低分子殺線虫剤スクリーニングアッセイ:Ditylenchus dipsaciに対する潜在的な殺線虫剤をスクリーニングするための中スループット法

Ditylenchus dipsaci などの植物寄生線虫は微細なワームです。生きたワームは筋肉の収縮によって正弦波の動きを示し、その運動性は培養条件における健康の重要な決定要因です。

殺線虫剤(化学毒物)への曝露は、主要な生物学的プロセスを妨害し、これらの培養線虫の移動性に影響を与え、死に至る可能性があります。

低分子殺線虫剤をスクリーニングするには、蒸留水を含むマルチウェルプレートを使用します。クリーンなピン留めツールを使用して、潜在的な低分子殺線虫剤をケミカルストックプレートからアッセイプレートに移し、一定量の分子を各ウェルに移します。

プレートの各ウェルに同数の線虫を分注します。線虫の生存と移動をサポートするために、湿った状態を維持しながらプレートを密閉します。ワームが沈降するのを防ぐために、プレートを軽度の攪拌でインキュベートします。

インキュベーション中、さまざまな有毒な小分子がワームに作用して殺しますが、無毒の小分子は影響を与えません。解剖顕微鏡でプレートを観察して、非運動性ワーム集団を持つウェルを特定します。

アッセイプレートに水酸化ナトリウム溶液(エンドポイント化学刺激剤)を補充します。これにより、休んでいるワームの動きが引き起こされ、死んだワームと区別されます。

一部の井戸で水酸化ナトリウム処理後の非運動性ワームの存在は、殺線虫剤としての対応する小分子の有効性を確認します。

アッセイプレートを調製するには、オートクレーブ滅菌した蒸留水を滅菌トラフに注ぎ、トラフから40マイクロリットルの蒸留水をマルチチャンネルピペットで平底の96ウェルプレートの各ウェルに分注します。96ウェルのケミカルストックプレートからケミカルプレートに3回ピン留めして、アッセイプレートにケミカルを追加します。次に、ピンをアッセイプレートに10回移します。洗浄液の前の紙に吸い取ります。

コレクションからの線虫の数を数えるには、まずコレクションを再懸濁し、次に、低保持チップを使用して5マイクロリットルの溶液をスライドにピペットで移します。解剖顕微鏡を使用して5マイクロリットルの線虫の数を数えます。次に、滅菌蒸留水を使用して濃度をマイクロリットルあたり2匹に調整します。

次に、マルチチャンネルピペットとトラフを使用して、96ウェルプレートの各ウェルに10マイクロリットルのサンプルを追加します。プレートを湿らせたペーパータオルで包み、箱に入れます。次に、湿らせたペーパータオルを追加してプレートを安定させ、動きを最小限に抑え、200 rpmに設定された摂氏20度の振とうインキュベーターで粘着パッドに貼り付けます。

5日目に解剖顕微鏡でプレートを観察します。DMSO溶媒コントロールおよび薬物処理ウェル内の可動性および総D.dipsaci の数を数えます。

ワームが動かない場合は、2マイクロリットルの1モル水酸化ナトリウムを最終濃度40ミリモルのウェルに加えて、動きを刺激します。移動性ワームの割合を計算します。D. dipsaci スクリーンでは、再現性を持って 0% の移動性ワームを産出したウェルは、強力なヒットとして分類されます。