モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

次の実験の全体的な目標は、さまざまなウイルス学的および生化学的アプローチを使用して、モデルヘルペスウイルスの溶解性複製における宿主シグナル伝達経路の役割を解剖することです。ここでは一例として、ヘルペスウイルスγ HV 68の感染におけるミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質Mavsの役割について検討します。まず、急性感染時のMavsの役割を調べるために、野生型マウスとMavsノックアウトマウスは、急性ウイルス感染後にγHV68に感染します。

マウスの肺を採取し、サンプルを段階希釈してプレーティングするプラークアッセイによってウイルス量を決定します。単層では、プラークの数がカウントされます。ノックアウトマウスのウイルス量の増加は、目的の遺伝子が抗ウイルスの役割を果たしていることを示唆しています。

対照的に、ノックアウトマウスにおけるウイルス量の減少は、遺伝子がウイルス感染に必要であることを示している これらの知見を検証するため。マウス胚性線維芽細胞、野生型、およびmavsノックアウトマウス胚性線維芽細胞をγHV68に感染させ、さまざまな時間インキュベートするマウス胚性線維芽細胞で、in vitroウイルスの多段階増殖速度を調べます。次に、細胞を採取し、プラークアッセイを実施して、野生型細胞とマブス欠損細胞との間の多段階の成長動態を比較します。

これらの知見をさらに検証するために、野生型およびmavsノックアウトマウス胚性線維芽細胞をγHV68に感染させます。次に、感染した細胞からDNAとRNAを別々に抽出し、ウイルスのゲノム転写産物をリアルタイムPCRで解析します。このプロトコルのアイデアを最初に思いついたのは、ウイルス感染時の宿主免疫経路の役割を研究したときでした。

このプロトコルは、他の病原体による感染中の宿主シグナル伝達経路のルールを調査するために適用できます。この手順は、生後6〜8週間の性別が一致した同腹仔で作られたマウスを出荷後4日間順応させることから始めます。以下の実験はバイオハザード施設で行います。

準備として、白衣、手袋、マスク、バイオセーフティのキャビネットで働くブーツなどの個人用保護具を着用します。レベル2。感染する各マウスについて、40〜10, 000PFUのガンマHV 68と30マイクロリットルの滅菌PBSでウイルス懸濁液を調製します。

ケタミンキシラジンの腹腔内注射後、ウイルス懸濁液を氷上に保ちます。.マウスが鎮静されていることを確認するために、つま先をつまむ。次に、ピペットを使用して、30マイクロリットルのウイルス懸濁液を左または右の鼻孔に滴下します。

マウスを横向きに5〜10分間置いて、ウイルスの肺への気道送達を促進します。次に、マウスをケージに戻し、鎮静から完全に回復するまでマウスを監視します。次に、注射したマウスから肺組織を採取し、感染後数日でウイルス力価を評価するための細胞溶解物を調製します。

犠牲にしたマウスから採取した肺を、500マイクロリットルの1.0ミリメートルジルコニアシリカビーズを含む滅菌1.5ミリリットルのスクリューキャップチューブに氷上に置きます。そうでない場合は、同日中に次のステップに進みます。サンプルは摂氏マイナス80度で保管してください。

それ以外の場合は、1ミリリットルのコールドセラムフリーDMEMを追加します。.チューブをビーズビーターに入れ、スタートを押して肺を30秒間均質化します。ウイルスを不活化する可能性のあるサンプルの過熱を避けるため。

チューブを氷上で少なくとも1分間冷やし、30秒間均質化します。次に、このプロセスを繰り返します。次に、均質化された組織を摂氏4度で16,000 RCFで1分間遠心分離します。

スピン後、細胞の破片はチューブの底に、脂質は表面に存在します。すぐにここに示すようにスナットを取り、NIH three T threeまたはBHK 21単分子膜を使用してプラークアッセイを実行します。次に、プラークアッセイを行う サンプル中に存在するウイルス力価を決定するために、ウイルス上清の段階希釈を行うことによりプラークアッセイを開始する。

まず、マルチチャンネルピペットを使用して、270マイクロリットルの培地を96ウェルプレートに加えます。最初の行は空白のままにします。次に、200マイクロリットルの上清を96ウェルプレートプレートの最初の列に各サンプルを三重に加えます。

次に、サンプルの30マイクロリットルを最初の列から次の列に移し、混合します。次に、30マイクロリットルの混合物を次の列に移して混合します。この手順を複数回繰り返して、10倍の段階希釈を行います。

次に、希釈したウイルス上清を細胞単層に加えます。24ウェルプレート入り。プレートをインキュベーターに入れ、インキュベーション後2時間のインキュベーション中に30分ごとにプレートを振って細胞の破片を取り除き、プレートから上清を吸引します。

