Name: 同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベル スフィンゴミエリン種 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶ 液体クロマトグラフィー質量分析法を用いたスフィンゴミエリン種の定量的・定性的解析手法。HeLa細胞からの抽出とMS/MS/MS技術により、脂質生物学研究における脂質構造と量の精密分析が可能となる。

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この作業は、教育省、文化、スポーツ、科学と技術の日本 (科研費) コンゴ (#15 K 01691) に、マルチメディアモデルシミュレーション (#15 K 08625)、武 (#26461532)、省から難治性疾患プロジェクト研究補助金から研究助成金によって支えられました。健康、労働および福祉 (武 #201510032A)。我々 はエダンズ ・ グループ (www.edanzediting.com/ac) がこの原稿の下書きを編集することをありがちましょう。

使用する前に関連するすべての材料安全データ用紙 (MSDS) を参照してください。皮膚由来の SM によるサンプルの汚染を最小限にするために手袋を着用します。この議定書は 2 mM L10% 牛胎児血清 (FBS) を添加したイーグル最小必須培地で育った HeLa 細胞に適用された-グルタミン、1,000 U/L ペニシリンとストレプトマイシン 100 mg/L。
1. 脂質試料の調製
注:、テフロン ライニングのネジキャップで試験管を含むすべてのガラスは洗剤がないことが重要です。
<ol><li>ブライ ・ ダイアーの方法7を使用して細胞磨砕液からの総脂質の抽出<ol>
<li>文化を削除 (またはエアコン) 10 cm 細胞培養用ディッシュ、6 mL の氷冷 PBS で 2 回リンスからメディア。</li>
		<li>P1000 ピペットで 10 cm の培養皿に 1 mL の氷冷 PBS を追加します。セルスクレーパーで細胞を収穫し、2.0 mL シリコーン プラスチック チューブに収集します。</li>
		<li>遠心分離 (1,000 × g、5 分、4 ° C) 後に、、P1000 ピペットで上澄みを除去します。</li>
		<li>1 mL のメタノールを追加します。渦は簡単にチューブし、200 W 浴型超音波発生装置で 5 分間の超音波。 注: は、細胞ペレットは効率的に均質化されたので浴型超音波発生装置の水位を調整します。</li>
		<li>ピペットで試験管 (13 mm × 100 mm) スクリュー キャップのテフロン ライニングにメタノールで細胞ホモジネートを転送します。</li>
		<li>1 mL のメタノール、1 mL のクロロホルム、ダブル蒸留水 0.8 mL と内部標準 d18:1/(D31) 16 µmol 10/L の 50 μ L を追加: 0 各試験管に SM。</li>
		<li>室温で 5 分間精力的に試験管を渦。 メモ: この時点で単相 (クロロホルム/メタノール/水 = 1/2/0.8 (v/v/v)) が形成されます。</li>
		<li>クロロホルムの 1.0 mL の二重蒸留水 1 mL を追加します。</li>
		<li>室温で 5 分間 2,500 rpm で精力的にボルテックス チューブ。 注: この時点で、水性 (上側) の相と有機 (下側) が分かれています。</li>
		<li>遠心分離 (2,150 × g、5 分、25 ° C) 後を収集し、使い捨てのガラス管 (初期低フェーズ) に下の相を転送します。 注: は、パスツール ピペットと安全ピペット フィルターを用いた低位相を収集します。ピペットの先端を挿入下相、上部段階と、ピペットの先端内部界面の綿毛を提供する 'E' バルブの横に小さな電球を絞る、ピペットに下相を吸い上げます。</li>
		<li>上部段階と界面の綿毛と十分に混合する部屋の温度で 5 分間 2,500 rpm で精力的にテスト チューブと渦にクロロホルムの 2 mL チューブを追加します。</li>
		<li>遠心分離 (2,150 × g、5 分、25 ° C) 後を収集し、1.1.10 の手順に記載されている最初の低い段階で使い捨てのガラス管に変更された下相を転送します。</li>
