Name: ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶマイクロプレート呼吸測定法でマウス骨格筋由来ミトコンドリアの酸素消費を評価する方法です。電子伝達系とTCA回路の機能解析に適し、少量試料で高スループットな代謝研究が可能となります。

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バージニア工科大学のフラリン生命科学研究所とメタボリック表現型コアがこの作業を支援しました。

注：1が赤骨格筋からのミトコンドリアを隔離した後にこのプロトコルを開始します。赤色骨格筋13 100mgの-以前〜75で説明したようにミトコンドリアを単離しました。 （Frisard ら 13を参照してください）2（IBM）は、ミトコンドリアのタンパク質を10μg/μlではミトコンドリアのための分離バッファの≤50μlの最終的なミトコンドリアのペレットを再懸濁することにより、組織のこの量から達成されるであろう- 5の間。 1.セットアップ<ol><li>その後のアッセイのためのワーキングストック溶液（ 表1）およびミトコンドリアアッセイ溶液（MAS）ミックス（ 表2）を準備します。 注：最もストック溶液およびMASを格納できるようなアッセイのための調製物の大部分は、事前に行うことができます。 </li><li> 37℃での非CO 2インキュベーター内で実験前の夜1ミリリットルの較正溶液中の呼吸アッセイカートリッジを水和。 </li><li>実験の日、トンAKEアウト凍結ストック（基材とミトコンドリアのモジュレーター、MASミックス、MAS W / O BSA、 表1）および37℃のバスまたはインキュベーターで解凍。 </li><li>すべての基質溶液（ 表3）、注射（ 表4-5）を準備し、（pH7.4）に、必要に応じてpHを調整します。 pHを調整した後、氷上で保存します。 </li><li>プログラムの適切なミックス、待って、測定パラメータにマルチウェルの酸素消費量測定装置は、最初に「標準」モードに続く解析ソフトウェアを、次のように入力して、ラベルの背景とグループ/条件のウェル（ 表6を参照してください）。 <ol><li> 「ゲスト」フォーラムに入力し、「アッセイウィザード」をクリックしてください。かつて「アッセイウィザード」で、ミックスを変更する待機し、パラメータを測定する「プロトコル」をクリックしてください。 「バックの下にバックグラウンドウェルにラベルを付けます。補正」タブをハイライト表示するようにしてください &quot;&quot;バックグラウンド補正を行います。 </li><li>ラベルCOND「グループ情報」タブに続いて「グループとラベル」タブ、上の最初のクリックしてitions。これらのパラメーターが入力された後、「テンプレート保存」に続いて、「終了」をクリックします。 </li></ol></li></ol> 2.ザ・アッセイを実行します<ol><li>アッセイの実行カートリッジに注入溶液をロードし、最初の「標準」モードに入るに続く解析ソフトウェアを、入力してキャリブレーションを開始します。 「ゲスト」フォーラムに入ります。 「テンプレート」タブで、「XF」ドライブの下にステップ1.5で保存したテンプレートを開きます。オープンしたら、キャリブレーションを開始するには、「スタート」をクリックします。 注：分析の実行カートリッジは、左下に切り欠きの角を持つマシンに入力する必要があります。これは、約30分かかります。適切なポートにソリューションを注入するように注意してください。 表4-5の注射はロードの順に表示されます。 </li><li>静かに、しかし完全にmitochondを混ぜますそっとそのオリフィスはハサミで先端の末尾から〜3ミリメートルを切断することによって広がってきた200μlのピペットチップで株式を粉砕に続いて、200μlのピペットチップで溶液を攪拌することにより、RIAの株式。 </li><li>ミトコンドリアの株式のタンパク質濃度を決定するために、ビシンコニン酸（BCA）アッセイを実行します。 </li><li>ステップ2.3から取得した株式の濃度を使用して、コハク酸/ロテノン基質ミックス（ 表3）のミトコンドリアタンパク質/ 200μLの10μgの再懸濁します。ミトコンドリアタンパク質の14μgの/残りの基質ミックス200μlを（ 表3）（ これは、各基質ミックスのために行われなければならない）再懸濁します。すべてのミトコンドリアタンパク質/基質を氷上でミックス置きます。 注：以前9に記載されているように 、各アッセイのために、ウェルあたりのミトコンドリアのタンパク質の最適量を決定しました。それが決定されたそのピルビン酸/リンゴ酸、パルミトイルカルニチン/リンゴ酸、グルタミン酸/リンゴ酸のANコハク酸/ロ​​テノンアッセイはミトコンドリアタンパク質2.5μgのウェルあたりを利用しながら、D電子流アッセイは、ミトコンドリアタンパク質の3.5μgのを利用しています。そのため、研究者は4があるので、このステップで複製するための十分なミトコンドリアタンパク質を再懸濁する必要があるのいずれかを2.5μgまたは50μLあたり3.5μgのはウェル当たりロードされる（ステップ2.6を参照してください）​​。 </li><li>静かに、しかし完全に静かに最後の〜3ミリメートルを持った200μlのピペットチップで株式を粉砕に続いて200μlのピペットチップを用いて溶液を、攪拌することにより、ミトコンドリア/基質溶液を混合を遮断します。 </li><li>氷の上と三重で細胞培養プレートを置き、ミトコンドリア/基質ミックスの各負荷を50μl/ウェル。マイクロプレートベースの呼吸アッセイの開発者は、好ましくは、細胞培養プレート上のいずれかの側に、2ブランク（無ミトコンドリア）をウェルの最小値を残してお勧めします。 </li><li> 4℃で20分間、2,000×gで細胞培養プレートをスピン。プレートがsであるがピン止め、37℃の水浴中で基質溶液を温めます。 </li><li>スピンが完了した後、慎重に各ウェルの上に各基質溶液450μlのをロード（ すなわち 、最初にこの基質溶液中に再懸濁させ、ミトコンドリアを持つウェルにピルビン酸/リンゴ酸基質をロード）。 RTでプレートをロードしてください。注：ブランクウェルは、基板の500μlのロードする必要があります。結合されたアッセイブランクウェルは、任意の結合アッセイ基質をロードすることができる一方で電子流アッセイのために指定されたブランクウェルは、電子流基板（ピルビン酸/リンゴ酸+ FCCP）をロードする必要があります。 注：分析の実行が「音源」タブから「XFリーダー」プラットフォームを使用して完了した後、同じプレート上に結合され、電子の流れのアッセイを行う場合には、研究者がそれぞれのアッセイにバックグラウンドウェルを再割り当てする必要があります。かつて「インストゥルメント」の設定の中に、「管理」をクリックしてください「バックグラウンド補正」に続くタブ、。完了したら、「装置のセットアップモードを終了」ヒット。アスコルビン酸塩/ TMPDの組み合わせは、このように独立したバックグラウンド補正は、各アッセイタイプに必要とされるO 2 を消費することができるからです。 </li><li>基板の450μlの後、各ウェルに添加し、ミトコンドリアが単一の単分子層（20X倍率[ロジャース9、 図4を参照してください ]）の中に均一に分散されることを保証することは、十分にミトコンドリアの層を表示します。均等に分散単層を持っているようには見えないウェルは、 事後除去することができます 。 </li><li>ミトコンドリアの遵守のためにチェックした後、呼吸分析機器にマイクロプレートを挿入し、「OK」をクリックして実行しアッセイを開始します。 注意：実行が開始される前にステップ2.1からのキャリブレーションが完了していなければなりません。研究者は、「OK」をクリックすると、機械は、キャリブレーションのために使用されたユーティリティ・プレートを排出します。 <ol> &lt;LI&gt;ユーティリティプレートを取り外し、トレイ上のミトコンドリアを含む細胞培養プレートを配置します。細胞培養プレート上の青色のノッチは、トレイの左下隅に配置する必要があります。アッセイの実行を開始するには、「継続」、をクリックしてください。 </li></ol></li><li>実行が完了すると、画面上で「取り出し」を押すことによって、細胞培養プレート、カートリッジを取り出します。 <ol><li>プレートが排出されたら、削除して、細胞培養プレートとカートリッジを破棄し、画面上で「続行」をクリックします。ランは自動的に「データ」ファイル内の.xlsファイルとして保存されます。 </li></ol></li><li>このファイルを開いて、「Y1：」の下に下向きの矢印を押すことで「OCR」を「O2」から表示を変更マーカー。 <ol><li>オプション：下の次の変更「中間点」を「ポイント・ツー・ポイント・料金」「速度データとして表示 &quot;。これらの変更を適用するには、「OK」をクリックしてください。 </li></ol&gt; </li><li>一緒に同じような条件のグループウェルに画面の左下に「まあグループモード」タブをクリックします。最後に、左に、画面の中央に向かって、「サンプル平均値/標準エラー」タブをクリックします。アッセイは「アッセイウィザード」の設定で開始される前に別の方法として、これらのコマンドを設定することができます。 注意：各条件は各レートと各条件について表示平均±標準偏差を持つことになります。条件ごとに取得率の測定（4回の注射が続く状態2 [結合] / State3u [電子流れ]呼吸）があります。 、第二の測定の状態2速度の平均値を使用し、注射をオリゴマイシン後最小点での状態40を決定し、ADPとFCCP注入した後の状態3と状態3Uの最大ポイントを使用し、それぞれ、およびアンチマイシンAの最低ポイントを使用カップリングアッセイのために誘導された呼吸。最小値を使用して、ピルビン酸/リンゴ酸誘導状態の3U呼吸のための最大のポイントを使用しますロテノン誘発される呼吸のためのポイント、コハク酸誘導状態の3U呼吸のための最大のポイントを使用し、電子フローアッセイのためのアンチマイシンA誘発された呼吸のための最小点を使用しています。すべての実験は3回行い、示したデータは代表的なトレーシングの結果です。 </li></ol>

