ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

次の実験の全体的な目標は、マイクロプレートベースの酸素消費技術を使用して、電子伝達鎖、TCAサイクルベータ酸化経路、および基板トランスポーターの機能を評価することです。これは、まずアッセイ用の基質と注入溶液を調製することによって達成されます。2番目のステップは、以前に水和したtricアッセイカートリッジに注入溶液を追加して、酸素消費マシンを校正することです。

次に、ミトコンドリア基質溶液を調製し、これらの溶液を細胞培養プレートにロードします。細胞培養プレートを回転させて、プレートがプレートに付着するのを十分に確認してから、プレートをRespiraメトリックアッセイにロードします。各レスピロメトリックアッセイのミトコンドリア呼吸に基づく酸素消費率を示す装置の結果が得られます。

クラーク電極のような既存の方法上のこの技術の主な利点は、マイクロプレートベースの技術がミトコンドリアの少量で酸素消費のより効率的で高スループットの獲得を可能にすることであり、一般的にこの方法に新しい個人は、アッセイのための溶液を準備することに関与するすべての可動部品のために苦労します実験の前の夜に、非のキャリブレーション溶液の1ミリリットルの水和物アッセイカートリッジ翌日、摂氏37度のCO2インキュベーターで、凍結した茎をすべて取り出し、摂氏37度の浴またはインキュベーターで解凍します。すべての基質溶液と注入溶液を調製し、氷上に保存します。次のステップは、マルチウェル酸素消費量測定機を適切な混合重量にプログラムし、パラメータを測定することです。

解析ソフトウェアに入り、標準モードを選択します。タツノオトシゴのゲストフォーラムにアクセスし、アッセイウィザードをクリックします。アッセイウィザードに入ったら、プロトコルをクリックして、ミックスウェイトと測定パラメーターを変更します。

背面修正タブの下の背景ウェルにラベルを付け、必ず強調表示してください。背景補正を行います。条件にラベルを付けるには、最初に [グループとラベル] タブをクリックし、次に [グループ情報] タブをクリックします。

これらのパラメータを入力したら、endをクリックし、続いてsave templateをクリックします。この手順を開始するには、注入溶液をアッセイランカートリッジにロードします。溶液を適切なポートに注入するように注意してください。

アッセイランカートリッジを、左下に切り欠きのある角でマシンにロードします。キャリブレーションを開始するには、まず解析ソフトウェアを起動し、次に標準モードに入ります。タツノオトシゴのゲストフォーラムに参加してください。

保存したテンプレートを XF Drive の [テンプレート] タブで開きます。開いたら、[開始]をクリックしてキャリブレーションを開始します(これには約30分かかります)。この手順のためのミトコンドリアは、赤骨格筋から分離され、ミトコンドリア基質ストックを穏やかに攪拌することにより、穏やかに、しかし完全に混合し、その端部の約3ミリメートルを切り取った200マイクロリットルのピペットチップで溶液を繰り返すことによって

ミトコンドリアストックのタンパク質濃度を決定した後、コハク酸腐敗既知の基質混合物の200マイクロリットルあたり10マイクログラムのミトコンドリアタンパク質を懸濁します。ミトコンドリア基質溶液を、同じように端部の約3ミリメートルを切り取った200マイクロリットルのピペットチップで溶液を穏やかに攪拌しながら、穏やかに、しかし完全に混合します。リースバンド、残りの各基質混合物の200マイクロリットルあたり14マイクログラムのミトコンドリアタンパク質は、すべてのミトコンドリアタンパク質基質混合物を氷上に置きます。

24ウェルの細胞培養プレートを氷上に配置し、各ミトコンドリア基質混合物のウェルあたり50マイクロリットルを三重にロードします。マイクロプレートベースのtricアッセイの開発者は、ミトコンドリアのないブランクウェルを最低2つ、できれば細胞培養プレートの両側に残すことを推奨しています。細胞培養プレートを2000Gで4°Cで20分間回転させ、プレートが回転している間にミトコンドリアをウェルに接着します。