		<li>窒素気流下におけるガラス管を置き、収集した低い段階で有機溶剤を完全に削除します。</li>
		<li>サンプルの再構成のためのメタノールまたはエタノール 500 μ L、0.02 μ m フィルターでろ過、-20 ° C でガラスの瓶に保存</li>
	</ol>
</li>
	<li>検量線を作成して、メソッドを検証するための試料作製<ol>
<li>0.1、0.5、1、5、10、または 50 µmol/L 標準化合物の 50 μ L を追加 (d18:1/(D9) 18:1 SM) スクリュー キャップのテフロン ライニングが試験管に。</li>
		<li>各試験管に細胞磨砕液を加えて 1 mL にメタノールを追加します。 メモ: マトリックスとしてセルを磨砕液の量は各試験によって異なります。SM 種 10 cm 培養皿の細胞由来サンプルで日常的に分析し、それぞれの試験管内細胞磨砕液の量は 10 cm 培養皿の細胞に近いはずです。</li>
		<li>手順 1.1.6-1.1.14 で説明したように総脂質分画を抽出します。</li>
		<li>手順 1.2.1-1.2.3 で記述としてメソッドを検証するための品質チェック (QC) サンプルを準備します。標準化合物の濃度の異なる 3 つの QC サンプルを準備 (d18:1/(D9) 18:1 SM): 標準曲線 (QC 低、QC L)、1 つの中心近くの下限 × 3 内 1 つ (QC 中間、QC-M)、および 1 つの上部の境界の近く、標準曲線 (QC 高、QC H)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM-ESI-MS LC/MS による分析
<ol><li>移動相の調製<ol>
<li>溶剤を混ぜる (アセトニ トリル/メタノール/ddH2O 有機相を水相とイソプロパノールの 2/2/1 (v/v/v) を =) でガラスびんスクリュー キャップのテフロン ライニングし、浴型超音波発生装置で 5 分の超音波。</li>
		<li>ギ酸 (最終濃度 26.4 ミリ モル/L) と NH4OH を追加 (14.9 ミリ モル/L) 各移動相に。</li>
	</ol></li>
	<li>LC ESI MS3 SM の質的分析<ol>
<li>高性能液体クロマトグラフィー (高性能液体クロマトグラフィー) システムをアクティブ化、移動相を含むガラス瓶にインレット チューブを入れて、高速液体クロマトグラフィーの行を削除します。C18 HPLC カラム (1.5 mm 内径 × 100 mm 長さ、粒子サイズ 3.0 μ m) を HPLC システムにリンク、カラム オーブンの温度を 50 ° C を維持、100 μ L/分のサンプルを入れ、autosampl でサンプル ラックで溶離液をカラムの条件小胞体。</li>
		<li>トリプル四重極 MS3分析興味の SM 種のイオン最初と 2 番目の前駆体と同様に表 1と表 2に記載されている四重極線形イオン トラップの質量分析システムのパラメーターを設定します。<ol>
<li>データ集録ソフトウェア アイコンをダブルクリック、[ハードウェアの構成] をダブルクリックして、' LC + QTRAP4500 + バルブ ' を選択、プロファイルをアクティブにする」をクリックします。</li>
			<li>新しいサブフォルダーを作成するには、' 新しいサブ プロジェクト ' と 'OK' をクリックします。</li>
			<li>「ファイル」タブをクリックして、'New' し '獲得方式' と 'OK' を選択します。'MS/MS/MS (MS3)' として' 質量仕様 'アイコンと 'MS' タブを選択スキャンの種類をクリックし、スキャン レート分析 (分) に 10,000 Da/s、'負' として極性と全体の時間として' 期間' として。スキャンする範囲として '開始 (Da)' と 'ストップ (Da) のm/zを設定します。対象興味の SM 種の第 1 と第 2 の前駆イオンのm/zを設定します。 注: 複数 SM 種を分析するを強調表示、'-MS3' アイコン、右クリック、「この実験をコピー」を選択しますと 1・2 前駆体のイオン SM の他の種のm/zを入れて。</li>
