Name: モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学ぶモデルヘルペスウイルスγHV68の溶菌レプリケーションにおける宿主シグナル伝達分子Mavsの役割。遺伝子改変マウスと胚芽線維芽細胞を用いて、ウイルス-宿主相互作用を解析する方法です。

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著者は、博士はジェームズ（Zhijian）に感謝したいと思いますMAVSを含む必須の試薬 ​​、提供するためのチェン（UTの南西、分子生物学） - / -マウスでは、博士漣日を（カリフォルニア大学ロサンゼルス校、薬理学および分子医学）この研究のためにγHV68の細菌人工染色体を提供するため。

1。 γHV68によるマウス感染<ol><li> 6〜8週齢、性別をマッチさせた同腹マウス（8〜12匹/群）ウイルス感染のために使用されます。マウスは出荷後4日間フル（96時間）の上に順応することができます。 </li><li>ウイルスを使用してプロトコルの手順は標準BSL2予防措置を用いてバイオセーフティレベル2（BSL2）のキャビネットで行うべきである。 </li><li>ただの実験の前に、マウスあたりの滅菌PBS30μlのγHV68のウイルス懸濁液（40〜1×10 5プラーク形成単位[PFU]）を準備します。氷の上でウイルス懸濁液を保管してください。 </li><li>マウスの鎮静をケタミン/キシラジン溶液（1.5 mgのケタミンおよび0.15 mg xylazine/20 g体重、100μL/マウス）を準備します。マウスはつま先のピンチを行うことにより、鎮静されていることを確認します。 </li><li> 1.5mgのケタミンおよび腹腔内注射で20 mgの体重当たり0.15ミリグラムのキシラジン（100μL/マウス）と落ち着いたマウス。 </li><li>滴下には、鼻腔内にウイルス懸濁液（30μL/マウス）を提供鎮静マウスの一方の鼻孔にファッション、。 </li><li> 5用に片側にマウスを置き - 10分肺にウイルスの気道送達を容易にする。 </li><li>背面ケージとモニター、マウスで場所マウス、彼らが完全に鎮静状態から回復したまで。 </li><li>各種日間感染後に、肺の深い意識の死/損失を確保した後にCO 2窒息や収穫によってマウスを生け贄に捧げる。 1.0mmのジルコニア/シリカビーズを500μlを含む滅菌1.5ミリリットルスクリューキャップチューブに場所が肺。氷の上にチューブを保管してください。ストアサンプル-80°Cでの同じ日に、次のステップに進んでいない場合。脾臓または肝臓組織は、実験の時間枠に応じてウイルスの待ち時間の分析のために、この時点で収集することができます。 </li><li>チューブに冷たい無血清DMEM 1 mlを加え、ビーズ鼓動を30秒で肺をホモジナイズする。少なくとも1分間氷上でチューブを冷やす。一度、このプロセスを繰り返します。 </li><li>遠心分離肺は1分間、4℃で16000 rcfでライセートとsupernを使用NIH3T3またはBHK21単層（詳細については第5節を参照）を使用してプラークアッセイによりウイルス力価を決定するatant。 </li></ol> 2。マウス胚性線維芽細胞におけるγHV68多段階増殖速度を決定<ol><li>野生型マウス胚線維芽細胞（MEF）とめっきセルの前にサブコンフルエント（約80％）密度に対する宿主遺伝子を欠損したものを栽培しています。 </li><li>感染前日に低multipilicityオブ感染度（MOI）のためのよく10,000細胞/ 24ウェルプレートにMEFを分割します。実験は、通常、0.001の間に三重にし、MOIで行われている - 0.05は、通常使用されています。 </li><li>ウイルスの所望量（ウェル当たり0.5ミリリットル）を含むγHV68懸濁液を調製。 </li><li>培地を除去し、ウェルあたりγHV68懸濁液0.5mlでMEFをカバーしています。 </li><li>組織培養インキュベーター、岩30分ごとにプレートをインキュベートし、インキュベーションは2時間進行させる。 </li><li>ウイルス懸濁液を取り出して、0.5ミリリットル新鮮cを使用してセルをカバーomplete DMEM培地は8％ウシ胎児血清を含む。 </li><li>各種日間感染後に、滅菌1.5 mlの遠心チューブに培地と細胞を採取。直ちに-80℃でチューブを凍結℃に</li><li> -80℃で凍結させたMEFからリリースγHV68℃、37で解凍℃の水浴とボルテックス。