コロニー形成アッセイのためのギムザ染色:間葉系幹細胞の増殖能を評価するためのin vitro染色手順

コロニー形成アッセイは、コロニーに成長する細胞の増殖能力を測定します。

まず、間葉系幹細胞またはMSCを含む赤血球および単核細胞を含む骨髄由来細胞懸濁液を培地に播種し、培養プレート上の培地にインキュベートします。MSCはプレートの底に付着しますが、赤血球と単核細胞は懸濁液のまま残り、廃棄されます。

MSCの生存をサポートするために、成長因子を含む新鮮な培地を追加します。個々の増殖能に応じて、MSCは複製してコロニーを形成します。

次に、コロニーをメタノールで処理します。メタノールは細胞を透過化し、細胞内環境から水を置換し、タンパク質を変性させて細胞構造を維持します。

固定コロニーをギムザ染色液(メチレンブルー、主に塩基性染料である紺碧B)と酸性染料であるエオシンYの酸化生成物の混合物)でインキュベートします。細胞に拡散すると、正に帯電した紺碧のB二量体は、核内の負に帯電したDNAにインターカレーションを介して結合し、青い染色を与えます。

、負に帯電したエオシンYモノマーは、結合した紺碧のB二量体上の中和されていない正電荷と相互作用し、「エオシン-Y-紺碧-B複合体」を形成し、青色に染色されたDNAの色を紫色に変化させます。

リボソームに富む細胞質では、紺碧のBは負に帯電したRNAに結合しますが、高密度のリボソームへのエオシンYの浸透が減少し、エオシン-Y-紺碧-B複合体の形成が妨げられ、RNAが青色に染まります。

次に、プレートをバッファーで洗って余分な汚れを取り除き、自然乾燥させます。紫色の核と青色の細胞質を持つ細胞のクラスターとして現れるコロニーの数を数えます。

CFUアッセイを実行するには、滅菌水を使用してストック溶液を1〜10に希釈することにより、ディッシュあたり10ミリリットルのギムザ溶液を調製します。細胞培養皿から培地を取り出し、PBSを使用して細胞を注意深く洗浄します。

純粋なメタノールを使用して、細胞を室温で5分間固定してから、メタノールを廃棄し、ギムザ溶液を加えます。摂氏37度の加湿チャンバーで60分間インキュベートします。インキュベーション後、PBSを使用して細胞を2回洗浄します。次に、ペーパータオルでプレートを頭から自然乾燥させます。プレートの裏側にマーカーを使用して、コロニーを手動で数えます。