同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベル スフィンゴミエリン種

この手順の全体的な目標は、生体サンプル中の各スフィンゴミエリン種の量と構造を正確に分析することです。この方法は、脂質生物学と脂質に関連する脂質分野の重要な質問に答えるのに役立ちますこの技術の主な利点は、クロマトグラフィー質量分析システムによって生物学的サンプル中のさまざまなスフィンゴミエリン種を特徴付けることができることです。まず、HeLa細胞を含む10cmの組織培養皿から培地を取り出し、6ミリリットルの氷冷PBSで細胞を2回すすぎます。

次に、10cmの組織培養皿に氷冷したPBSを1ミリリットル加え、細胞スクレーパーを使用して細胞を回収します。皿の表面から取り出したら、細胞を2ミリリットルのシリコン処理プラスチックチューブに移します。遠心分離後、上清を除去し、各細胞ペレットに1ミリリットルのメタノールを加えます。

次に、チューブを短時間ボルテックスします。次に、サンプルをバス型超音波発生器に入れ、200ワットで5分間超音波処理します。終了したら、全細胞ホモジネートをテフロンライニングスクリューキャップを備えた試験管に移します。

次に、1ミリリットルのメタノール、1ミリリットルのクロロホルム、0.8ミリリットルの二重蒸留水、50マイクロリットルの内部標準液10マイクロリットルを各試験管に加えます。チューブをキャップし、室温で5分間、2, 500rpmで激しく渦巻きます。次に、各チューブにさらに1ミリリットルのクロロホルムと1ミリリットルの二重蒸留水を追加します。

再び、チューブを室温で5分間、2, 500rpmで激しくボルテックスします。次に、水相と有機相を完全に分離するために、サンプルを遠心分離します。下相を使い捨てガラス管に移します。

試験管に2ミリリットルのクロロホルムを追加します。次に、チューブを室温で5分間2, 500rpmで激しく渦巻いて、上相と相間綿毛と十分に混合します。2回目の遠心分離に続いて、修飾された下相を最初の下相とともに使い捨てガラス管に移します。

次に、ガラス管を窒素流の下に約60分間置き、収集した下相の有機溶媒を完全に除去します。最後に、サンプルを500マイクロリットルのメタノールまたはエタノールで再構成します。得られた混合物を0.02ミクロンのフィルターでガラスバイアルにろ過します。

次に、サンプルを摂氏マイナス20度で保存します。標準化合物の段階希釈を行い、各濃度の50マイクロリットルを別々の試験管に加えます。次に、1つ目のサンプルに標準曲線の下限の3倍以内の量、2つ目のサンプルは曲線の中心付近の量、3つ目のサンプルは標準曲線の上限付近の量を加算して、3つの品質管理サンプルを調製します。

次に、1ミリリットルのメタノール中の細胞ホモジネートを各試験管に添加し、示した方法を使用して各サンプルから総脂質画分を抽出します。まず、移動相を準備します。アセトニトリル、メタノール、および二重蒸留水を2対2対1の比率で混合して水相にします。

有機相にはイソプロパノールをガラス瓶に使用し、テフロンで裏打ちされたスクリューキャップを付けます。次に、両方の移動相をバス型ソニケーターで5分間超音波処理します。次に、ギ酸を最終濃度26.4ミリモルまで、水酸化アンモニウムを14.9ミリモルまで各移動相に添加します。

定性分析を行うには、高速液体クロマトグラフィーシステムを起動します。移動相が入ったガラス瓶にインレットチューブを入れ、HPLCラインをパージします。次に、C18 HPLCカラムをHPLCシステムにリンクします。

カラムオーブン内の温度を摂氏 50 度に保ち、水系移動相でカラムを毎分 100 マイクロリットルにコンディショニングします。実行中に、サンプルをオートサンプラーのサンプルラックに入れます。付属のテキストプロトコールの表1および表2にリストされているように、3ステージ質量分析用のトリプルクワッドおよびクワッドリニアイオントラップ質量分析システムのパラメーターを設定します。

また、対象のSM種の第1および第2のプリカーサーイオンのパラメータを、添付のテキストプロトコルでより詳細に説明されているように設定します。バッチファイルを作成し、バッチファイルを提出して、液体クロマトグラフィー、エレクトロスプレー、イオン化、タンデム質量分析により、各スフィンゴミエリン種のMS3製品イオンスペクトルのデータを取得します。液体クロマトグラフィー、エレクトロスプレー、イオン化、タンデム質量分析により、目的のスフィンゴミエリン種の三相MSプロダクトイオンスペクトルを取得します。

次に、Sphingoid長鎖塩基の正確な質量と目的のn-アシル部分におけるプロダクトイオンスペクトルの質量電荷比を比較することにより、各MSにSphingomuelinの3つのプロダクトイオンスペクトルを割り当てます。液体クロマトグラフィー、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法を用いて、添付のテキストプロトコールに記載されているように、スフィンゴミエリンを定量的に分析します。次に、データ統合用ソフトウェアを使用して多重反応モニタリングデータを処理して、各スフィンゴミエリン種の抽出イオンクロマトグラムのピーク面積のデータを取得します。

各スフィンゴミエリン種を定量し、付属のテキストプロトコルに記載されているように標準曲線を構築します。ここでは、HeLa細胞から抽出した脂質サンプル中の化学合成されたスフィンゴミエリンとスフィンゴミエリンのスペクトルを示します。注目すべきは、脱メチル化スフィンゴシルホスホリルコリンのスペクトル強度が、両方のサンプルでSMのn-アシル部分のスペクトル強度よりも大きいことです。

また、興味深いことに、スフィンゴシン-1-リン酸に対応するスペクトルは、スフィンゴミエリンのスフィンゴイド長鎖塩基の炭素結合と二重結合の数を推測するのに有用です。現在の定量法では、この方法を検証する際に検量線を構築するためのサンプルを正確に調製することが重要です。低濃度の曲線フィッティングは、1または1 over xの重み付け係数を使用した場合と比較して、重み係数が1倍xの2乗に等しい場合によって明らかに改善されました。

この技術は、生物学や産業分野の研究者が、生物学的サンプルや化粧品などの工業製品に含まれるさまざまなスフィンゴミエリン種を特徴付ける道を開きました。このビデオを見れば、生体試料中の各スフィンゴミエリン種の量と構造を正確に分析する方法を十分に理解できるはずです。吸収剤の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、適切なガラス摩耗を使用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

また、手由来の脂質の混入を防ぐためにも手袋を着用することが大切です。