塩基対の5 &#39;末端に対応するオリゴヌクレオチドを挿入することによって、構築物は、一のクローニング工程で組み立てることができます。 Sに加えて、 N.からピオゲネス Cas9、Cas9 5&#39;-NNNNGATT-3 &#39;（PAM）を認識し、 髄膜炎菌 （NmCas9）はhPSCs 23で効率的な遺伝子編集を可能にすることが示されています。 SSN設計の容易さの違いに加えて、各プラットフォームに固有の特性を有します。例えば、ZFNはとTALENsはCas9は主に平滑末端のDSBを生成すると考えられている間に4ヌクレオチドの5 &#39;オーバーハング24を発生させるのFokIヌクレアーゼドメインを利用します。 ZFNは、TALENs、およびCas9は、オンオフ率標的DNAに、それらのタンパク質の安定性に異なり、DNAスキャンのモードすべてがCの理論的には、編集結果1の小さな差が生じるウルド。さらなる研究は、完全にこれらの違いの影響を理解するために必要とされるが、ここではすべての3つのプラットフォーム間で非常に堅牢で、容易に遺伝的に改変されたhPSCsを生成するために使用できるプロトコルを記述する。 かかわらず、SSNの選択の、エレクトロポレーションは、hPSCs 25にSSNのと相同性の修理テンプレートをトランスフェクトする堅牢な手順です。抗生物質耐性のための選択後にコロニーの生存数は、遺伝子座特異的なパラメータと編集方針（トランスジェニック挿入と選択のモードの例えば、大きさ）に依存します。ここで説明するプロトコルは、通常、約150〜400単一細胞由来のコロニーを生じます。 このプロトコルを使用してAAVS1遺伝子座での遺伝子編集は、以前のSSN 4,5の有効性を実証するために使用されています。 AAV-CAGGS-EGFP修理テンプレートは、遺伝子トラップstrを使用しています遺伝子座特異的にピューロマイシン耐性を付与するategy。簡単に言えば、修理テンプレートは、プロモーターのピューロマイシン耐性カセットの上流のスプライスアクセプター部位を含みます。 AAVS1遺伝子座におけるPPP1R12C遺伝子の最初のイントロン中に正しい組込みに際して、耐性カセットを編集する遺伝子のプロモーターから発現されます。この特定のAAVS1アッセイの堅牢性は、私たちは各SSNプラットフォームの効率を比較することができます。 SSNのを用いた遺伝子編集は任意の遺伝子を破壊および/または理論的に変更する能力与えられた強力です。 hPSCsは、その後、このようなニューロン26,27を肝細胞、心筋細胞28のようなヒトの細胞型の多数に分化させることができるようにhPSCsにこの戦略を適用すると、汎用性を提供します。加えて、患者由来の誘導多能性幹細胞の使用は、患者固有の遺伝的背景29における修復または既知の疾患を引き起こす変異の導入を可能にします</sup&gt;、病気のメカニズムおよび患者自身のセル 30 を用いた試験治療を調査するためのプラットフォームを提供します。要約すると、hPSCsにおける遺伝子編集は人間開発や病気31の基本的な生物学を研究するための効率的で汎用性の高い手法です。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (HI)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor - basic</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>カルバイオケム</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>4mm エレクトロポレーションキュベット</td><td>Bio-rad</td><td>165-2081</td><td></td></tr><tr><td>X-cel gene pulser II</td><td>Bio-rad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10&times;リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.4&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット、プラグ</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5941</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Life Technologies</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>TX89125-172SFU</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>VWR</td><td>MK303216</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>1.8 mlクライオチューブ</td><td>ThermoScientific</td><td>377267</td><td></td></tr></tbody></table>

ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）のゲノム編集は人間開発​​を理解し、疾患の病態生理学を研究する、そこから遺伝的に制御され、臨床的に関連するプラットフォームを提供します。ゲノム編集のための部位特異的ヌクレアーゼ（のSSN）を採用することにより、それ以外の場合は同質遺伝子の設定で特定の遺伝子変異を保有する新しいHPSCラインの迅速な誘導が可能となります。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNは）、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）とクラスタ化された定期的interspaced短い回文繰り返し（CRISPR）/ Cas9は、最も一般的に使用されるのSSNです。これらのヌクレアーゼのすべては、それによってゲノム遺伝子座で正確な遺伝子編集を促進する、指定されたサイトで、二本鎖DNA切断を導入することによって機能します。 SSN-瞑想ゲノム編集は、挿入/欠失変異を導入したり代替するか、細胞の内因性DNA修復機構、非相同末端結合（NHEJ）と相同性を向い修理（HDR）のうちの2つを利用します二重鎖切断部位での相同修理テンプレートを使用してゲノムえー。 hPSCsのエレクトロポレーションは、蛍光レポーターおよび抗生物質耐性カセットとして導入遺伝子を組み込むのSSNや修理テンプレートをトランスフェクションの効率的な手段です。エレクトロポレーション後に、抗生物質耐性のために選択することによって、修復構築物を組み込んだだけhPSCsを単離することが可能です。機械的にHPSCコロニーを分離し、ジェノタイピングを通じて標的部位での適切な統合を確認すると、正確に標的と遺伝的に均一な細胞株を単離することができます。このプロトコルの有効性は、ヒト多能性幹細胞におけるAAVS1セーフハーバー座に構築EGFPおよびピューロマイシン耐性を組み込むためにすべての3つのSSNのプラットフォームを利用して、ここで示されています。