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</ol>

ジョージ・W・ロジャーズは、これらのアッセイが開発されたときのための機器を製造してタツノオトシゴバイオサイエンスの従業員です。

マウス骨格筋の100 mgの - この記事で紹介した方法は、75から分離されたミトコンドリアを用いて、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのコレクションのパフォーマンスのためのステップバイステップの手順を提供します。これらのアッセイは、三連のウェル間の緊密な標準偏差によって証明されるように高精度に行うことができます。重要なことに、これらのアッセイは、異常呼吸及び/又は適応は、一般的に使用される動物モデルにおいてETC、TCAサイクル、β酸化経路、基板の輸送等に発生することができる場所を特定する可能にします。 これは、このプロトコルで使用されるさまざまな燃料や阻害剤を使用するための理論的根拠を強調することが重要です。ピルビン酸/リンゴ酸およびグルタミン酸/リンゴ酸呼吸アッセイは私が呼吸を媒介、ならびにそれらのそれぞれのトランスポーターの評価、およびグルタミン酸の場合、デアミナーゼ15における複合体の評価を可能にします。代替的に、の組み合わせロテノンは、複合体Iを阻害し、コハク酸は、フラビンアデニンジヌクレオチドの還元により複合体IIに電子を提供するので、コハク酸/ロテノンは（FADH 2）15 ETCの複合体IIを介してミトコンドリア呼吸フラックスの評価を可能にします。これらのアッセイは、結合効率と最大呼吸のような基板の特定の情報を提供します。電子流アッセイは、基質および阻害剤の組み合わせが、ミトコンドリア呼吸フラックス9中に複数の複合体の評価が可能になるという点で独特です。コハク酸続いロテノンの注射は複合体IIによって駆動評価の最大の呼吸を可能にしながら、ピルビン酸/リンゴ酸+ FCCPの初期基質ミックスは、複合体Iで駆動される最大の呼吸の評価を可能にします。アスコルビン酸/ TMPDがあるので、アスコルビン酸/ TMPDの注入に続いてアンチマイシンA、複合体IIIの阻害剤の注入は、複合体IVで駆動される呼吸の評価を可能にチトクロームC /複合体IVへの電子供与体。結合効率についての情報が得られないが、この方法は、独立して複数の基板を実行して排除する非常に小さなサンプルサイズに最適です。最後に、パルミトイルカルニチン/リンゴ酸を使用することは、β酸化およびパルミチン酸（β酸化）フラビンタンパク質15を電子輸送を通じてETCに供給の酸化から生産削減同等以来ETC間の調整の評価が可能になります。これは、カップリングと電子フローアッセイはまた、何らかの介入（薬物治療、遺伝子操作）にミトコンドリア機能の変化を同定するために連携して使用することができることに留意すべきです。 これらのアッセイのために達成し、高精度は、前タンパク質決意に、または基板ソリューションであるかどうかを、主にミトコンドリアの完全な混合に起因するものです。この線に沿って、ミトコンドリア一度基板solutioにresuspendendされますNSは、それが広がったオリフィスピペットチップでステップ2.2で説明したように細胞培養プレートをロードする前に十分、この溶液を混合することが重要です。ミトコンドリアをミックスに失敗すると、徹底的に分析内の大きな変動につながります。また、ミトコンドリアを混合しながら剪断力を作成し、狭いオリフィスピペットチップを使用すると、接着ステップ（2.7）も、このプロトコルにおける重要なステップであるミトコンドリア膜およびシトクロムCの放出を損傷する可能性を増大させます。長い/十分に速くロードされた細胞培養プレートを回転しないと、このように井戸と測定値の間の増加変動をリードし、ウェルにミトコンドリアの不完全密着性になります。 記載されているプロトコルが含まれるように最適化されています：、ウェルあたりのミトコンドリアのタンパク質の最適量をロードする株式及び基板ソリューションを作るために正しい濃度/調製法を用いて、ミトコンドリアの状態ナンプラーを確保するためのアッセイの実行を変更しますteaus、およびミトコンドリア株式およびミトコンドリア/基質混合物の適切な混合。これらの最適化の取り組みに先立ち、著者らは、アッセイの実行に落とし穴が発生しました。以下は、このプロトコルを最適化するのに便利でしたトラブルシューティング方法/修正について説明します。マイクロチャンバー内の酸素を排出し、不正確な測定につながるあまりミトコンドリアのロード中に、最適な負荷に関して、負荷が少なすぎるミトコンドリアは、強固な応答を誘発しません。