細胞接触部でのタンパク質相互作用を研究するための蛍光変動分光法

隣接する細胞表面のタンパク質によって媒介される細胞間相互作用は、蛍光ゆらぎ分光法アッセイを使用して生細胞で研究できます。

まず、接着受容体(膜貫通タンパク質)を発現する別々の細胞培養物を取ります。2つの集団の細胞内の受容体は、スペクトル的に分離された蛍光タンパク質で標識されています。これらの蛍光標識は受容体の細胞質領域に存在し、細胞間相互作用への干渉を防ぎます。

培地を廃棄し、トリプシンを加えると、細胞の剥離が促進されます。2つの細胞集団を混合してインキュベートし、隣接する細胞の受容体が相同型のトランス相互作用を形成できるようにします。

細胞を共焦点顕微鏡下に置きます。適切な波長のレーザー光源を使用してサンプルを照らし、両方の蛍光標識から発光させます。異なる色の蛍光シグナルが接触している2つの隣接する細胞を見つけます。

両方の蛍光標識のスペクトルチャネルを使用して、接触している細胞膜の領域に垂直なラインスキャンを取得します。レーザーは、少量のサンプル、つまり検出量に焦点を合わせます。蛍光標識受容体が検出ボリュームに出入りすると、蛍光強度が変動します。

隣接する細胞の受容体が相互作用しない場合、それらは個別に移動し、相互相関が低く蛍光強度に独立した変動をもたらします。

接触している隣接する細胞が受容体を介して相互作用すると、相互作用するタンパク質が一緒に拡散し、蛍光強度に相関的な変動が生じます。

1つのウェルの細胞溶液を対応するウェルに移します。上下に数回ピペッティングして穏やかに混合し、35ミリリットルのガラス底皿に混合細胞を播種し、播種した細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で1日培養します。

レーザー走査型共焦点顕微鏡ソフトウェアで、光路を設定します。スペクトルクロストークを回避するには、mEGFPまたはmEYFPとmCherryまたはmCardinalを順番に励起および検出する2つの別々のトラックを選択し、「Switch Tracks Every Line」を選択します。検出には、両方のチャネルに適切なフィルターを使用します。

混合細胞を含む皿をサンプルホルダーに置きます。温度平衡を確保し、焦点のドリフトを減らすために10分間待った後、「検索」メニューの透過光を使用してセルに焦点を合わせます。互いに接触している「赤」と「緑」のセルのペアを検索します。

次に、「切り抜き」ボタンを使用して、細胞間接触に垂直なスキャンパスを選択します。「ズーム」で50〜200ナノメートルの画素サイズにし、「スキャンモード」で「ライン」を選択します。「フレームサイズ」を128×1ピクセルに設定します。「スキャン速度」を最大許容値に設定し、サイクルを100,000〜500,000に設定します。

これに続いて、適切なレーザー出力を選択します。検出器を「フォトンカウンティング」モードに設定します。「実験開始」を押して取得を開始します。