ここでは、遺伝子工学的にHPSCラインを作成するには、3つの異なるSSNのプラットフォームと互換性のあるプロトコルを示しています。我々は、EGFPレポーターおよびピューロマイシン耐性カセット4を導入し 、修復テンプレートを使用してTALENs 5、以前に発表されたZFN 4を使用して AAVS1遺伝子座でWIBRの＃3ヒト胚性幹細胞を標的としCRISPR / Cas9s 37。 我々は、未分化hPSCsの維持・拡大を可能にする細胞培養ワークフロー（ 図2）のためのMEF上で私たちのhPSCsを培養し、それはまた、効果的かつスケーラブルなコストです。細胞が必要以上に成長している場合は、トランスフェクトされた多能性細胞の数及びその結果として得られる正しく標的HPSCのコロニーの数を減少させる、増加した分化の危険性があります。 我々はelectropSSNのプラットフォームあたり5.0×10 6個の細胞をoratedとDR4 MEFを、単一の6ウェルプレートに、各ターゲットから細胞を播種しました。選択後、各プラットフォームは、EGFP陽性コロニー（ 図3）と、非標的ホモターゲットとヘテロで対象となるクローン（;表3、図4A、B）の組み合わせとなりました。ここで紹介する条件の下で、我々はAAVS1 TALENsは、ほとんどのEGFP陽性クローンが得られたことがわかります。この実験に用いた補修テンプレートは、EGFPレポーターおよびピューロマイシン耐性カセットの上流のスプライス受容部位で構成されています。この「遺伝子トラップ」戦略（ 図1）を使用して 、構築物は、ピューロマイシン耐性カセットの発現を駆動するために、内因性プロモーターを用いて、AAVS1遺伝子座の最初のイントロンに挿入する必要があります。での発現を防止する必要があり、修理テンプレート内のピューロマイシン耐性遺伝子の発現を駆動するプロモーターの欠如<html>ランダム統合のイベント。 したがって、我々はすべてのピューロマイシン耐性クローンがAAVS1サイトで標的にすることを期待しています。それはではなく、ほとんどのPCR戦略（ 図1; 図4C）により、クローンのサブセットが内部プローブを用いたサザンブロットによって検出されているAAVS1遺伝子座における異常の統合を運ぶことに留意すべきである4。これらの統合イベントは、最も可能性の高いドナープラスミド4の倍数の統合につながる異種ターゲティング事象の結果です。私たちは、それぞれのSSNの実験から24個のコロニーを採取し、すべてのプラットフォームが非常に高いターゲティング効率を有しており、最小限の違いを示したことがわかりました。 PCRにより尋問のようTALENプラットフォームは、ほとんどのホモターゲットのクローン（ 表3）を有しながら、CRISPR / Cas9は最も正確に標的のクローンが得られました。 /files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg &quot;幅=&quot; 700 &quot;/&gt; 遺伝子の 図1 の回路図、AAV-CAGGS-EGFP修理テンプレートを使用してAAVS1遺伝子座を編集しました。Hockemeyer らから変更された。2009年<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" width="700" /> 図WIBR＃3セルの2コロニー。ターゲットの前にWIBR＃3ヒト胚性幹細胞のコロニーの代表的な明視野像。分化の欠如と非理想的なもの（右）とは対照的に、理想的なコロニー（左）におけるフィーダー層から明確に分離に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" width="700" /> 図3. EGFP陽性WIBR＃3セル。WIBRの＃AAVS1遺伝子座におけるEGFP発現修理テンプレートの標的と3細胞の代表的な画像。 ZFNで編集代表コロニーの画像、TALENsおよびCRISPR / Cas9が示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" width="700" /> 図4.ジェノタイピング戦略正しいターゲティングを確認する。（A）代表のPCR遺伝子型判定結果3 SSNのプラットフォーム間で、非標的ヘテロ接合およびホモ接合の標的クローンを示します。 WT CTLは野生型コントロールを=。 （B）Repreヘテロ接合の標的クローンおよび3 &#39;外部プローブを用いて検出ホモ接合対象となるクローンを示すsentativeサザンブロットの結果。フラグメントサイズ：WT-6.5キロバイト、編集・6.9キロバイト（C）適切に編集したクローンと非ランダム二重統合とヘテロ接合クローンを示す代表的なサザンブロットの結果。フラグメントサイズ：適切に編集した-6.9キロバイト、異常な追加の統合-5キロバイト<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 研究 </td><td> 遺伝子ターゲット </td><td> プラットフォーム </td><td> 修理テンプレートの種類 </td><td> 取り上げたクローンの＃ </td><td> ターゲティング効率 </td></tr><tr><td>セクストンら 、2014 </td><td> TPP1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-ピューロ</tD&gt; <td>報告されていません</td><td>報告されていません</td></tr><tr><td>セクストンら 、2014 </td><td> TERT </td><td> ZFN </td><td>ハイグロマイシン</td><td>報告されていません</td><td>報告されていません</td></tr><tr><td> Hockemeyer ら 、2009 </td><td> POU5F1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-ピューロ</td><td> 31 </td><td> 39.0パーセント</td></tr><tr><td> Hockemeyer ら 、2009 </td><td> PITX3 </td><td> ZFN </td><td> GFP-ピューロ</td><td> 74 </td><td> 