凍結融解の3サイクルは通常のサンプルに適用されます。 </li><li> NIH3T3またはBHK21単層（詳細については第5節を参照）を使用してプラークアッセイによりウイルス力価を決定します。 </li><li>ウイルス力価を読み、MEFの上γHV68多段階成長曲線をプロットします。 </li></ol> 3。マウス胚性線維芽細胞におけるγHV68溶菌複製の分子解剖<ol><li>セクション2の2.6〜ステップ2.1で説明したようにウイルス感染を行います。 </li><li>各種日間感染後に、上清を捨てる。冷PBSおよびトリプシン処理細胞と細胞を洗浄します。 1分間、室温で1,000 rcfで遠心分離により細胞をペレット化。上清を捨て、-80℃で保存細胞℃、 </li><li>以前に公開された方法5,6に従って全DNA（ホストおよびウイルスゲノム）、全RNAを抽出します。 </li><li>全DNAなどのRTA（ORF50）、ORF57とORF60としてウイルス溶解転写産物に特異的なプライマーを用いたリアルタイムPCRを実行します。ホストハウスキーピング遺伝子（例えば、β-アクチン）を参考にし、細胞内γHV68ゲノムの相対量を決定します。 </li><li>ゲノムDNAのコンタミを除去するには、RNaseフリーのDNaseを用いた治療は、トータルRNAおよびオリゴ（dT）11-19プライマーとcDNA調製のために重要である。 RNaseフリーDNaseおよびRT-PCR法を用いた治療を含む、RNA抽出の詳細については5を参照してください。ホストハウスキーピング遺伝子のそれを参考にウイルス転写物の相対量を決定するために、上記のように、cDNAおよびプライマーを用いたリアルタイムPCRを実行します。 </li></ol> 4。細菌人工染色体を用いて組換えγHV68を生成変性アルコール常飲者ここで説明するdは宿主ウイルス相互作用に関与しているγHV68遺伝子に変異を導入するために使用されます。 <ol><li> PCRにより中央領域に所望の変異を運ぶ野生型配列または配列のDNA断片（約1.5kb）を準備します。 </li><li>特にMIDIスケールの精製（OriGene）により、目的の遺伝子の遺伝子を不活性化する変異部位の周りトランスポゾン挿入7を含む細菌人工染色体（BAC）を準備します。 4で保存してBAC DNA℃（BAC DNAの融解/凍結を避ける）。 </li><li>トランスフェクトしたBAC DNA、PCR産物は、リポフェクトアミン2000（Invitrogen）を用いて、γHV68溶菌複製に対して非常に寛容である細胞（例えば、NIH3T3またはBHK21）に興味のある遺伝子の所望の突然変異を含む。 </li><li>細胞変性効果（CPE）が単層で表示されるまで、セルの分割をしてください。ウイルスを含む上清を回収し、必要に応じて、NIH3T3またはBHK21細胞にウイルスを増幅する。 </li><li>とNIH3T3細胞に感染1800 rpmで遠心分離した組換えウイルスは、30℃で30分間。 </li><li>収穫γHV68感染NIH3T3細胞とヒルトのプロトコルを使用して8,9環状ウイルスゲノムを準備します。 </li><li>菅耐性遺伝子がトランスポゾンのときにクロラムフェニコール（Cm）への抵抗であるコロニーのためのエレクトロポレーションと画面によって電気MAX DH10Bコンピテント細胞（Invitrogen）を変換しますが、カナマイシンに対する感受性（菅）（Cm耐性遺伝子は、BACのバックボーンになっている挿入）。 </li><li> chlorophenicolを含む培地でのCM、R、S菅コロニーを成長させ、ミニまたはMIDIスケールの精製（OriGene）でのBAC DNAを調製する。 </li><li>変異部位の隣接領域、および配列に特異的なプライマーを用い、PCR法により標的遺伝子中の所望の変異を確認します。 </li><li>選択された制限酵素およびパルスフィールド·ゲル電気泳動を用いた消化によって、BACには染色体再配列を確認していません。 </li><li>リポフェクタミンとNIH 3T3またはBHK21細胞への組換えBACをトランスフェクション組換えγHV68を準備するために2000（Invitrogen）を。 </li><li> CPEは単層で表示されるまで細胞を継代してください。ウイルスを含む上清を収集し、NIH3T3またはBHK21細胞で組換えγHV68を増幅する。 </li><li>組換えウイルスの力価を測定し、セクション1および2に記載されたウイルスの増殖特性をex vivoおよび in vivo での特徴となっています 。 </li></ol> 5。プラークアッセイによりウイルス力価を決定<ol><li>めっきセルの前にサブコンフルエント（約80％）の密度にNIH3T3細胞を成長させる。 </li><li>感染前日によく20,000細胞/ 24ウェルプレートに分割したNIH3T3。 </li><li> 8パーセント新生仔ウシ血清（NCS）を含むDMEM培地で10倍に直列に希釈ウイルス上清を準備します。 </li><li>培地を除去し、γHV68懸濁液0.5mlをNIH3T3細胞をカバーしています。 </li><li>組織培養インキュベーター、岩の板ごとに30分間インキュベートし、インキュベーションを続行できるよう2時間。 </li><li>ウイルス懸濁液を取り出して、2パーセントNCSおよび0.75％メチルセルロース（Sigma）を含む0.5mlのDMEM培地で細胞をカバーしています。 </li><li>組織培養インキュベーター中で静置します。 6日目、感染後にプラークをカウントします。単層の染色、クリスタルバイオレットを持つ例えば、プラークの計数を容易にすることができる。 </li><li>価（PFU / mlで）= D×N個×1000μL/ミリリットル÷Vの添加：次の式を使用して希釈していない組織溶解物または細胞溶解物中のウイルス力価を計算します。 N、適切な希釈でプラーク数の平均値であり、Dは、希釈倍（5など、10、100 .....）、V（μL）、連続的に希釈した上清の体積は当たりも追加。 </li></ol> 6。代表的な結果： - / -マウス10、マウス胚線維芽細胞（MEF）でγHV68溶菌複製表現型とrecombin 3つの代表的な数値は、野生型およびMAVSの肺におけるγHV68溶菌複製を含め、ここに示されていますMAVS依存IKKβによって変調されるリン酸化部位内の変異を運ぶアリγHV68。これら三つの裏付けとなる実験は 、in vivo および ex vivo で γHV68溶菌レプリケーションに先天性免疫コンポーネントの役割を定義するためのスキームを構成している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 MAVS + / +およびMAVSの肺のγHV68負荷- / -マウス。 ）二つの主要な先天性のシグナリングはMAVSの下流経路。順番に、炎症性サイトカインやインターフェロンの遺伝子発現をアップレギュレートするNFκBおよびインターフェロン調節因子（IRFS）を活性化するために細胞質RIG-I様受容体からのシグナルMAVSアダプター分子リレー。 B）はMAVS + / +およびMAVS - / -マウスは阻止された指定された時点で40 PFUの鼻腔γHV68および肺におけるウイルス量で感染させた NIH3T3単分子膜を用いたプラークアッセイによって決定されます。各シンボルは、マウスを表しています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：マウス胚線維芽細胞（MEF）でγHV68溶菌複製動態。 MAVS上γHV68の溶菌複製は+ / +およびMAVS - / - MEFには多段階の成長曲線（A）と、定量的リアルタイムPCR（B）によって評価した。両方の実験では、γHV68の等しいMEFの数と量は0.01-多数の感染度（MOI）でウイルス感染のために使用された。 （a）細胞と上清を示した時点で収穫し、ウイルス力価を決定するために、プラークアッセイの対象とされた。 （B）の総RNAをγHV68感染したMEFから抽出され、選択された溶菌転写産物（RTA、ORF57、およびORF60）に特異的なプライマーを用いて、定量的リアルタイムPCRによって分析した。 ig3.jpg "/&gt; 図3IKKγによるリン酸化を廃止RTAのトランス活性化ドメイン内の組換えγHV68運ぶ突然変異の溶菌複製動態。 （A）はMAVSにおける多段階成長換え野生型ウイルスの曲線（γHV68.wt）と変異ウイルス（γHV68.mut）+ / +およびMAVS - / - MEFの細胞（MOI = 0.01）。 MEFのをMOI 0.01でγHV68を感染させた。細胞と上清を指示された時点で収穫し、ウイルス力価はNIH 3T3単分子膜を用いたプラークアッセイにより決定した。 γHV68感染NIH3T3細胞（B）中のγHV68RTAのmRNAレベル（MOI = 0.01）。時間感染後30日時点で、全RNAをγHV68感染NIH 3T3細胞から抽出し、定量的リアルタイムPCRによって分析した。