			<li>'MS' タブを選択し、各パラメーターを次のように設定: 'プロフィール'、0.12 (Da)、解像度 Q1 と Q3 としてステップ サイズとしてスキャン モード 'ユニット'、'明るい'、それぞれ、50 (ms)、1.5 ms としての質量範囲間の一時停止として 0 の設定時間と輝度しきい値を選択' 動的時間を埋める '、8 V、第 3 四半期の参入の障壁と励起時間 25 ms として。</li>
			<li>'MS' タブの 'パラメーターを編集] ボタンをクリックし、選択' ソース/ガス ' タブがカーテン ガス、衝突ガス、ionspray 電圧、温度、イオン ソース gas1 gas2の表 1に記載されているのパラメーターを設定します。その後、選択 '複合'] タブのパラメーターを設定デクラスタ リングの可能性、潜在的な入り口、衝突エネルギー、励起エネルギー、衝突エネルギーを表 2に示すように普及します。</li>
			<li>'統合 Valco バルブ' を強調表示、A として 'ステップ 0 の位置名' を選択し、合計の位置に 'B' を設定時間 5.0 分。また合計の位置として 'A' を設定時間 70.0 分。</li>
			<li>'LC システム' を強調表示します。'ポンプ' タブを選択し、バイナリ フロー、0.28 mL/min と 20.0 MPa 圧力限界の最大値として合計の流れとしてポンプ圧送モードを設定します。'オート' タブを選択し 200 μ L とすすぎのボリュームを設定、針の洗浄速度 35 μ L/s として、サンプリング速度 5.0 μ L/s として 52 mm ストローク、25.0 分として時間をパージ、'前に、と吸引後の 5 秒、すすぎモードとタイムをすすいでください。<ol>
<li>さらに、クーラー ユニットを有効にする、4 ° c のクーラーの温度を設定および制御バイアル針ストローク 52 ミリメートル。 'オーブン' タブを選択して、オーブンを有効にしてオーブンの温度、最高温度を 50 ° C と 85 ° C、それぞれ設定。</li>
				<li>'コント ローラー' タブを選択し、チェック ボックスをオン '電源を入れます'。「時間プログラム」タブを選択し、、溶媒のグラデーションを次のように設定: 溶剤 A 5 分 100/0 の割合で B プログラム 80/20 に線形変更/35/65 の 4 分以上 50 分以上と 25/75 以上 1 分後、25/75, 10 分間し、線形を 100/0 でそれらを保持する 4 分以上。メソッドを保存します。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>バッチ ファイルを作成します。<ol>
<li>'ビルド取得バッチ' アイコンをダブルクリックして、「セットを追加」をクリックして「サンプルを追加」、新しいサンプル数を設定し、、'OK' をクリックしますします。</li>
			<li>[メソッド エディター] ボタンをクリックし、使用する方法を選択します。複数のメソッドを 1 つのバッチ ファイルで使用する場合複数のメソッドに使用」のボックスをチェックし、各サンプルの取得メソッドを選択します。'サンプル名' の名前を変更 'バイアル位置' の適切な数を設定し、注入量の量を入れてください。その後、バッチ ファイルを保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>LC ESI MS3分析によって MS3製品の関心の SM 種のイオン スペクトルを得します。<ol>
<li>バッチ ファイルに 'Submit' タブを選択、分析されるサンプルの行を強調表示 'Submit' ボタンをクリックします。</li>
			<li>クリックして、' ビュー Quene' 'Equilibrate' アイコンを選択手法を使用する、1 分に時間を設定し、'OK' をクリックします。</li>
			<li>対応するアイコンをクリックして 'チューニング予備楽器' を非アクティブ化します。その後、' 開始サンプル ' アイコンをクリックしてバッチ シーケンスを実行します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>イオン スペクトル製品の比率 (m/z) を充電する量と、スフィンゴイドの正確な量を比較することにより各 MS3 SM のプロダクト イオン スペクトルを割り当てる LCB とN-興味のアシル部位。数炭素の二重結合、スフィンゴイド LCB とNを決定する-対応する製品イオンによるとアシル部位。<ol>
