ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

本実験の全体的な目的は、マイクロプレートベースの酸素消費測定技術を用いて、電子伝達系、TCAサイクル、β酸化経路、および基質輸送体の機能を評価することです。まず、アッセイ用の基質溶液および注入溶液を調製します。次に、あらかじめ水和させたTricアッセイカートリッジに注入溶液を加え、酸素消費測定機のキャリブレーションを行います。

次に、ミトコンドリア基質溶液を調製し、これらの溶液を細胞培養プレートに充填します。レスピロメトリックアッセイ装置にプレートをロードする前に、細胞培養プレートを遠心分離し、ミトコンドリアをプレートのウェルに接着させます。これにより、各レスピロメトリックアッセイにおけるミトコンドリア呼吸に基づく酸素消費率を示す装置の結果が得られます。

クラーク電極などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、マイクロプレートベースの技術により、より少量のミトコンドリアで効率的かつ高スループットに酸素消費量を測定できることです。一般的に、この手法に不慣れな人は、アッセイ用溶液の調製に伴う多くの操作手順に苦労することがあります。実験前夜に、37 °Cの非CO2インキュベーター内で、トリカートリッジを1 mLの校正液で水分補給（ハイドレーション）しておきます。翌日、凍結したストックをすべて取り出し、37 °Cのウォーターバスまたはインキュベーターで融解させます。すべての基質溶液および注入溶液を調製し、氷上で保存します。次のステップは、マルチウェル酸素消費量測定装置に、適切な混合速度および測定パラメータをプログラムすることです。

解析ソフトウェアを起動し、標準モードを選択します。seahorseゲストフォーラムに入り、アッセイウィザードをクリックします。アッセイウィザード内で「プロトコル」をクリックし、ミックス重量と測定パラメータを変更します。

「back correction」タブで背景 wells にラベルを付け、必ずハイライトしてください。その後、背景補正を行います。まず「groups and labels」タブをクリックし、次に「group info」タブをクリックして、条件にラベルを付けてください。

これらのパラメータを入力した後、「end」をクリックし、次に「save template」をクリックします。この手順を開始するには、注入溶液をアッセイランカートリッジにロードしてください。溶液を適切なポートに注入するように注意してください。

アッセイランカートリッジを、切り欠きのある角が左下になるように装置にロードします。まず解析ソフトウェアを起動し、次にスタンダードモードに入ることでキャリブレーションを開始します。Seahorseゲストフォーラムに入力してください。

XF Driveのtemplatesタブにある保存済みテンプレートを開きます。開いた後、[start]をクリックしてキャリブレーションを開始してください。これには約30分かかります。本手順で使用するミトコンドリアは、赤色骨格筋から単離したものです。ミトコンドリア基質ストックを、先端を約3 mmカットした200 µLピペットチップで溶液を穏やかに撹拌するように混ぜ合わせ、丁寧かつ十分に混合させます。

ミトコンドリアストックのタンパク質濃度を決定した後、コハク酸などの基質ミックス200 µLあたり10 µgのミトコンドリアタンパク質を再懸濁します。200 µLピペットチップの先端を約3 mm切り落としたもので、溶液を穏やかに、かつ十分に攪拌して、ミトコンドリア基質溶液を混合します。同様の方法で、残りの各基質ミックス200 µLあたり14 µgのミトコンドリアタンパク質を再懸濁します。すべてのミトコンドリアタンパク質基質ミックスを氷上に置きます。

24ウェル細胞培養プレートを氷上に置き、各ミトコンドリア基質ミックスを1ウェルあたり50 µLずつ、3連（triplicate）で分注します。マイクロプレートベースのtricアッセイの開発者は、ミトコンドリアを含まないブランクウェルを少なくとも2つ、できれば細胞培養プレートの両端に設けることを推奨しています。プレートを回転させながら、ミトコンドリアをウェルに接着させるため、4 °Cで2000 Gにて20分間遠心分離します。