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ウイルス感染に応答して、MAVS依存自然免疫シグナル伝達経路は、10月14日抗炎症性サイトカインの産生を促進するために活性化されています。人間の発癌性カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスおよびエプスタイン-バーウイルス3,4のモデルウイルスとしてマウスγHV68を使用して、我々はγHV68横取りMAVS-IKKβ経路は転写活性化5を介してウイルス溶解複製を促進することを発見した。分子ウイルス学における遺伝的に修飾されたMEFと技術を用いた、このプロトコルはγHV68溶菌複製にとって重要な特定の経路のシグナル伝達成分を効率的に識別することができます。このように、このプロトコルは 、in vivo感染、ex vivoで溶菌複製、自然免疫シグナル伝達経路の解剖に必然的に伴う。組換えヘルペスを生成する細菌人工染色体を含む分子機構、追加の手順を記述するためにウイルスと分子生物学的実験が必要である。さらに、ノックアウトマウス系統と線維芽細胞は、これらの実験のための鍵となります。利用可能なノックアウトマウス系統の数が多​​いと、このプロト...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>リポフェクタミン2000 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td>エレクトロポレーションMAXのコンピテントセル</td><td>インビトロジェン</td><td> 18290-015 </td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>シグマ</td><td> M0512 </td></tr><tr><td> POWERPREP HPプラスミドミニシステム</td><td> OriGene </td><td> NP100004 </td></tr><tr><td> POWERPREP HPプラスミドミディプレップシステム</td><td> OriGene </td><td> NP100006 </td></tr></tbody></table>