<li>適切なサブ プロジェクトのフォルダーが選択されていることを確認、' データ ファイルを開く」のアイコンをダブルクリックし、分析するサンプルを選択します。各ターゲット SM 種のクロマト グラムのピークをドラッグして、ダブルクリックをクリックします。ドラッグした領域内で得られた MS3のプロダクト イオンのスペクトルが表示されます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ESI MS/LCMS による SM の定量的解析<ol>
<li>2.1 と 2.2.1 の手順の説明に従って、移動相と HPLC カラムを設定します。</li>
		<li>トリプル四重極四重極線形イオン トラップ質量分析システム監視 (MRM) 分析表 1と表 2に記載されている複数の反作用のためのパラメーターを設定します。<ol>
<li>2.2.2.1 と 2.2.2.2 の手順で説明するように、手順を行います。</li>
			<li>「ファイル」タブをクリックして、'New' し '獲得方式' と 'OK' を選択します。「MRM'、'正' として極性として「固まり Spec' アイコンと 'MS' タブを選択スキャン種類をクリックします。分析する全体の時間として '期間' を設定します。それぞれ、『 Q1 ミサ (Da) 』 と 『 第 3 四半期ミサ (Da) 』 SM 種、興味の対象の [M + H]+のm/zと 184 を設定してください。10 ms とターゲット SM 種の名前として ' ID' '時間' を設定します。</li>
			<li>' MS' タブを選択し、各パラメーターを次のように設定: 解像度第 1 四半期の両方の 'ユニット'、0、輝度しきい値として Q3 0 (ms) として時間の設定と 5 ms としての質量範囲間で一時停止します。</li>
			<li>'MS' タブの 'パラメーターを編集] ボタンをクリックし、カーテン ガス、衝突ガス、ionspray 電圧、温度、イオン ソース gas1 gas2の表 1に記載されているパラメーターを置く' ソース/ガス ' タブを選択します。電位、入り口の可能性、衝突エネルギーと衝突セル出口電位表 2に記載されている・ デクラスタ リングのパラメーターを置く '複合' タブを選択します。</li>
			<li>2.2.2.6 の手順で説明するようにバルブを設定します。</li>
			<li>2.2.2.7 の手順で説明するように、LC 条件を設定します。メソッドを保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>2.2.3 の手順で説明するよう、バッチ ファイルを作成します。</li>
		<li>ESI MS/LCMS 分析 2.2.4 の手順で説明するように各 SM 種の MRM データを取得します。</li>
		<li>データ統合のためのソフトウェアを使用して MRM データを処理し、各 SM 種抽出したイオン ・ クロマト グラムのピーク面積のデータを取得します。<ol>
<li>定量分析におけるデータ統合ソフトウェア アイコンをダブルクリック、[編集] タブをクリックし、ユーザー統合のデフォルト値を選択します。1.0 ポイントとしてガウス滑らかな幅を設定し、「OK」をクリックします。[編集] タブをクリックし、「新しい結果表」を選択します。統合される、矢印ボタンをクリックして、'Next' をクリックするサンプルを選択します。'新しいメソッドの作成' を選択、メソッドの名前を設定し、「次へ」をクリックして。'Next' をクリックし、d18:1/(D31) 16 のボックスをチェック: 0 ですので、SM 'Next' をクリックして、[完了] をクリックします。</li>
			<li>'ピークのレビューが表示されます' をクリックし、クロマト グラム ピークが適切に認識されることを確認します。注意してください d18:1/(D31) 16 の保持時間: SM は通常小さいによって 0 〜 34 1 SM のものと比較して 0.3 分 (通常は d18:1 の/16:0 SM で構成されています)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>D18:1/(D31) 16 各 SM 種のピークの比率に従って各 SM 種を定量化: 0 SM 内部標準。<ol>
