モルフォリノ媒介遺伝子編集:単細胞洞窟魚卵におけるトランスレーショナルブロッキングモルフォリノオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子ノックダウン技術

モルホリノは、天然のヌクレオチドと比較してリン酸骨格と糖構造に違いがある短い一本鎖の再設計されたオリゴヌクレオチドです。これらの特徴は、生理学的pHでのモルホリノの安定性を高めます。これらの変動にもかかわらず、モルホリノには標準的なヌクレオ塩基が含まれており、ノックダウンされる目的の標的遺伝子からの特定のmRNA配列に相補的なオリゴヌクレオチドの設計に役立ちます。

モルホリノ駆動の遺伝子編集を実行するには、まず、アガロース注入プレートのウェル内に配置された単細胞の洞窟魚の卵を採取します。半透明で丸い卵を視覚化して、卵黄嚢(卵の内部に存在する液体で満たされた構造)を見つけます。

設計されたモルホリノを含む溶液があらかじめ充填されたマイクロインジェクション針を取ります。溶液を卵黄に直接注入し、モルホリノが細胞質に確実に入るようにします。細胞内で標的遺伝子がmRNAを形成し、細胞質に輸送されます。

細胞質内では、注入されたモルホリノは、内因性開始部位で相補的な標的mRNA転写物とハイブリダイズし、それを超えて伸びます。このプロセスは、リボソームのより大きなサブユニットと、いくつかの特定のタンパク質と複合体を形成した小さなリボソームサブユニットからなる初期の翻訳開始複合体との結合をブロックします。

、翻訳開始複合体の進行が立体的に妨げられ、タンパク質へのmRNAの翻訳が停止します。最後に、モルホリノによる翻訳ブロッキングにより、標的タンパク質濃度が低下します。

注射当日、ガラスピペットを使用して単細胞卵を注射プレートに移し、注入プレートの最大5列に1列あたり30〜40個の卵を満たします。少量の魚系水で卵を水分補給してください。モルホリノを氷上で解凍し、長いマイクロローダーピペットチップを使用するか、最後に2〜4マイクロリットルのボーラスを追加することにより、卵あたり400ピコグラムのモルホリノが注入されるように注射液を調製します。

すべての針が装填されたら、鉗子を使用して注射針の先端から余分な長さを切り取り、最初の針をピコリットルマイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付けます。次に、注射皿を解剖顕微鏡下に置き、マイクロマニピュレーターを使用して針で各卵を貫通させてから、1ナノリットルのモルホリノ注射液を卵黄に直接注入します。