単離されたミトコンドリアのカルシウム保持能力の決定

神経芽細胞腫細胞から単離したミトコンドリアを、膜不透過性のカルシウム結合蛍光色素を含む緩衝液に入れます。

ミトコンドリアがバッファー内で安定するようにインキュベートします。

カルシウム含有バッファーを加え、振とうしながらインキュベートします。

カルシウムイオンは色素分子に結合し、色素分子の蛍光を引き起こします。

蛍光分光計を使用して、色素の蛍光をリアルタイムで監視します。

次に、カルシウム含有バッファーを一定の間隔で注入します。

カルシウム濃度の増加はミトコンドリアカルシウムの取り込みを促進し、色素に結合できる遊離カルシウムイオンを減少させ、その結果、蛍光が低下します。

ミトコンドリアが最大のカルシウム貯蔵能力に達すると、さらにカルシウムが添加されると、ミトコンドリア透過性遷移孔 (mPTP) の開放が引き起こされます。

この細孔開口部は、ミトコンドリアから緩衝液にカルシウムを放出し、そこで色素に結合して蛍光の増加を引き起こします。

ミトコンドリアのカルシウム保持能力を反映する、mPTP開口を誘導するために必要なカルシウムの総量を決定します。

塩化カリウム培地を調製し、実験前にカルシウム結合緑色蛍光色素を最終濃度0.5マイクロモルまで添加します。ミトコンドリアカルシウム保持能力を決定するには、まず、0.5マイクロモルのカルシウム結合緑色蛍光色素を含む塩化カリウム培地中の単離ミトコンドリア1ミリリットルを6ウェルプレートの各ウェルに移します。

トコンドリアを6ウェルプレートのカルシウム結合緑色蛍光色素中で室温でインキュベートします。周囲の光から1分間保護します。インキュベーション後、4マイクロリットルの20ミリモル塩化カルシウム溶液を6ウェルプレートの各ウェルに加え、自動分注設定を使用して、ミトコンドリアタンパク質ミリグラムあたり200ナノモルのカルシウムを導入します。

蛍光分光計を使用して、3秒ごとに蛍光の変化を2分間監視し、励起波長は506ナノメートル、発光波長は531ナノメートルです。プレートには、読み取りの間に 600 RPM で 3 秒間振とう機能があり、ソフトウェアによって制御されます。20ミリモルの塩化カルシウム溶液の4マイクロリットルのアリコートを各ウェルに追加し、3秒ごとに蛍光の変化を2分間監視します。