<li>「ファイル」タブをクリックして、[エクスポート] を選択、「結果表」を選択、'MultiQuant'、列 'すべて列をエクスポート' としてフォーマットを確認、'それらの明示的に隠された以外のすべての行をエクスポート' と、'OK' をクリック行。</li>
			<li>ソフトウェアを Excel でエクスポートされたファイルを開きます。正規化は地域によるターゲット SM 種地域 (d18:1/(D31) 16:0 SM)。ターゲットに注入されたサンプル SM 種の量を計算する注入されたサンプルでは理論量を乗算します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>標準曲線を構築します。<ol>
<li>D18:1/(D9) 18 の MRM データを取得: 1 SM と d18:1/(D31) 16:0 ステップ 2.3.1-2.3.4 に記載されている LC-ESI-タンデム質量分析法による標準曲線を構築するためのサンプルの SM。</li>
		<li>D18:1/(D9) 18 のピーク面積のデータを取得: 1 SM と d18:1/(D31) 16:0 SM 2.3.5 の手順で説明されているようです。</li>
		<li>D18:1/(D9) 18 の量を計算: 1 に記載されている手順 2.3.6 として注入されたサンプルの SM。</li>
		<li>/(D9) 18 の名目額と計算量 d18:1 x 軸と y 軸を設定することにより、近似曲線を構築: 1 SM し、近似曲線の数式を取得します。</li>
	</ol></li>
	<li>Excel のソフトウェアを使用して量的な方法の検証<ol>
<li>D18:1/(D9) 18 の量を定量化手法の検証: 1 SM と d18:1/(D31) 16:0 QC の SM サンプル各 QC を分析することによって 1 日に少なくとも 3 回サンプルし、ステップ 2.3.1-2.3.4 で説明したように少なくとも 3 日間を繰り返します。</li>
		<li>D18:1/(D9) 18 の量を計算してピーク面積データを取得: 1 に記載されているステップ 2.3.5 と 2.3.6 として注入されたサンプルの SM。</li>
		<li>校正曲線から得られる、d18:1/(D9) 18 の量を計算: 1 注入されたサンプルの SM。</li>
		<li>精度の評価<ol>
<li>平均と d18:1/(D9) 18 の量の標準偏差を計算: 1 SM ステップ 2.5.3 内日のデータセットで得られた、間日の Excel ソフトウェアを使用しています。</li>
			<li>2.5.4.1 のステップで得られる平均値は標準偏差で割った値、% として表されます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>精度の評価<ol>
<li>各データの正確性を次のように計算します。 [(計算量 2.5.3 の手順で取得します。)/(名目額) - 1] × 100(%)</li>
			<li>日中間の日のデータセットの精度の絶対値の平均を計算します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は、利害の対立があるないことを宣言します。

現在の質的な方法で我々 は MS3 SPC とNのプロダクト イオンを得られる-アシル部位。SPC とNの両方を正しく割り当てることが重要です-アシル部位。このため、他ホスホリルコリン含む分子は MS3製品イオンとしても検出することができますが注意する必要があります。ジアシル ホスファチジルコリン (PC) およびプラズマローゲン PC が哺乳類セルの豊富に存在し、疎水性、SM のような。したがって、前記ジアシル PC とプラズマローゲン PC 同位体 (通常13C) と理論的に検出できます同時に SM で。我々 の実験では、プラズマローゲン PC の MS3製品イオン同時に SM 分析で観察されました。SPC のスペクトル強度が SM Nのそれよりも大きいことを知っている SM の MS3プロダクト イオンを正しく選択すると便利です-アシル部位 (図 1AとB</s...