次に、細胞を新鮮な培地で一度洗います。洗浄後、メチルセルロースを含む培地を細胞に加えます。細胞を4〜6日間インキュベートします。

4〜6日経った後。顕微鏡を使用して、各サンプルのプラーク番号を読み取ります。各希釈液のプラーク数を記録します。

次に、平均と標準偏差を計算します。プラークが多すぎたり少なすぎたりするウェルは、力価を正確に計算するために使用できません。したがって、各サンプルには、7〜70個のプラークがある希釈液を使用してください。

このサンプルを1000倍に希釈すると、ウェルあたり平均23のプラークがあります。希釈されていない溶液中のウイルス力価を計算するには、希釈係数にプラークの数を掛け、ミリリットルのマイクロリットル数を掛けます。次に、それをウェルごとに添加する希釈した上清の量で割ります。

したがって、この例では、1000 × 23 プラーク × 1000 マイクロリットル/ミリリットルを 100 マイクロリットルで割ると、2.3 × 10 に 10 × 1ミリリットルあたり 5 番目の形成単位になります。次に、既知の力価を有するウイルスストック溶液を使用して、マウス胚性線維芽細胞ORMにおけるγ HV 68の成長動態を決定するために、野生型の神話と宿主遺伝子に欠損したものをウェルあたり10, 000細胞で24ウェルプレートに分割することから始まります。翌日、各ウェルの培地を0.5ミリリットルの低MOIガンマHV68懸濁液と交換します。

プレートをインキュベーターに摂氏37度で置き、インキュベーション中に2時間インキュベーションを進めます。インキュベーション後30分ごとにプレートを揺らします。ピペットを使用してウイルス懸濁液を除去し、8%のウシ胎児血清を含む0.5ミリリットルの新鮮な完全DM EMをウイルス感染細胞に加えます。

感染後数日間、細胞をインキュベーターに戻します。中端細胞を複数回ピペッティングして回収します。滅菌済みの1.5ミリリットル遠心チューブに移し、すぐにチューブをマイナス80°Cで凍結して、メッツからガンマHV68を放出します。

凍結と解凍の3サイクルを実行します。セルを摂氏37度に置いて解凍します。次に、渦巻きにして、マイナス80°Cの冷凍庫に戻します。

先に示したように、NIH three、T、three、またはBHK 21単分子膜を用いたプラークアッセイによりウイルス力価を測定し、DNAまたはRNAの複製が宿主遺伝子またはウイルス遺伝子の欠損によって影響を受けるかどうかを調べます。感染後数日で感染したmesから始め、上清を捨て、冷たいPBSとトリプシン氷細胞で細胞をすすぎます。その後、スピン後1分間、室温で1000 RCFで濃縮することにより細胞をペレット化し、上清を廃棄して細胞をマイナス80°Cで保存します。

宿主およびウイルス起源の全DNAおよびRNAを抽出します。次に、スピンカラムを遠心分離します。全DNAおよびウイルス溶解性転写産物に特異的なプライマーを用いてリアルタイムPCRを実施します。

βアクチンなどの宿主ハウスキーピング遺伝子を参照して、細胞内γHV 68ゲノムの相対量を決定します。トータルRNAとオリゴDTプライマーでCDNAを調製します。上記のようにCD NAとプライマーを使用してリアルタイムPCRを行い、ウイルス転写産物の相対量を決定します。

宿主のハウスキーピング遺伝子に関連して、Mavsはここに示すようにミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達の略です。Mavsアダプター分子は、細胞質リグアイ様受容体からのシグナル伝達を中継して、NF、κB、インターフェロン調節因子IRFを活性化し、炎症誘発性サイトカインおよびインターフェロンの遺伝子発現をアップレギュレートします。γHVに感染した野生型マウスとMavs欠損の同腹仔マウスの肺内のウイルス量をここに示します。

Mavsの欠損は、感染後10日で肺内のウイルス量を有意に減少させ、Mavsがin vivoでの効率的なウイルス感染に必要であることを示しています。この図は、野生型マウス胚性線維芽細胞とMavs欠損症のウイルスの多段階成長曲線を示しています。マウス胚性線維芽細胞でのウイルス増殖の大幅な遅延は、Mavsが効率的なウイルス複製に必要であることを示しています γHV 68に感染したマウス胚性線維芽細胞のウイルス溶解遺伝子のmRNAレベルをMavsのリアルタイムPCR欠損により分析し、3つの必須溶解遺伝子のmRNAレベルを有意に低下

これらの結果はすべて、MavsがガンマHV68転写活性化および溶解性複製に必要であるという結論を総合的に支持しています。このビデオを見れば、VOとVevoの両方で、宿主病原体の相互作用を複数のレベルで調査する方法を十分に理解できるはずです。病原体を扱うことは非常に躊躇する可能性があることを忘れないでください。

パフォーマンス進行中は、個人用保護具の着用などの注意が必要です。