14.9％ </td></tr><tr><td> Hockemeyer ら 、2011 </td><td> POU5F1 </td><td> TALEN </td><td> GFP-ピューロ</td><td> 68 </td><td> 91.0パーセント</td></tr><tr><td> Hockemeyer ら 、2011 </td><td> PITX3 </td><td> TALEN </td><td> GFP-ピューロ</td><td> 96 </td><td> 13.0％ </td></tr><tr><td>マークルら 、2015 </td><td> VASA </td><td> Cas9 </td><td>レポーター、ジェネティシン</td><td> 139 </td><td> 94.0パーセント</td></tr><tr><td>マークルら&lt;/ em&gt;の、2015 </td><td> CRH </td><td> Cas9 </td><td>レポーター、ジェネティシン</td><td> 30 </td><td> 93.0パーセント</td></tr><tr><td>マークルら 、2015 </td><td> HCRT </td><td> Cas9 </td><td>レポーター、ジェネティシン</td><td> 154 </td><td> 92.0パーセント</td></tr><tr><td>マークルら 、2015 </td><td> HMX2 </td><td> Cas9 </td><td>レポーター、ジェネティシン</td><td> 11 </td><td> 45.0パーセント</td></tr><tr><td>フォースターら 、2014 </td><td> LRG5-Nterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-ピューロ</td><td>報告されていません</td><td> 30.0％ </td></tr><tr><td>フォースターら 、2014 </td><td> LRG5-CTERM </td><td> ZFN </td><td> GFP-ピューロ</td><td>報告されていません</td><td> 14.0％ </td></tr><tr><td> Soldner ら 、2011 </td><td> SNCA </td><td> ZFN </td><td>ピューロ</td><td> 96 </td><td> 1.0％ </td></tr></tbody></table> カレとこの方法を用いて標的他の遺伝子の表1の説明、以前に発表された研究から取られた効率をターゲットsponding。4,5,38-41 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 軌跡 </td><td> シーケンス </td><td> ノート </td></tr><tr><td> AAVS1-Fプライマー</td><td> CTCTAACGCTGCCGTCTCTC </td><td> PCR条件：T mを= 57℃、35サイクル</td></tr><tr><td> AAVS1-WT-Rプライマー</td><td> GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG </td><td> WTバンド：1273塩基対</td></tr><tr><td> AAVS1-ターゲット-Rプライマー</td><td> CGTCACCGCATGTTAGAAGA </td><td>ターゲットバンド：992塩基対</td></tr><tr><td> T2-Cas9ガイド</td><td> GGGCCACTAGGGACAGGAT </td><td>マリら 、2013年から</td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN右</td><td> TAGGGACAGGAT </td><td> Hockemeyer ら 、2009年から</td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN左</td><td> TGGGGTGTCACC </td><td> Hockemeyer ら 、2009年から</td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN右</td><td> TCCTAACCACTGTCTTT </td><td> Hockemeyer ら 、2011年から</td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN左</td><td> CCCCTCCACCCCACAGT </td><td> Hockemeyer ら 、2011年から</td></tr></tbody></table> プライマーとSSN標的化配列の表2のリスト。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 標的構 ​​築物 </td><td> EGFP +コロニー数 </td><td> ターゲット取り上げたクローン（PCRを検証） </td><td> （サザンブロットによる）前報告正しいターゲティング効率 </td></tr><tr><td> ZFN </td><td> 150 </td><td> 86.9パーセント（73.9パーセントのヘタ/ 13.0％ホモ） </td><td> 56％（50％HET / 6％のホモ） </td></tr><tr><td> TALEN </td><td> 412 </td><td> 91.3パーセント（47.8パーセントのヘタ/ 39.1パーセントホモ） </td><td> 47％（37.5％のヘタ/ 9.3％ホモ） </td></tr><tr><td> CRISPR-Cas9 </td><td> 235 </td><td> 95.7パーセント（69.5パーセントHET / 26.3％ホモ） </td><td>報告されていません</td></tr></tbody></table> 表3.比較EGFP陽性の数とはTALEN、ZFNを対象とし、CRISPR / Cas9ヒト幹細胞コロニー。PCRは、以前の実験4,5に適切な単一の統合検証サザンブロットと比較されるこの実験のAAVS1遺伝子座での統合を検証しました。