基質溶液を摂氏37度の水浴で温めます。スピンが完了したら、各基質溶液の450マイクロリットルをそれぞれのウェルの上に慎重にロードします。プレートは必ず室温でセットしてください。

ブランクウェルに500マイクロリットルの基質ブランクをロードします。電子フローアッセイ用に指定されたウェルには電子フロー基質をロードする必要がありますが、結合アッセイブランクウェルには任意のカップリングアッセイ基質をロードできます。それぞれに450マイクロリットルの基質を添加した後、ウェル内のミトコンドリアの層を20倍の倍率でよく観察し、ミトコンドリアが単一の単層に均一に分散していることを確認します。

この例に示すように、単層が均等に分布していないように見える画像ウェルは、OC後に除去できます。ミトコンドリアの付着を確認した後、細胞培養プレートをRespir metric assay装置に持って行きます。[OK]をクリックします。

マシンは、以前にキャリブレーションに使用したユーティリティプレートを排出します。ユーティリティプレートを取り外し、ミトコンドリアが入っている細胞培養プレートをトレイに置きます。細胞培養プレートの青いノッチは、トレイの左下隅に配置する必要があります。

「continue」をクリックすると、アッセイの実行が開始されます(所要時間は約 40 分です)。実行が完了したら、画面上のイジェクトを押して細胞培養プレートをイジェクトします。プレートが排出されたら、細胞培養プレートとカートリッジを取り外して廃棄します。

画面上の[続行]をクリックします。実行は、データファイルにXLSファイルとして自動的に保存されます。このファイルを開き、Y oneマーカーの下の下向き矢印を押して、表示をO2からOCRに変更します。

次に、オプションとして表示されるレートデータの下のポイントツーポイントレートを中央ポイントからポイントに変更します。[OK]をクリックします。これらの変更を適用するには、画面の左下にあるウェルグループモードタブをクリックして、同様の条件のウェルをグループ化します。

最後に、画面の中央、左側にあるサンプル平均標準誤差タブをクリックします。これらのコマンドは、アッセイの前に設定することもできます。これらのトレースは、4つのカップリングアッセイの酸素消費率またはOCRと時間の関係を表しています。

最初のパネルは、状態 2、呼吸、または DP がない場合の呼吸を表します。A DPの注入後の2番目のパネルは、状態3呼吸とも呼ばれる最大結合呼吸を表します。オリゴマイシン注入後の3枚目のパネル。Aは陽子漏れによる呼吸を表し、状態4 oh呼吸とも呼ばれます。

FCCP の注入後の 4 番目のパネルは、状態 3 U 呼吸とも呼ばれる最大非結合呼吸を表します。アンチマイシンAの注射後の5番目のパネルは、酸化的呼吸の阻害を表しています。すべてのミトコンドリアの状態は、ミトコンドリアストックとミトコンドリア基質の混合物の徹底的な混合と、接着スピン後のミトコンドリアの単一単層の達成により、最小の標準偏差を持っています。

対照的に、各ウェルに不均等なミトコンドリアをロードし、ミトコンドリアの単一の単層を達成しないと、毎分1,500オールを超えるOCR値を示す青色のトレースで示されるように、各状態で標準偏差が増加します、また、測定期間の過程で呼吸数が減少しますポイントツーポイントレート値の低下によって例示されます。赤のトレースは、一貫したポイントツーポイントレートを示し、最大OCR値は1,500オーレ/分未満であることに注意してください。ミトコンドリアタンパク質の過負荷は、ウェルのマイクロチャンバー内の酸素の枯渇にもつながり、測定期間中にO2値がゼロに近づくことを示すブルートレースで示されるように、連続する各測定のOCRの正確な測定を妨げる可能性があります。

この手順を試みる際には、ミトコンドリアと基質溶液を混合する際に患者がいることを覚えておくことが重要です。これらの方法を習得すると、特定の基質トランスポーターの薬物標的治療がミトコンドリアの酸素消費にどのように影響するかなどの追加の質問に答えるために、追加の実験を変形させることができます。