スフィンゴミエリン (SM) は、哺乳類細胞における一般的なスフィンゴ脂質です。SM は合成の1細胞内と他のスフィンゴ脂質の前駆体として現在セルの人身売買と皮膚のバリア恒常性は、それぞれ2、スフィンゴシン-1-リン酸と、セラミド、免疫の重要な役割があるよう 3。したがって、SM 代謝の正確な分析は、スフィンゴ脂質の生理的および病態的役割を解明するため重要です。
SM は、セラミドとさらに、スフィンゴシンとNで構成されているセラミドの 1-ヒドロキシ グループにリンクされているホスホリルコリンから成る-アシル部位。スフィンゴシンとNの両方で炭素との二重結合の数の様々 な-アシル部位数・ セラミド (SM) 種の結果します。LC-MS/MS の最近の進歩は、SM4、5の量的・質的分析を可能にしました。定性分析の炭素数と二重結合のスフィンゴイド LCB の SM された LCB のプロダクト イオン スペクトルを割り当てることによって識別されます。しかし、 Nの構造情報-アシル基がその対応するプロダクト イオンは報告されていないので直接得られず、したがってN-アシル鎖前駆イオン間の差分解析によって推定したと両方の正と負のイオン モード4,5LCB に対応する製品のイオン。本報告では、LCB のNプロダクト イオンを検出する手法を提案する-トリプル四重極および正確な構造を容易に四重極線形イオン トラップの質量分析を使用して MS3モードで同時にアシル基各 SM 種6の思惑。
生体試料中のマトリックスによって引き起こされるイオン抑制 (または拡張) 効果, LC ESI 質量分析で定量の正確さを妨げる、したがって、同じマトリックスへの関心のすべての分析のための検量線を作成することが望ましいです。生体試料。ただし、この戦略は実現可能な包括的な分析を中心に、生体試料中のすべての SM 種を準備するはほとんど不可能です。したがって、校正曲線を組み立てるし、SM の代表種生物学的試料中のスパイクを使用して量的な範囲を決定するは実用的です。校正曲線を構築する 2 つの同位体標識 SM 種を使いました。1 つは、内部標準と標準物質の他に使われました。生体試料中のスパイクし、較正曲線と6の定量範囲は正常に取得標準化合物として同位体標識 SM 種の少量を検出しました。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100mm組織培養皿</td><td>イワキ</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>イワキ</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>シリコン処理 2.0mLチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>試験管</td><td>イワキ</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>テフロンライニングスクリューキャップ</td><td>イワキ</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てガラス管</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &micro;m 内径1.5mm×内径100mm</td><td>資生堂</td><td>92223</td><td>カートリッジホルダーにガードカートリッジを差し込み、C18カラムに連結</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10mm ガードカートリッジ</td><td>資生堂</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>カートリッジホルダー</td><td>資生堂</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>和光</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール(イソプロピルアルコール)</td><td>和光</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>和光</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>和光</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% アンモニア水</td><td>和光</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター(バスタイプ)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>ガラス試験管用ボルテックスミキサー</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1.4mL ガラスバイアル</td><td>トムシック</td><td>500-1982</td><td>サンプルは、スクリューキャップと8mmセプタムで密封された1.4mLガラスバイアルに-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>8 mmセプタム</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>サンプルを分析すると、スクリューキャップはスリットセプタム付きスクリューキャップに交換されます</td></tr><tr><td>1.4mmガラスバイアル用スクリューキャップ</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>スリットセプタム付きスクリューキャップ</td><td>島津製作所GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 &micro;mフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>トリプル四重極・四重極リニアイオントラップ質量分析計</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>プロダクトイオンスペクトルのデータ取得・解析用ソフトウェア</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>定量分析用ソフトウェア</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>HPLCシステム</td><td>島津製作所</td><td>ネクセラ</td><td></td></tr><tr><td>ガラス瓶</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 スフィンゴミエリン</td><td>Avanti極性脂質</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>スフィンゴシルホスホリルコリン</td><td>メルク</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td></td><td></td>26140079</tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>ペニシリンとストレプトマイシン</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr>イー<tr><td>グル's minimum essential medium</td><td>シグマ</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベル スフィンゴミエリン種

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

液体クロマトグラフィー-エレクトロ スプレー イオン化タンデム質量分析法 (ESI-MS/LC-MS) による定量的スフィンゴミエリン (SM) の質的分析の手法を提案します。SM は、それぞれ親水性と疎水性のコンポーネントとして、ホスホリルコリンとセラミドで構成される一般的なスフィンゴ脂質です。SM 種数はスフィンゴイド長いチェーンの基本 (LCB) の変化のための哺乳類の細胞内に存在し、 N-セラミドのアシル部位。本報告では、炭素と、LCB とNの二重結合の数を推定する方法を示す-アシル基が MS ・ MS/MS (MS3) 実験で、対応する製品のイオンに基づきます。加えて、我々 は SM の種を使用して 2 つ安定同位体ラベル付き SM、SM の定量に使用範囲を決定するを容易に定量分析法を提示します。本手法は、様々 な生体試料や化粧品などの工業製品で SM 種を特徴付けること役に立つでしょう。

化学的に合成した d18:1/24:0 SM (図 1A)、d18:1 LC ESI MS3 [M + 尿素]-を採用し、[M CH3] 24:0 SM HeLa 細胞 (図 1B) から抽出した脂質サンプルで行ったところ/-最初と 2 番目の前駆イオンとしてそれぞれ。脱スフィンゴシルフォスフォリルコリン (SPC) (449m/z ) のスペクトル強度が SM Nのより大きいことに注意してください-アシル基 (378m/z )。さらに、[M-コリン-CH3 (スフィンゴシン-1-リン酸)] に対応するスペクトル-は SM の LCB を割り当てると便利ですも。また脱-SPC (449m/z</e...