ヒト多能性幹細胞(hPSC)のゲノム編集は、迅速かつ効率的に行うことができます。ここでは、AAVS1セーフハーバー遺伝子座を編集してEGFPを発現させ、抗生物質耐性を導入することで例示されるように、hPSCを遺伝子操作するための堅牢な実験手順を示します。

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

この手順の全体的な目的は、最新のゲノム編集技術を用いてヒト多能性幹細胞を遺伝的に操作することです。この手順は幹細胞生物学への洞察を与えるだけでなく、遺伝的に定義された設定でのヒト疾患モデリングを促進するためにも応用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、熟練する前にコロニーの分離を練習する必要があります。コロニーの同定およびピックアップは困難な場合があるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。まず、ゼラチン上で増殖させたmitomycin C不活化マウス胚性線維芽細胞（MEFフィーダー細胞）を含む6ウェルプレートを用い、hESC培地でヒト多能性幹細胞を培養します。播種後、hPSCsが50%コンフルエントに達するまで、毎日ガラスピペットと吸引装置を用いて培地全量を回収してください。各ウェルに3 mLの温めたhESC培地を補充します。標的化の1日前、hESC培地を除去し、10 µMのY-27632を添加した新鮮な予熱済みhESC培地を加えます。また、DR4マウス由来の薬剤耐性MEFフィーダー細胞を、6ウェルプレート1〜2枚分準備します。ターゲティング当日、Zinc finger nuclease発現プラスミド1および2、TALON 1および2発現プラスミドを5 µgずつ、またはCRISPR cas9 px330エンコードプラスミドを15 µg、1.5 mLチューブにピペッティングしてトランスフェクション溶液を調製します。ここに修復ドナープラスミドを30 µg加え、続いて1x リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えて全量を300 µLにします。顕微鏡下で細胞を観察し、コンフルエンシーが50%であることを確認してください。次に、ガラスピペットと吸引装置を用いてhPFCsのプレートから培地を除去し、2 millilitersの温めた1x PBSで細胞を洗浄します。PBSを吸引後、0.25%Trypsin-EDTA溶液0.5 millitersを細胞に直接加えます。組織培養インキュベーターに約10分間、またはフィーダー層がプレートから剥がれ始めるまで置きます。インキュベーション後、各ウェルに温めたES洗浄培地を2 mL加え、トリプシン反応を停止させます。各ウェルから細胞を回収し、フィーダー細胞がシート状に剥離することを確認してください。各ウェルの内容物を1本の50 mLコニカルチューブに回収してまとめ、10 mLセロロジカルピペットを用いて細胞をピペッティングし、分散させます。ES洗浄培地を加え、細胞懸濁液の全量を40 millilitersにします。大きなフィーダー細胞の塊がチューブの底に沈殿するまで1〜2分間待ち、その後、セロロジカルピペットを用いて上清を除去し、新しい50 milliliterコニカルチューブに移します。細胞懸濁液を190 times gで5分間遠心分離した後、細胞ペレットを乱さないように上清を吸引除去します。細胞を500 µLの1x PBSに再懸濁します。再懸濁した細胞を、あらかじめ調製したプラスミド導入用溶液と混合します。細胞と導入混合液を4 mmのエレクトロポレーションキュベットにピペットで分注し、氷上で3〜5分間静置します。エレクトロポレーション装置の指数関数的プログラムのパラメータを、電圧250 volts、容量500 microfarads、抵抗無限大、キュベットサイズ4 millimeterに設定します。細胞をエレクトロポレーションし、その後キュベットを氷上に3分間戻します。エレクトロポレーション後の細胞を、10 micromolar Y-27632を添加した温かいhESC培地18 millilitersで再懸濁します。顕微鏡下でDR4 MEFを確認します。DR4フィーダー細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルに、単一細胞懸濁液を3 mLずつ分注し、インキュベーターに戻します。播種から3日後、細胞の培地をY-27632を含まないhESC培地に交換します。4日目に、サプリメントを含まない培地を、適切な選択抗生物質を含む培地に変更します。ここではピューロマイシンを使用します。コロニーピックの前日に、ピックするコロニー1つにつき1ウェルとして、MEFフィーダー細胞を入れた12ウェルプレートを準備します。播種後12日目に、解剖顕微鏡でプレートを観察します。ピックアップ可能な直径800～1,200 µmのコロニーを特定してください。ここに示されているコロニーのように、分化し始めている細胞が含まれていないことを確認してください。また、細胞がGFPを発現していることを確認してください。ピックアップ当日に、顕微鏡下でMEFを観察し、良好な状態であることを確認します。MEFフィーダー細胞プレートから培地をすべて除去し、hESC培地1 mLに交換します。また、コロニーピックを行う予定の6ウェルhPSCプレートのhESC培地を交換します。次に、コロニーピック用のガラスピペットを準備します。コロニーをピックするには、まず組織培養フード内の解剖顕微鏡のステージにhPFCプレートを置き、ガラスピペットの端を吸引バルブに差し込んでピック用デバイスを組み立てます。ピックアップするコロニーを特定し、伸展させたガラスピペットの先端をコロニーの上に置きます。次に、ピックアップデバイスのバルブを押し、個々のコロニーを慎重に切り出し、10〜20個の均等なサイズの破片に分割します。続いて、バルブを離して、切り出したコロニーの破片をピペット内に吸い込みます。移送時は、培地をできるだけ少量採取するようにしてください。バルブを押し、分散させたコロニーを12ウェルMEFフィーダー細胞プレートの1つのウェルに直接移送します。単一細胞由来のクローンを個別に識別できるよう、各ウェルにラベルを貼ってください。ガラスピペットを交換し、次のコロニーに対して同様の手順を繰り返します。プレートをインキュベーターに戻し、プレートを緩やかに揺らしてウェル内の細胞を分散させます。翌日、培地を全量除去し、1.5 mLの温めたhESC培地と交換します。細胞が50%コンフルエントになるまで、この操作を10〜12日間繰り返します。10〜12日後、顕微鏡下でhESCを観察します。各ウェルから1〜2個のコロニーを選択し、新しい12ウェルMEFフィーダー細胞プレートに移植して、レプリカプレートを作成します。元のプレートの各ウェルに残っているコロニーからDNAを抽出し、PCRまたはサザンブロットによるジェノタイピングを行います。Weber Threeヒト胚性幹細胞において、部位特異的ヌクレアーゼとリペアテンプレートを用いてAAVS1遺伝子座を標的とし、EFFPレポーターとピューロマイシン耐性カセットを導入しました。これらの代表的な画像は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、およびCRISPR/Cas9で編集されたコロニーを示しています。これらの代表的なPCRジェノタイピング結果は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、およびCRISPR/Cas9を用いた、非ターゲット、ヘテロ接合性、およびホモ接合性ターゲットクローンの結果を、野生型コントロールとともに示しています。この表は、本実験における各部位特異的ヌクレアーゼのAAVS1遺伝子座へのPCR検証済み統合を示しており、過去の実験におけるサザンブロット検証済みの適切な単一統合と比較しています。CRISPR-Cas9が最も多くの正しくターゲットされたクローンを産出し、TALENプラットフォームが最も多くのホモ接合性ターゲットクローンを産出しました。この手法に習熟すれば、実作業時間は約3〜5時間で済み、実験開始から約3週間以内に編集済み細胞を得ることができます。本手法では、常に安全に配慮し、無菌操作を徹底することが非常に重要です。遺伝子操作の後、幹細胞をニューロンなどの他の細胞型へと分化させることで、その操作が他の細胞型にどのような影響を与えるかを確認できます。本プロトコルの開発により、ヒト多能性幹細胞でゲノム編集を行い、in vitro 疾患モデルを構築することが研究者にとって可能となりました。このビデオを視聴することで、ヒト多能性幹細胞におけるゲノム編集の方法について十分に理解できるはずです。

