ウイルスプラークアッセイ:ウイルス感染細胞の単層に形成されたプラークの定量化により感染性単純ヘルペスウイルスを測定する技術

まず、エンベロープ感染性ウイルスである単純ヘルペスウイルスの連続希釈液を緩衝液で調製します。

ウイルス感受性上皮細胞培養の単層を含むマルチウェルプレートを入手します。特定の量の培地を希釈したウイルス懸濁液に置き換え、均一な単層被覆を確保します。ウイルスを細胞表面に吸着させます。

着されていないウイルスをすべて除去します。細胞単層をメチルセルロース含有培地で覆い、半固体オーバーレイを形成します。

インキュベーションすると、ウイルスエンベロープと細胞膜が融合し、二本鎖ゲノムを囲むウイルスヌクレオカプシドが細胞質に放出されます。さらに、ウイルスゲノムは細胞核に放出されます。

ウイルスゲノムは、宿主の細胞機構とビリオンタンパク質を使用して、初期遺伝子の発現を調節する即時の初期ウイルスタンパク質を発現します。初期のウイルス蛋白質はウイルスDNA複製を仲介する

次に、後期ウイルス遺伝子は構造タンパク質を発現し、ウイルスゲノムとともに集合して子孫ビリオン粒子を生成します。ウイルスに感染した細胞は溶解し、ビリオンを放出します。

メチルセルロースはウイルスの移動を制限し、ビリオンが隣接する細胞にのみ感染し、その後溶解し、単層に穴が開きます。

インキュベーション後、メチルセルロースオーバーレイを除去します。エタノールクリスタルバイオレット溶液を加えます。エタノールは細胞を固定してウイルスを不活性化し、クリスタルバイオレットは細胞を染色します。その結果、紫色の細胞単層に明確な溶解ゾーンまたはプラークが現れます。

各ウイルス希釈で各ウェルのプラークをカウントして、感染性ウイルスの力価または濃度を決定します。

ピペットを使用して、1つまたは2つのウェルから細胞培養培地を取り出します。慎重に、希釈したウイルスサンプルを細胞の各単層に、各ウェルの側面から滴ごとに添加します。

プレート全体がプラークされるウイルスサンプルで満たされるまで、1つまたは2つのウェルごとにこのプロセスを繰り返します。プレート全体を手でそっと揺

次に、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートして、ウイルスを吸着させます。10分ごとに、プレートをインキュベーターから取り出し、もう一度軽く振って各ウェル全体にウイルスをより均一に広げてから、インキュベーターに戻します。

未吸収の接種物を誤って計数する可能性を減らすために、1,000マイクロリットルのピペットチップを使用してウイルスサンプルをウェルから取り出し、サンプルを廃ビーカーに捨てます。

2.5ミリリットルのメチルセルロースオーバーレイをプレートに置き、インキュベーターに戻します。廃棄物ビーカーをバイオセーフティキャビネットから取り出す前に、通常、漂白剤、ヨードホア、または同様の殺ウイルス剤を加えて

2日間のインキュベーション後、ピペットを使用して一度に1つまたは2つのウェルからメチルセルロースオーバーレイを取り除き、廃ビーカーに入れます。約2ミリリットルの1%クリスタルバイオレットと50%エタノールを各ウェルに加えます。染色で満たされたすべてのウェルでプレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。

この時点で、前に示したように、廃ビーカーを消毒します。流出がきれいになるまで、プレートを水道水で

各希釈シリーズでプラークの数に約10倍の差があることを確認します。