ロジャースら 9は、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのために、ウェルあたりのミトコンドリアの最適な積載量を決定する例を示します。多くの場合、あまりにも多くのミトコンドリアはロードごとにだけでなく、100〜200ピコモル/分/ウェルと状態3速度オーバー状態2速度/ウェル&gt; 1500ピコモル/分によって証明されます。 （。 - 10μgの例えば 、1の間）は、動的R内のOCRを引き出すためにオーバーロードが発生した場合は、ミトコンドリアタンパク質の濃度を変化させて実験を行います酸素消費量測定装置のアンジュ。準備と基板との株式の正確な濃度を使用することは最も重要です。常に基板/注射の酸形態を使用し、水酸化カリウムまたは塩酸を用いてpHを調整します。ナトリウムバッファ/ソリューションが推奨されていません。また、DMSO中の基質/株式または100％エタノールを再懸濁して、測定の障害やエラーになります。指摘の95％エタノールを使用してください。パルミトイルカルニチンは、このように大きな変動を引き起こし、凍結ストックを解凍した後、95％エタノールから沈殿することが一般的です。使用する前によくパルミトイルカルニチンストックと渦をウォームアップしてください。また、非常に可変ピルビン酸/リンゴ酸分析結果が原因ピルビン酸在庫が&gt; 2週齢であることとすることができます。 2週間ごとにピルビン酸の凍結アリコートをリメイクしてください。アッセイの実行は、ミトコンドリアの状態のプラトーを確保するために2分間の測定に変更されました。 ADPの枯渇の観察が必要な場合は、研究者はよいです「アッセイウィザード」フォーラムの下で「プロトコル」タブの下に測定時間を延長します。ミトコンドリアの株式やミトコンドリアプラス基板ソリューションが完全にロードする前に均質化されていない場合最後に、大きな変動が発生します。ウェル間の変動は、アッセイの実行後に高い場合は、完全に先立って次の実験に基質溶液を混合してください。決してミトコンドリア/基質溶液をボルテックスしない、むしろ、マッシュを攪拌し、ゆっくりと広げオリフィスピペットチップで粉砕します。 注目に値するこの技術のいくつかの制限があります。最初に、これらのアッセイのために使用される細胞培養プレート上のウェルの数が比較的低い（ すなわち 、24ウェルおよびブランクウェルのために指定される少なくとも2）。それは、1つのプレート上にこれらのアッセイのすべて5を実行することが望まれる場合、研究者は、一度に1つのマウスからの応答を調べることができます。しかし、96ウェル機器がhigheために利用可能であることに留意すべきですR・スループット。第二に、1無傷の細胞中に比べて単離ミトコンドリアにおけるミトコンドリア機能障害の評価に固有の長所と短所があります。いくつかの弱点は、無傷の細胞と分離プロセスから誘導成果物に比べて少なく、生理学的関連性を有するものが挙げられます。最後に、この方法の成功は、ミトコンドリアの単離プロセスの品質次第です。 これらのアッセイのいくつかは、どちらかの異なるシステムが開発されているまたは他の動物モデルで確認されているが、本明細書に提示される方法は、マルチウェル酸素消費量測定装置を用いてマウスに最適な使用のための上記のアッセイの全てを合成する最初のものです骨格筋。したがって、最小限の材料で高いスループットを提供し、マウス骨格筋100mgの - 重要なことに、これらのアッセイの全ては、5〜75から単離されたミトコンドリアの量を行うことができます。大きな意義、マルチウェルの能力の酸素消費技術が最適化された分離方法と組み合わせて、ミトコンドリアの最小量とのアッセイを実行するために、研究者は、骨格筋組織の残りは他の実験（ 例えば 、ウェスタンブロットの多数を実行することができ、RT-PCR、酵素アッセイ、など）、多くの場合、この動物モデルとの闘いです。 結論として、本明細書に提示する方法は、マウス骨格筋の最小量を用いて、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのコレクションのパフォーマンスのためのステップバイステップの手順を提供します。重要なことは、提示された方法は、組織およびミトコンドリアの最小量を必要とします。一度習得し、本明細書に記載の技術は、研究者が一般的に使用される動物モデルにおいてミトコンドリアの酸素消費量に対する化合物または遺伝子産物の潜在的なメカニズムを決定することを可能にします。