ここでは、提案する定量化および複数反応モニタリングを用いた各スフィンゴミエリン種を対象に、プロトコルと MS、MS、MS モード、それぞれ。

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

この手順の全体的な目標は、生体サンプル中の各スフィンゴミエリン種の量と構造を正確に分析することです。この方法は、脂質生物学と脂質に関連する脂質分野の重要な質問に答えるのに役立ちますこの技術の主な利点は、クロマトグラフィー質量分析システムによって生物学的サンプル中のさまざまなスフィンゴミエリン種を特徴付けることができることです。まず、HeLa細胞を含む10cmの組織培養皿から培地を取り出し、6ミリリットルの氷冷PBSで細胞を2回すすぎます。次に、10cmの組織培養皿に氷冷したPBSを1ミリリットル加え、細胞スクレーパーを使用して細胞を回収します。皿の表面から取り出したら、細胞を2ミリリットルのシリコン処理プラスチックチューブに移します。遠心分離後、上清を除去し、各細胞ペレットに1ミリリットルのメタノールを加えます。次に、チューブを短時間ボルテックスします。次に、サンプルをバス型超音波発生器に入れ、200ワットで5分間超音波処理します。終了したら、全細胞ホモジネートをテフロンライニングスクリューキャップを備えた試験管に移します。次に、1ミリリットルのメタノール、1ミリリットルのクロロホルム、0.8ミリリットルの二重蒸留水、50マイクロリットルの内部標準液10マイクロリットルを各試験管に加えます。チューブをキャップし、室温で5分間、2, 500rpmで激しく渦巻きます。次に、各チューブにさらに1ミリリットルのクロロホルムと1ミリリットルの二重蒸留水を追加します。再び、チューブを室温で5分間、2, 500rpmで激しくボルテックスします。次に、水相と有機相を完全に分離するために、サンプルを遠心分離します。下相を使い捨てガラス管に移します。試験管に2ミリリットルのクロロホルムを追加します。次に、チューブを室温で5分間2, 500rpmで激しく渦巻いて、上相と相間綿毛と十分に混合します。2回目の遠心分離に続いて、修飾された下相を最初の下相とともに使い捨てガラス管に移します。次に、ガラス管を窒素流の下に約60分間置き、収集した下相の有機溶媒を完全に除去します。最後に、サンプルを500マイクロリットルのメタノールまたはエタノールで再構成します。得られた混合物を0.02ミクロンのフィルターでガラスバイアルにろ過します。次に、サンプルを摂氏マイナス20度で保存します。標準化合物の段階希釈を行い、各濃度の50マイクロリットルを別々の試験管に加えます。次に、1つ目のサンプルに標準曲線の下限の3倍以内の量、2つ目のサンプルは曲線の中心付近の量、3つ目のサンプルは標準曲線の上限付近の量を加算して、3つの品質管理サンプルを調製します。次に、1ミリリットルのメタノール中の細胞ホモジネートを各試験管に添加し、示した方法を使用して各サンプルから総脂質画分を抽出します。まず、移動相を準備します。アセトニトリル、メタノール、および二重蒸留水を2対2対1の比率で混合して水相にします。有機相にはイソプロパノールをガラス瓶に使用し、テフロンで裏打ちされたスクリューキャップを付けます。次に、両方の移動相をバス型ソニケーターで5分間超音波処理します。次に、ギ酸を最終濃度26.4ミリモルまで、水酸化アンモニウムを14.9ミリモルまで各移動相に添加します。定性分析を行うには、高速液体クロマトグラフィーシステムを起動します。移動相が入ったガラス瓶にインレットチューブを入れ、HPLCラインをパージします。次に、C18 HPLCカラムをHPLCシステムにリンクします。カラムオーブン内の温度を摂氏 50 度に保ち、水系移動相でカラムを毎分 100 マイクロリットルにコンディショニングします。実行中に、サンプルをオートサンプラーのサンプルラックに入れます。付属のテキストプロトコールの表1および表2にリストされているように、3ステージ質量分析用のトリプルクワッドおよびクワッドリニアイオントラップ質量分析システムのパラメーターを設定します。また、対象のSM種の第1および第2のプリカーサーイオンのパラメータを、添付のテキストプロトコルでより詳細に説明されているように設定します。