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

ウイルス感染に応答して、ホストがそのような抗ウイルスサイトカイン産生の1,2につながる自然免疫シグナル伝達経路を活性化するなど、様々な防御的な応答を、開発しています。ホストを植民地化するためには、ウイルスは、宿主の抗ウイルス応答を回避し、シグナル伝達経路を操作することが嫌気されています。宿主ウイルス相互作用を解明することはウイルス感染に対する新たな治療戦略の開発に光を当てることになります。 ネズミγHV68は密接に人間の発癌性カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスとEpsten-Barrウイルス3,4に関連しています。実験用マウスでγHV68感染はヒトヘルペスウイルスでは利用できませんin vivoにおける宿主応答とウイルス感染、の全過程を調べるために扱いやすい小動物モデルを提供します。このプロトコルでは、表現型の特徴とγHV68溶菌replicでホストシグナル伝達成分の分子解剖のための方法のパネルを提示vivoおよび ex vivoの両方において ation。遺伝的に改変されたマウス系統の有用性は 、in vivo で γHV68急性感染時に宿主シグナル伝達経路の役割の尋問を許可します。さらに、これらの欠損マウス系統から単離されたマウス胚線維芽細胞（MEF）を、さらにγHV68溶菌複製を ex vivoでの間にこれらの分子の役割を分析するために使用できます。 ウイルス学的および分子生物学的アッセイを用いて、我々はホストウイルスの相互作用の分子機構を特定し、ウイルス溶解複製に必須のホストおよびウイルス遺伝子を特定することができます。最後に、細菌人工染色体（BAC）システムは、具体的にホストウイルス作用を中断ウイルス因子（複数可）への変異の導入を容易にします。これらの変異を有する組換えγHV68は主要なホストシグナル伝達成分が欠損したMEFにおけるγHV68溶菌複製の表現型を再現するために使用できます。このプロトコルは 、in vivo および ex vivo における介入の複数のレベルで宿主-病原体相互作用を調べるための優れた戦略を提供しています。 最近、我々はγHV68奪う自然免疫シグナル伝達経路は、ウイルス溶解複製5を促進することを発見した。具体的には、γHV68de novoの感染症は、免疫キナーゼIKKβを活性化し、活性化IKKβは、ウイルスの転写活性化を促進するために、マスターウイルスの転写因子、複製およびトランス（RTA）をリン酸化する。そうすることで、効率的にγHV68カップルの自然免疫活性化をホストするために、その転写活性化は、それによってウイルス転写および溶解複製を容易にする。この研究では、ホスト·ウイルスとの相互作用を調べるために他のウイルスに適用できる優れた例を提供しています。