骨格筋のミトコンドリアの主な生理学的役割は、酸化的リン酸化1からATPを生成することです。重要なのは、骨格筋のミトコンドリアは3、変性疾患4及びII型糖尿病5老化 、運動能力2に特異的な役割を果たしています。高齢化社会、およびII型糖尿病、米国6における死亡の7 番目の主要な原因であるとして、ミトコンドリアの機能を評価する方法の必要性は、生物医学研究7,8でますます普及しています。それは酸化的リン酸化9の機能構成要素を表現するために、ミトコンドリアおよび核ゲノム間の協調機能を表しているので具体的には、酸素消費量の測定は、ミトコンドリア機能の評価に非常に優れた有用性を有します。 いくつかの技術は、それが無傷の細胞に酸素消費量の測定を可能にし、単離存在しますDミトコンドリア7-10。さらに、アッセイは、複数の細胞型や組織のために開発され、ミトコンドリア経路および呼吸制御9,11,12の測定を可能とする様々な種にされています。しかし、マイクロプレートベースの酸素消費技術で使用するために、マウスの骨格筋から単離したミトコンドリアを用いて、これらのアッセイのすべてのコンパイルに関しては文献でvoid現在があります。重要なことは、マイクロプレートベースの呼吸アッセイの使用は、ミトコンドリアの生物学者の間で成長しており、単離ミトコンドリア9の最小量を用いて、高スループットの測定を可能にしています。したがって、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのコレクションは、異常および/または適応が電子伝達鎖（ETC）で発生することができる場所の特定することができ、その開発されました。さらに、2つの付加的なマイクロプレートベースのアッセイは、呼吸協調betweeの評価を可能に開発されましたトリカルボン酸（TCA）回路やETC、およびSS-酸化との間などのn重要なことは、提示される方法は、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア機能のメカニズムの変化を測定するための明確で簡潔な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>スクロース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>RT</td></tr><tr><td>D-マンニトール</td>に保管 <td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>RTに保管</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性、最小99.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td>RTに保管</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物、ACS試薬、99.0-102.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>RT</td></tr><tr><td>HEPESに保管 最低99.5%滴定</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>RT</td></tr><tr><td>EGTA</td>の店舗 <td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>RT</td></tr><tr><td>Essentially Fatty&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A6003</td><td>4 &degで保存;C</td></tr><tr><td>酸フリー-BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸、98%</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>107360</td><td>4°Cで保管。C</td></tr><tr><td>コハク酸</td><td>シグマ Aldrich</td><td>S9512</td><td>RT</td></tr><tr><td>L(-) リンゴ酸、BioXtra、&ge;95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>RT</td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td>に保存 <td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>RT</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-テトラメチル-p-フェニレンジアミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td> RT <td></td></tr><tr><td>99%に保存、粉末 [TMPD]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パルミトイルL-カルニチン塩化</td>物 <td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>-20°Cで保存;C</td></tr><tr><td>オリゴマイシン A, &ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>-20 °C で保存;C</td></tr><tr><td>シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>2 - 8 &deg;C</td></tr><tr><td>フェニルヒドラゾン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge;98%(TLC)、粉末[FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces sp.由来のアンチマイシンA。</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A8674</td><td>-20 &deg;C</td></tr><tr><td>アデノシン 5&prime;-二リン酸一カリウム塩脱水 [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>-20 °C;C</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>R8875</td><td>RT</td></tr><tr><td>ピアス&トレードの店舗。BCAタンパク質アッセイキット&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>該当なし</td></tr></tbody></table>

