逆相高速液体クロマトグラフィー:マウス肝臓から単離された蛍光標識および誘導体化シアル酸の定量のための頑健な分析法(英語)

N-アセチルノイラミン酸やN-グリコリルノイラミン酸などのシアル酸は、哺乳類の細胞表面のオリゴ糖鎖の遠位末端に見られる負に帯電した炭水化物部分です。

逆相高速液体クロマトグラフィーまたはRP-HPLCを使用してマウス肝組織中のこれらのシアル酸の相対量を定量するには、まず、単離されたシアル酸混合物を誘導体化剤で処理します。誘導体化剤はシアル酸の官能基と相互作用し、安定した蛍光シアル酸誘導体を生成します。

蛍光検出器に接続されたRP-HPLCカラムを組み立てます。このカラムは、クロマトグラフィー分析中にシアル酸誘導体との選択的相互作用を促進するために、非極性、疎水性、アルキル鎖配位子に結合した多孔質シリカベースの固定相で構成されています。

カラムコンディショニングのために、低濃度のアセトニトリル(低極性有機溶媒)を含む水性極性移動相を使用してカラムを平衡化します。

誘導体化したシアル酸混合物をカラムにロードします。

疎水性のN-アセチル基を含むN-アセチルノイラミン酸は、親水性のN-グリコリル基を持つN-グリコリルノイラミン酸よりも固定相の疎水性配位子に強く吸着します。

オンライン蛍光検出器に接続された標準的なHPLCシステムを使用して、サンプルを分析します。分析には、長さ 250 mm、直径 4.6 mm の逆相 C-18 カラムを使用します。

溶媒Aと溶媒Bを調製し、テキストプロトコルに詳述されているようにHPLCランを設定した後、50マイクロリットルのサンプルをHPLCシステムに注入します。

光検出器の励起波長373ナノメートル、発光波長448ナノメートルを使用して、溶離液をモニターします。

最後に、テキストプロトコルに記載されているように、Neu5Gcの相対量を計算します。