ミトコンドリアカルシウム取り込みアッセイ:単離されたミトコンドリアにおけるカルシウム取り込みを測定するためのプレートリーダーベースの方法

ミトコンドリアは、細胞質ゾルカルシウムが適切な機能に不可欠であるため、細胞質ゾルカルシウムを取り込みます。

ミトコンドリアマトリックスへの過剰なカルシウム流入(ミトコンドリアカルシウム過剰負荷)は、内膜チャネル、ミトコンドリア透過性遷移孔、またはMPTPの開放を引き起こします。開いた細孔は、ミトコンドリアからのカルシウム流出を増加させ、ミトコンドリアの機能不全を引き起こします。

ミトコンドリアカルシウム取り込みを測定するには、適切な緩衝液に懸濁された単離されたミトコンドリアを含むマルチウェルプレートから始めます。ATP産生基質であるピルビン酸とリンゴ酸をウェルに補充します。ウェルの内容物を混ぜてインキュベートします。

インキュベーション中、ピルビン酸とリンゴ酸はATPに変換され、ミトコンドリアにエネルギーを与えます。ミトコンドリア膜不透過性、カルシウム感受性蛍光色素分子を含む溶液を加えます。カルシウム含有バッファーを活性化されたミトコンドリアに分注します。

色素分子がバッファー中の遊離カルシウムに結合する際の色素のカルシウム蛍光を監視します。

カル

シウムイオンをさらに追加して、ミトコンドリアカルシウムの流入を開始します。徐々に増加するミトコンドリアカルシウムは、バッファー中のカルシウムイオンを減少させ、色素のカルシウム蛍光を低下させます。

ミトコンドリアが最大のカルシウム運搬能力に達すると、カルシウムイオンをさらに添加すると、MPTPチャネルが開き、カルシウムがバッファーにインポートされます。緩衝カルシウムは色素分子に結合し、色素カルシウムの蛍光を増加させます。

ミトコンドリアカルシウム取り込みの動態を監視するために、カルシウム添加の異なる時点での色素蛍光をプロットします。

プレートリーダーを使用してミトコンドリアカルシウム取り込み測定を開始するには、合計1,000秒間、毎秒カルシウムグリーン-5N蛍光のキネティックリードを実行するようにリーダーをプログラムします。

試

薬インジェクターをプログラムして、さまざまな時点で5マイクロリットルの塩化カルシウム溶液を分注します。次に、使用する塩化カルシウム溶液でインジェクターをプライミ

ングします。

次に、200マイクログラムの単離ミトコンドリアを96ウェルプレートの1つのウェルに加え、適切な量の塩化カリウムバッファーを加えて、総容量197マイクロリットルにします。次に、1マイクロリットルの1モルピルビン酸、1マイクロリットルの500ミリモルリンゴ酸、および1マイクロリットルの1ミリモルカルシウムグリーン-5Nストックを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。

ミトコンドリアが活性化されるまで、室温で光から保護して2分間インキュベートします。最後に、事前にプログラムされた運動プロトコルを開始し、カルシウムグリーン-5N蛍光を監視します。