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

骨格筋のミトコンドリアは、多くの疾患の病理において特定の役割を果たします。そのため、この組織のミトコンドリア機能の指標としての酸素消費量の測定がより一般的になっています。さまざまな細胞、組織、種のミトコンドリア呼吸経路を測定する多くの技術やアッセイが存在しますが、マウス骨格筋から単離されたミトコンドリアをマイクロプレートベースの技術で使用するこれらのアッセイの編集に関しては、現在文献に空白があります。重要なことに、マイクロプレートベースの呼吸測定アッセイの使用は、最小限の単離されたミトコンドリアを使用してハイスループット測定を可能にするため、ミトコンドリア生物学者の間で増加しています。したがって、一般的に使用される動物モデルにおける酸素消費の機構的変化/適応を評価できるマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションが開発されました。本明細書に提示する方法は、最適な量のミトコンドリアタンパク質および試薬を用いてこれらのアッセイを実施するための段階的な指示を提供し、各アッセイのダイナミックレンジにわたる最小のばらつきによって証明されるように高い精度を提供します。

提示された方法は、マウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用したマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションの性能について、段階的な指示を提供します。これらのアッセイは、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア酸素消費量の機構的変化/適応を測定することができます。

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

本実験の全体的な目的は、マイクロプレートベースの酸素消費測定技術を用いて、電子伝達系、TCAサイクル、β酸化経路、および基質輸送体の機能を評価することです。まず、アッセイ用の基質溶液および注入溶液を調製します。次に、あらかじめ水和させたTricアッセイカートリッジに注入溶液を加え、酸素消費測定機のキャリブレーションを行います。次に、ミトコンドリア基質溶液を調製し、これらの溶液を細胞培養プレートに充填します。レスピロメトリックアッセイ装置にプレートをロードする前に、細胞培養プレートを遠心分離し、ミトコンドリアをプレートのウェルに接着させます。これにより、各レスピロメトリックアッセイにおけるミトコンドリア呼吸に基づく酸素消費率を示す装置の結果が得られます。クラーク電極などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、マイクロプレートベースの技術により、より少量のミトコンドリアで効率的かつ高スループットに酸素消費量を測定できることです。一般的に、この手法に不慣れな人は、アッセイ用溶液の調製に伴う多くの操作手順に苦労することがあります。実験前夜に、37 °Cの非CO2インキュベーター内で、トリカートリッジを1 mLの校正液で水分補給（ハイドレーション）しておきます。翌日、凍結したストックをすべて取り出し、37 °Cのウォーターバスまたはインキュベーターで融解させます。すべての基質溶液および注入溶液を調製し、氷上で保存します。次のステップは、マルチウェル酸素消費量測定装置に、適切な混合速度および測定パラメータをプログラムすることです。解析ソフトウェアを起動し、標準モードを選択します。seahorseゲストフォーラムに入り、アッセイウィザードをクリックします。アッセイウィザード内で「プロトコル」をクリックし、ミックス重量と測定パラメータを変更します。「back correction」タブで背景 wells にラベルを付け、必ずハイライトしてください。その後、背景補正を行います。まず「groups and labels」タブをクリックし、次に「group info」タブをクリックして、条件にラベルを付けてください。これらのパラメータを入力した後、「end」をクリックし、次に「save template」をクリックします。この手順を開始するには、注入溶液をアッセイランカートリッジにロードしてください。溶液を適切なポートに注入するように注意してください。アッセイランカートリッジを、切り欠きのある角が左下になるように装置にロードします。まず解析ソフトウェアを起動し、次にスタンダードモードに入ることでキャリブレーションを開始します。Seahorseゲストフォーラムに入力してください。XF Driveのtemplatesタブにある保存済みテンプレートを開きます。開いた後、[start]をクリックしてキャリブレーションを開始してください。これには約30分かかります。本手順で使用するミトコンドリアは、赤色骨格筋から単離したものです。ミトコンドリア基質ストックを、先端を約3 mmカットした200 µLピペットチップで溶液を穏やかに撹拌するように混ぜ合わせ、丁寧かつ十分に混合させます。ミトコンドリアストックのタンパク質濃度を決定した後、コハク酸などの基質ミックス200 µLあたり10 µgのミトコンドリアタンパク質を再懸濁します。