ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

この手順の全体的な目標は、最新のゲノム編集技術を使用してヒト多能性幹細胞を遺伝子操作することです。この手順は幹細胞生物学への洞察を提供することができますが、遺伝的に定義された環境でのヒト疾患モデリングを容易にするためにも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、熟練する前にコロニーの分離を練習する必要があります。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、コロニーの同定と選択が難しい場合があるため、不可欠です。まず、マイトマイシンC不活化マウス胚性線維芽細胞、またはゼラチン上で増殖したMEFフィーダー細胞を含む6ウェルプレート上のhESC培地でヒト多能性幹細胞を培養します。めっき後、hPSCが50%の密度に達するまで、ガラスピペットと真空を使用して、培地の全量を取り出します。

ウェルごとに3ミリリットルの温かいhESCメディアと交換してください。ターゲティングの1日前に、hESC培地を取り出し、10マイクロモルY-27632を添加した新鮮な温めたhESC培地を追加します。また、DR4マウス由来の薬剤耐性MEFフィーダー細胞の6ウェルプレートを1〜2枚調製します。

ターゲティング当日は、5 μgのZinc finger nuclease expression plusid 1および2、TALON 1および2 expression plusid、または15 μgのCRISPR cas9 px330コードプラスミドを1ポイント5ミリリットルチューブにピペットで移漬し、トランスベクション溶液を調製します。修復したドナープラスミドを30マイクログラム加え、続いて1xリン酸緩衝生理食塩水を加えて容量を300マイクロリットルにします。顕微鏡で細胞を検査し、50%の密度を確認します。

次に、ガラスピペットと真空を使用してhPFCのプレートから培地を取り出し、次に2ミリリットルの温かい1x PBSで細胞を洗浄します。PBSを吸引した後、0.25%トリプシンEDTA溶液のゼロポイント5ミリリットルを直接細胞に加えます。組織培養インキュベーターに約10分間、またはフィーダー層がプレートから浮き上がり始めるまで置きます。

インキュベーション後、トリプシン反応を止めるために、各ウェルに2ミリリットルの温かいES洗浄培地を加えます。各ウェルから細胞を採取し、フィーダー細胞がシート状に剥がれるようにします。各ウェルの内容物を1本の50ミリリットルの円錐管にピペットで移し、すべてのウェルを組み合わせ、10ミリリットルの血清ピペットを使用して細胞を三次元化します。

ES洗浄培地を添加して、細胞懸濁液を40ミリリットルにします。1〜2分待って、大きなフィーダーチャンクがチューブの底に沈殿するまで待ってから、血清学的ピペットを使用して上清を取り除き、新しい50ミリリットルの円錐管に沈着させます。細胞懸濁液を190 gで5分間遠心分離した後、細胞パレットを乱さずに上清を吸引します。

細胞を500マイクロリットルの1x pbsに再懸濁します。再懸濁した細胞を、以前に調製した血漿切断溶液と組み合わせます。細胞とトランスフェクション混合物を4mmエレクトロポレーションキュベットにピペットで移し、氷上に3〜5分間置きます。

エレクトロポレーション システムの指数プログラムのパラメーターを 250 ボルト、500 マイクロファラッド、無限抵抗、4 mm キュベット サイズに設定します。細胞をエレクトロポレーションし、キュベットを氷の上に3分間戻します。エレクトロポレーションした細胞を、10マイクロモルのY-27632を添加した18ミリリットルの温かいhESC培地に再懸濁します。

DR4 MEFを顕微鏡で検査します。DR4フィーダー細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルに3ミリリットルの単一細胞懸濁液をプレートし、インキュベーターに戻します。めっき後3日目に、Y-27632を含まない細胞hESC培地上の培地を交換します。

4日目に、未補充の培地を適切な選択抗生物質を含む培地と交換します。ここではピューロマイシンが使われます。コロニーピッキングの前日に、ピッキングするコロニーごとにMEFフィーダーセルの12ウェルプレートを1枚準備します。

めっき後12日目に、解剖顕微鏡でプレートを点検します。ピッキングの準備ができている直径800〜1、200ミクロンのコロニーを特定します。これらのコロニーに、ここに示されているような分化し始めている細胞が含まれていないことを確認してください。

また、細胞がGFPを発現していることを確認してください。ピッキング当日は、MEFを顕微鏡で検査し、健康であることを確認してください。MEFフィーダーセルプレートからすべての培地を取り出し、1ミリリットルのhESC培地と交換します。

また、ピッキングする6ウェルhPSCプレートのhESCメディアを交換します。次に、コロニーをピッキングするためのガラスピペットを引きます。コロニーをピッキングするには、まずプレートhPFCを組織培養フード内の解剖顕微鏡のステージに置き、ガラスピペットの端を吸引バルブに入れてピッキング装置を組み立てます。

ピッキングするコロニーを特定し、引っ張ったガラスピペットの先端をコロニーの上に置きます。次に、ピッキング装置の球根を圧縮して、個々のコロニーを10〜20個の同じサイズのピースに穏やかに切除および切断します。次に、球根を離して、切除されたコロニー片をピペットに引き込みます。

転送中は、できるだけメディアを取らないようにしてください。球根を圧縮して、壊れたコロニーを12ウェルMEFフィーダーセルプレートの1つのウェルに直接移します。各ウェルを標識して、シングルセル由来のクローンを一意に同定できるようにします。

ガラスピペットを交換し、次のコロニーに対して手順を繰り返します。プレートをインキュベーターに戻し、プレートを静かに揺らしてウェル内の細胞を分散させます。翌日、メディアの全量を取り出し、1ポイント5ミリリットルの温かいhESCメディアと交換します。

細胞が50%コンフルエントになるまで、10〜12日間繰り返します。10〜12日後、スコープ内のhESCを検査します。各ウェルから1〜2コロニーをピックし、新しい12ウェルMEFフィーダーセルプレートに移してレプリカプレートを生成します。

元のプレートの各ウェルに残っているコロニーからDNAを抽出し、PCRまたはサザンブロットによるジェノタイピングを行います。Weber 3つのヒト胚性幹細胞を、部位特異的ヌクレアーゼと修復テンプレートを使用してAAVS1遺伝子座に標的化し、EFFPレポーターとピューロマイシン耐性カセットを導入しました。これらの代表的な画像は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、およびCRISPR/Cas9で編集されたコロニーを示しています。

これらの代表的なPCRジェノタイピングの結果は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、およびCRISPR/Cas9と野生型コントロールを用いた、ノンターゲット、ヘテロ接合性、およびホモ接合型の標的クローンを示しています。この表は、この実験における各部位特異的ヌクレアーゼのAAVS1遺伝子座でのPCR検証済みの組み込みを、以前の実験でサザンブロットで検証された適切な単一組み込みと比較して示しています。CRISPR-Cas9は最も正確に標的化されたクローンを作製し、TALENプラットフォームは最もホモ接合的に標的化されたクローンを示しました。

この手法を習得すると、約3〜5時間のハンズオン時間で、実験を開始してから約3週間以内に編集された細胞を手に入れることができます。この技術では、安全に作業し、常に滅菌技術を使用することが非常に重要です。遺伝子操作に続いて、幹細胞をニューロンなどの他の細胞タイプに分化させることで、他の種類の細胞にどのような影響を与えるかを見ることができます。

このプロトコールの開発は、研究者がヒト多能性幹細胞のゲノム編集を使用してin vitro疾患モデルを確立する道を開きました。このビデオを見れば、ヒト多能性幹細胞のゲノム編集方法について十分に理解できるはずです。