基質溶液を37°Cのウォーターバスで温めておきます。スピンが完了後、各ウェルの上にそれぞれの基質溶液を450 µLずつ慎重に分注します。プレートの分注は室温で行ってください。

ブランクウェルに基質ブランクを500 µL分注します。電子伝達系アッセイ用のウェルには電子伝達系基質を、カップリングアッセイのブランクウェルには任意のカップリングアッセイ基質を分注してください。各ウェルに450 µLの基質を添加した後、20倍の倍率でウェル内のミトコンドリア層を観察し、ミトコンドリアが単層で均一に分散していることを確認します。

この例で示されているように、単層が均一に分布していないように見えるイメージウェルは、oc後に除外することができます。ミトコンドリアの接着を確認した後、細胞培養プレートをRespir metricアッセイ装置にセットしてください。「OK」をクリックします。

装置によって、先ほどのキャリブレーションに使用したユーティリティプレートが排出されます。ユーティリティプレートを取り除き、ミトコンドリアを含む細胞培養プレートをトレイに設置してください。細胞培養プレートの青い切り欠きが、トレイの左下隅に来るように配置します。

「continue」をクリックしてアッセイを開始してください。所要時間は約40分です。ランが完了したら、画面上の「eject」を押してセルカルチャープレートを排出します。プレートが排出されたら、セルカルチャープレートとカートリッジを取り出し、廃棄してください。

画面上の「continue」をクリックします。ランはデータファイルにXLSファイルとして自動的に保存されます。このファイルを開き、「Y1」マーカーの下にある下向き矢印をクリックして、表示をO2からOCRに変更します。

次に、表示される速度データのオプションから、中間点（middle point）を点対点速度（point to point rates）に変更します。「OK」をクリックしてください。これらの変更を適用するために、画面左下のウェルグループモード（well group mode）タブをクリックし、同様の条件のウェルをグループ化します。

最後に、画面中央左側にある「sample mean standard error」タブをクリックします。これらのコマンドは、アッセイ前に設定しておくことも可能です。これらのトレースは、4つのカップリングアッセイにおける酸素消費速度（OCR）の時間的経過を示しています。

最初のパネルは、DP（脱共役剤）が存在しない状態での呼吸、すなわち状態2呼吸を示しています。DP注入後の2番目のパネルは、最大共役呼吸（状態3呼吸とも呼ばれる）を示しています。オリゴマイシン注入後の3番目のパネルは、プロトンリークによる呼吸（状態4oh呼吸とも呼ばれる）を示しています。

FCCP注入後の4番目のパネルは、State 3 U呼吸とも呼ばれる最大脱共役呼吸を示しています。アンチマイシンA注入後の5番目のパネルは、酸化的な呼吸の阻害を示しています。ミトコンドリアストックおよびミトコンドリア基質混合液を十分に混合し、接着スピン後にミトコンドリアが単層となったため、すべてのミトコンドリア状態において標準偏差は最小限に抑えられています。

対照的に、各ウェルに不均等な量のミトコンドリアを負荷し、単一のモノレイヤーを形成できなかった場合、青色のトレースで示されるように、各状態における標準偏差が増大します。このトレースでは、OCR値が1,500 nmol O₂/minを超えており、また点間レート値の低下に例示されるように、測定期間を通じて呼吸速度が低下しています。一方、赤色のトレースでは点間レートが安定しており、最大OCR値は1,500 nmol O₂/min未満であることに注目してください。また、ミトコンドリアタンパク質の過負荷は、ウェルのマイクロチャンバー内の酸素枯渇を招く可能性があり、その結果、青色のトレースで示されるように、測定期間中にO₂値がゼロに近づき、また連続する測定後の開始O₂値が著しく減少するため、各測定における正確なOCR測定が妨げられます。

この手順を行う際は、ミトコンドリアと基質溶液を混合させる際に忍耐強く取り組むことが重要です。これらの手法を習得すれば、ある特定の基質輸送体を標的とした薬物治療がミトコンドリアの酸素消費にどのように影響するかなど、さらなる疑問を解決するための追加実験を行うことができます。