200 µLピペットチップの先端を約3 mm切り落としたもので、溶液を穏やかに、かつ十分に攪拌して、ミトコンドリア基質溶液を混合します。同様の方法で、残りの各基質ミックス200 µLあたり14 µgのミトコンドリアタンパク質を再懸濁します。すべてのミトコンドリアタンパク質基質ミックスを氷上に置きます。24ウェル細胞培養プレートを氷上に置き、各ミトコンドリア基質ミックスを1ウェルあたり50 µLずつ、3連（triplicate）で分注します。マイクロプレートベースのtricアッセイの開発者は、ミトコンドリアを含まないブランクウェルを少なくとも2つ、できれば細胞培養プレートの両端に設けることを推奨しています。プレートを回転させながら、ミトコンドリアをウェルに接着させるため、4 °Cで2000 Gにて20分間遠心分離します。基質溶液を37°Cのウォーターバスで温めておきます。スピンが完了後、各ウェルの上にそれぞれの基質溶液を450 µLずつ慎重に分注します。プレートの分注は室温で行ってください。ブランクウェルに基質ブランクを500 µL分注します。電子伝達系アッセイ用のウェルには電子伝達系基質を、カップリングアッセイのブランクウェルには任意のカップリングアッセイ基質を分注してください。各ウェルに450 µLの基質を添加した後、20倍の倍率でウェル内のミトコンドリア層を観察し、ミトコンドリアが単層で均一に分散していることを確認します。この例で示されているように、単層が均一に分布していないように見えるイメージウェルは、oc後に除外することができます。ミトコンドリアの接着を確認した後、細胞培養プレートをRespir metricアッセイ装置にセットしてください。「OK」をクリックします。装置によって、先ほどのキャリブレーションに使用したユーティリティプレートが排出されます。ユーティリティプレートを取り除き、ミトコンドリアを含む細胞培養プレートをトレイに設置してください。細胞培養プレートの青い切り欠きが、トレイの左下隅に来るように配置します。「continue」をクリックしてアッセイを開始してください。所要時間は約40分です。ランが完了したら、画面上の「eject」を押してセルカルチャープレートを排出します。プレートが排出されたら、セルカルチャープレートとカートリッジを取り出し、廃棄してください。画面上の「continue」をクリックします。ランはデータファイルにXLSファイルとして自動的に保存されます。このファイルを開き、「Y1」マーカーの下にある下向き矢印をクリックして、表示をO2からOCRに変更します。次に、表示される速度データのオプションから、中間点（middle point）を点対点速度（point to point rates）に変更します。「OK」をクリックしてください。これらの変更を適用するために、画面左下のウェルグループモード（well group mode）タブをクリックし、同様の条件のウェルをグループ化します。最後に、画面中央左側にある「sample mean standard error」タブをクリックします。これらのコマンドは、アッセイ前に設定しておくことも可能です。これらのトレースは、4つのカップリングアッセイにおける酸素消費速度（OCR）の時間的経過を示しています。最初のパネルは、DP（脱共役剤）が存在しない状態での呼吸、すなわち状態2呼吸を示しています。DP注入後の2番目のパネルは、最大共役呼吸（状態3呼吸とも呼ばれる）を示しています。オリゴマイシン注入後の3番目のパネルは、プロトンリークによる呼吸（状態4oh呼吸とも呼ばれる）を示しています。FCCP注入後の4番目のパネルは、State 3 U呼吸とも呼ばれる最大脱共役呼吸を示しています。アンチマイシンA注入後の5番目のパネルは、酸化的な呼吸の阻害を示しています。ミトコンドリアストックおよびミトコンドリア基質混合液を十分に混合し、接着スピン後にミトコンドリアが単層となったため、すべてのミトコンドリア状態において標準偏差は最小限に抑えられています。対照的に、各ウェルに不均等な量のミトコンドリアを負荷し、単一のモノレイヤーを形成できなかった場合、青色のトレースで示されるように、各状態における標準偏差が増大します。このトレースでは、OCR値が1,500 nmol O₂/minを超えており、また点間レート値の低下に例示されるように、測定期間を通じて呼吸速度が低下しています。一方、赤色のトレースでは点間レートが安定しており、最大OCR値は1,500 nmol O₂/min未満であることに注目してください。また、ミトコンドリアタンパク質の過負荷は、ウェルのマイクロチャンバー内の酸素枯渇を招く可能性があり、その結果、青色のトレースで示されるように、測定期間中にO₂値がゼロに近づき、また連続する測定後の開始O₂値が著しく減少するため、各測定における正確なOCR測定が妨げられます。この手順を行う際は、ミトコンドリアと基質溶液を混合させる際に忍耐強く取り組むことが重要です。これらの手法を習得すれば、ある特定の基質輸送体を標的とした薬物治療がミトコンドリアの酸素消費にどのように影響するかなど、さらなる疑問を解決するための追加実験を行うことができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このプロトコルは、骨格筋から単離したミトコンドリアの呼吸を研究するための手順を説明します。このメソッドは、Scorranoから翻案されました...