我々は、モデルヘルペスウイルス、ガンマヘルペスウイルス68（γHV68）の溶菌複製における宿主シグナル伝達分子の重要な役割を識別するためのプロトコルを記述します。 γHV68溶菌レプリケーション用に遺伝子改変されたマウス系統と胎児線維芽細胞を利用して、プロトコルは、表現型の特徴とウイルス溶解複製におけるウイルス - 宿主相互作用の分子尋問の両方を可能にします。

ウイルス感染に応じて、宿主は抗ウイルス状態へと導く自然免疫シグナル伝達経路の活性化など、さまざまな防御反応を展開します。

本実験の全体的な目的は、さまざまなウイルス学的および生化学的なアプローチを用いて、モデルヘルペスウイルスの溶解複製におけるホストシグナル伝達経路の役割を解析することである。ここでは例として、ヘルペスウイルス gamma HV 68 感染時におけるミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質 Mavs の役割を検討する。まず、急性感染時における Mavs の役割を調べるため、野生型および Mavs ノックアウトマウスに gamma HV 68 を感染させ、急性ウイルス感染を誘導する。マウスの肺を採取し、サンプルを段階希釈してプレートに播種するプラークアッセイによりウイルス量を測定します。その後、単層細胞上のプラーク数をカウントします。ノックアウトマウスにおいてウイルス量が増加していることは、目的の遺伝子が抗ウイルス的な役割を担っていることを示唆しています。対照的に、ノックアウトマウスでウイルス量が減少していることは、この遺伝子がウイルス感染に必要であることを示しています。これらの知見を検証するため、マウス胚性線維芽細胞を用いて、in vitroでのウイルスの多段階増殖キネティクスを検討します。野生型およびmavsノックアウトマウス胚性線維芽細胞にgamma HV 68を感染させ、さまざまな時間インキュベートします。その後、細胞を回収し、プラークアッセイを行うことで、野生型細胞とmavs欠損細胞の間で多段階増殖キネティクスを比較します。これらの知見をさらに検証するため、野生型およびmavsノックアウトマウス胚性線維芽細胞にgamma HV 68を感染させます。次に、感染細胞からDNAとRNAを個別に抽出し、ウイルスゲノム転写物をリアルタイムPCRで解析します。私たちは、ウイルス溶菌感染時における宿主免疫経路の役割を研究していた際に、まずこのプロトコルの着想を得ました。このプロトコルは、他の病原体による感染時のホストシグナル伝達経路の規則を調べるためにも応用可能です。まず、輸送後4日間の馴化期間を設けた、生後6～8週の性別を合わせた同腹マウスを用意し、本手順を開始してください。なお、以下の実験はバイオハザード施設で実施します。準備として、バイオセーフティーレベル2のキャビネット内で、ラボコート、手袋、マスク、およびシューズカバーを含む個人用保護具を着用してください。感染させるマウス1匹あたり、40〜10,000 PFUのgamma HV 68と30 µLの滅菌PBSを用いてウイルス懸濁液を調製します。ケタミン・キシラジンを腹腔内注射した後、ウイルス懸濁液を氷上で保持します。足指を挟んで、マウスが適切に鎮静されていることを確認してください。その後、ピペットを用いて、ウイルス懸濁液30 µLを左または右のどちらか一方の鼻孔に滴下します。ウイルスの肺内への導入を促進するため、マウスを5～10分間側位に保持します。その後、マウスをケージに戻し、鎮静から完全に回復するまで観察します。次に、注射したマウスから肺組織を回収し、感染後数日におけるウイルス力価を評価するための細胞溶解液を調製します。安楽死させたマウスから採取した肺を、500 µLの1.0 mmジルコニアシリカビーズを含む滅菌済みの1.5 mLスクリューキャップチューブに入れ、氷上に置きます。当日中に次のステップに進まない場合は、サンプルを-80 °Cで保存してください。それ以外の場合は、冷やした無血清DMEMを1 mL加えます。チューブをビードミルに入れ、スタートボタンを押して肺組織を30秒間ホモジナイズします。これは、サンプルの過熱によるウイルスの不活化を防ぐためです。30秒間のホモジナイズ後、チューブを氷上で1分以上冷却します。次に、この工程を繰り返します。その後、ホモジナイズした組織を4°C、16,000 RCFで1分間遠心分離します。遠心分離後、細胞残渣はチューブの底部に、脂質は表面に集まります。ここで示すように、すぐに上清を回収し、NIH 3T3またはBHK 21の単層細胞を用いてプラークアッセイを行います。次に、サンプル中のウイルス力価を決定するためにプラークアッセイを実施します。まず、ウイルス上清を段階希釈してプラークアッセイを開始してください。まず、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートに270 µLの培地を分注します。1行目は空けておきます。次に、96ウェルプレートの1行目に200 µLの上清を加え、各サンプルを3連（triplicate）で分注します。次に、1行目のサンプルから30 µLを次の行に分注し、混合します。その後、混合液から30 µLをさらに次の行に分注して混合します。この操作を繰り返し、10倍段階希釈系列を作成します。次に、希釈したウイルス上清を細胞単層に添加します。24ウェルプレートを使用します。プレートをインキュベーターに入れ、2時間のインキュベーション中、30分ごとにプレートを振ってください。インキュベーション後、細胞のデブリを除去するため、プレートから上清を吸引します。その後、新鮮な培地で細胞を1回洗浄します。洗浄後、メチルセルロースを含む培地を細胞に加えます。細胞を4〜6日間培養します。4〜6日後、顕微鏡を用いて各サンプルのプラーク数を計測します。各希釈段階におけるプラーク数を記録してください。次に、平均値と標準偏差を算出します。プラーク数が多すぎるか少なすぎるウェルは、力価を正確に算出できないため使用できません。したがって、各サンプルについて、プラーク数が7個から70個である希釈段階を使用してください。1000倍に希釈したこのサンプルのウェルあたりの平均プラーク数は23個です。未希釈溶液中のウイルス力価を算出するには、希釈倍率にプラーク数を掛け、さらに1 mLあたりのマイクロリットル数を掛けます。その後、その値をウェルあたりに添加した希釈上清の量で割ります。