バッチファイルを作成し、バッチファイルを提出して、液体クロマトグラフィー、エレクトロスプレー、イオン化、タンデム質量分析により、各スフィンゴミエリン種のMS3製品イオンスペクトルのデータを取得します。液体クロマトグラフィー、エレクトロスプレー、イオン化、タンデム質量分析により、目的のスフィンゴミエリン種の三相MSプロダクトイオンスペクトルを取得します。次に、Sphingoid長鎖塩基の正確な質量と目的のn-アシル部分におけるプロダクトイオンスペクトルの質量電荷比を比較することにより、各MSにSphingomuelinの3つのプロダクトイオンスペクトルを割り当てます。液体クロマトグラフィー、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法を用いて、添付のテキストプロトコールに記載されているように、スフィンゴミエリンを定量的に分析します。次に、データ統合用ソフトウェアを使用して多重反応モニタリングデータを処理して、各スフィンゴミエリン種の抽出イオンクロマトグラムのピーク面積のデータを取得します。各スフィンゴミエリン種を定量し、付属のテキストプロトコルに記載されているように標準曲線を構築します。ここでは、HeLa細胞から抽出した脂質サンプル中の化学合成されたスフィンゴミエリンとスフィンゴミエリンのスペクトルを示します。注目すべきは、脱メチル化スフィンゴシルホスホリルコリンのスペクトル強度が、両方のサンプルでSMのn-アシル部分のスペクトル強度よりも大きいことです。また、興味深いことに、スフィンゴシン-1-リン酸に対応するスペクトルは、スフィンゴミエリンのスフィンゴイド長鎖塩基の炭素結合と二重結合の数を推測するのに有用です。現在の定量法では、この方法を検証する際に検量線を構築するためのサンプルを正確に調製することが重要です。低濃度の曲線フィッティングは、1または1 over xの重み付け係数を使用した場合と比較して、重み係数が1倍xの2乗に等しい場合によって明らかに改善されました。この技術は、生物学や産業分野の研究者が、生物学的サンプルや化粧品などの工業製品に含まれるさまざまなスフィンゴミエリン種を特徴付ける道を開きました。このビデオを見れば、生体試料中の各スフィンゴミエリン種の量と構造を正確に分析する方法を十分に理解できるはずです。吸収剤の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、適切なガラス摩耗を使用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。また、手由来の脂質の混入を防ぐためにも手袋を着用することが大切です。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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スフィンゴ脂質は、ヒトの疾患において十分に確立された役割を有する生理活性代謝物である。質量分析で組織の変化を特徴づけることで、疾患の病因における役割を明らかにしたり、治療標的を特定したりすることができます。しかし、バイオリポジトリでの凍結保存に使用されるOCT化合物は、質量分析を妨害します。OCTに包埋したヒト組織中のスフィンゴ脂質をLC-ESI-MS/MSで解析する方法を概説する。...

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安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡

学ぶ 液体クロマトグラフィー質量分析法を用いたスフィンゴミエリン種の定量的・定性的解析手法。HeLa細胞からの抽出とMS/MS/MS技術により、脂質生物学研究における脂質構造と量の精密分析が可能となる。

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベルスフィンゴミエリン種

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