骨格筋からのミトコンドリア単離

単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む...

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。...

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

ここでは、以前に報告された方法の修正版を提示し、少量のマウス骨格筋から高品質で精製されたミトコンドリアを分離することを可能にします。この手順により、マイクロプレートベースの呼吸器アッセイ中に高機能で呼吸する高度に結合したミトコンドリアが得られます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

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高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。...

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

ここでは、ヒトまたはマウスの筋肉から採取した新鮮な透過性骨格筋線維におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化を測定するための包括的な方法について説明します。この方法により、ミトコンドリア呼吸のリアルタイム定量化と、既存のミトコンドリアネットワークと膜の完全性を維持しながら、燃料の好みと代謝の柔軟性の評価が可能になります。...

高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

ミトコンドリアの生体エネルギーおよびメタボローム研究により、多くの疾患におけるミトコンドリアの多面的な役割が明らかになっていますが、これらのオルガネラの単離方法はさまざまです。ここで詳述する方法は、複数の組織源から高品質のミトコンドリアを精製することができます。品質は、高解像度呼吸測定で評価される呼吸制御比やその他の指標によって決定されます。...

げっ歯類の心臓組織からの堅牢なミトコンドリア単離 

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。...

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

この研究では、ゼブラフィッシュの幼生に対してEvans Blue Dye(EBD)分析を行う簡単な方法について説明します。...

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

学ぶマイクロプレート呼吸測定法でマウス骨格筋由来ミトコンドリアの酸素消費を評価する方法です。電子伝達系とTCA回路の機能解析に適し、少量試料で高スループットな代謝研究が可能となります。

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

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