この例では、1000 × 23プラーク × 1000 µL/mL ÷ 100 µL ＝ 2.3 × 10⁵ forming units/mLとなります。次に、既知のタイターを持つウイルスストック溶液を使用して、マウス胚性線維芽細胞におけるgamma HV 68の増殖キネティクスを決定します。まず、野生型マウスおよび特定のホスト遺伝子が欠損したマウスの細胞を、24ウェルプレートに10,000 cells/wellの密度で播種します。翌日、各ウェルの培地を0.5 mLの低MOI gamma HV 68懸濁液に交換します。プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、2時間 incubation を行います。incubation 中、30分ごとにプレートを揺らしてください。ピペットを使用してウイルス懸濁液を除去し、8%胎児牛血清を含む新鮮な完全DM EM 0.5 mLをウイルス感染細胞に加えます。感染後のさまざまな日にちで、細胞をインキュベーターに戻します。ピペッティングを数回繰り返し、medium end細胞を回収します。それらを滅菌済みの1.5 milliliter遠心チューブに移し、直ちにminus 80 degrees Celsiusで凍結させ、Metsからgamma HV 68を放出させます。凍結・融解サイクルを3回繰り返します。細胞を37 °Cに置いて融解させます。その後、ボルテックスミキサーで攪拌し、再び-80 °Cのフリーザーに戻します。ホスト遺伝子またはウイルス遺伝子の欠損によってDNAまたはRNAの複製が影響を受けるかを確認するため、先に示したNIH 3T3またはBHK-21の単層細胞を用いたプラークアッセイによりウイルス力価を測定します。感染後さまざまな日数の感染細胞から開始し、上清を除去して、細胞を冷PBSで洗浄し、トリプシンで細胞を剥離させます。次に、室温で1000 RCFにて1分間遠心分離して細胞をペレット化し、遠心後に上清を除去して、細胞を-80°Cで保存します。宿主およびウイルス由来の全DNAおよびRNAを抽出します。次に、スピンカラムを遠心分離します。全DNAとウイルス溶菌転写物特異的なプライマーを用いて、リアルタイムPCRを行います。ホストのハウスキーピング遺伝子（β-actinなど）を基準として、細胞内gamma HV 68ゲノムの相対量を決定します。全RNAとoligo DTプライマーを用いてcDNAを調製します。上記cDNAおよびプライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、ウイルス転写物の相対量を決定します。ホストのハウスキーピング遺伝子の参照に対し、ここで示すように、Mavsはmitochondrial antiviral signalingの略称です。Mavsアダプター分子は、細胞質内のRIG-I様受容体からのシグナルを伝達し、NF-κBおよびインターフェロン調節因子（IRFs）を活性化させ、その結果、前炎症性サイトカインおよびインターフェロンの遺伝子発現を上方制御します。ここでは、γHVに感染した野生型マウスおよびそのリターメイトであるMavs欠損マウスの肺におけるウイルス量を示しています。Mavsの欠損により、感染10日後の肺におけるウイルス量がいずれも著しく減少しており、in vivoでの効率的なウイルス感染にはMavsが必要であることが示された。本図は、野生型マウス胚性線維芽細胞およびMavs欠損マウス胚性線維芽細胞におけるウイルスの多段階増殖曲線を示している。Mavs欠損マウス胚性線維芽細胞ではウイルスの増殖が著しく遅延しており、in vitroでの効率的なウイルス複製にMavsが必要であることが示唆された。γHV68感染マウス胚性線維芽細胞におけるウイルス溶菌遺伝子のmRNAレベルをリアルタイムPCRで解析したところ、Mavsの欠損により、3つの必須溶菌遺伝子のmRNAレベルが著しく減少していた。これらの結果は総じて、Mavsがgamma HV 68の転写活性化および溶菌性複製に必要であるという結論を支持しています。このビデオを視聴することで、VOおよびVevoの両方において、宿主と病原体の相互作用を複数のレベルで解析する方法について十分に理解できたはずです。病原体を扱う際は、極めて慎重な対応が必要であることを忘れないでください。操作中は、個人用保護具の着用などの予防措置を講じてください。

dissecting-host-virus-interaction-lytic-replication-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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関連付けられているウイルスおよび細胞タンパク質の同定のウイルス DNA の精製

アルボ ウイルス複製とアルボ ウイルス複製を制限する 2) 真核生物の宿主因子を促進する免疫調整物質 1) ウイルス エンコードを識別するためにプロトコルを紹介します。これら蛍光や発光を用いる方法は、急速に量的な読み出し信号対雑音比の低い単純なアッセイのアルボ...

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ICP0 は、HSV-1 感染核-細胞質転流を受けます。このイベントの分子メカニズムは知られていません。ここで我々 は将来解明で ICP0 転座を定量的に解析の基盤 HSV-1 感染の ICP0...

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単純ヘルペスウイルス1型にオートファジーを調節するsiRNAエレクトロポレーション 1-感染単球由来樹状細胞

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学ぶモデルヘルペスウイルスγHV68の溶菌レプリケーションにおける宿主シグナル伝達分子Mavsの役割。遺伝子改変マウスと胚芽線維芽細胞を用いて、ウイルス-宿主相互作用を解析する方法です。

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

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