establishment-genome-edited-human-pluripotent-stem-cell-lines-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

このビデオでは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)におけるジンクフィンガーヌクレアーゼベースのゲノム編集の技術を示しています。hPSCはさまざまな細胞タイプに分化できる可能性があるため、この技術は患者固有の方法でin...

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing:二本鎖ホモロジー依存性修復機構によるヒト多能性幹細胞のゲノム改変技術

レポーター細胞株は、視覚追跡し、不均一な集団から目的の細胞を単離する手段を提供する。しかし、遺伝子ターゲッティングヒト胚性幹細胞は、従来の相同組換えを使用しては非常に非効率的である。本明細書では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ増強相同組換えを使用して、EGFPとCNS中脳特異的転写因子PITX3遺伝子座を標的と記載している。...

ヒト胚性幹細胞におけるターゲティングジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子の強化

私たちは、レンチビラールベースの再プログラムされ、特徴付けられた因子フリーのヒト誘導多能性幹細胞を導き出し、推定される臨床グレードの状態に変換するためのプロトコルを記述します。...

導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

TALENを介したセーフハーバーAAVS1遺伝子座での遺伝子編集により、ヒトiPS細胞における高効率の導入遺伝子追加が可能になります。このプロトコールでは、TALENおよびドナーベクター導入のためのiPS細胞の調製、iPS細胞のトランスフェクション、およびiPS細胞クローンの選択と単離の手順を説明しています。これにより、GFP遺伝子を標的と組み入れてレポーターラインを作製することができます。...

トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

ここでは、以前に記載されたシステムを改良するヒト多能性幹細胞（hPSCs）のAAVS1座にRMCEに基づいて、迅速かつ効率的な遺伝子編集方法を報告しています。この技術を用いて、同質遺伝子系統を迅速かつ確実にhPSCsで形質転換媒介性の研究を容易に、適切な比較試験のために生成することができます。...

中リコンビナーゼ媒介カセット交換による組換えヒト多能性幹細胞の迅速かつ効率的な生成<em&gt; AAVS1</em&gt;軌跡

iCRISPRプラットフォームを使用HPSC変異株を作製し、グルコース応答性β様細胞にhPSCsを区別するためのプロトコルが記載されています。 HPSC指向分化にゲノム編集技術を組み合わせることにより、人間開発と疾患の進行中の系譜決定因子の役割の体系的な分析のための強力なプラットフォームを提供します。...

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

タグ内因のプロトコル CRISPR/Cas9...

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。...

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

学ぶ ヒト多能性幹細胞のゲノム編集手法。電気穿孔を用いてAAVS1座にEGFPと抗生物質耐性を導入し、コロニー分離と遺伝子型解析で編集細胞を確立する。再生医療や疾患モデリング研究に応用可能です。

ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

さらに動画を探す