共焦点顕微鏡を明らかに細胞表面受容体画像相関分光法による凝集
2018年8月2日
ターゲット細胞表面受容体に結合する抗体は、コンフォメーションとクラスタ リングの変化を与えることができます。これらの動的な変更には、標的細胞で医薬品開発を特徴付けるための含意があります。このプロトコルは、共焦点顕微鏡、細胞表面の受容体の程度を定量化する ImageJ/フィジーから画像相関分光法を利用しています。
この画像相関分光法プロトコルの全体的な目標は、細胞表面で発生するクラスタリングイベントの定量化のためのアクセス可能な方法論を提供することです。細胞表面で受容体に結合する抗体は、確認とクラスタリングの変化を与えることができます。これらの動的プロセスの解析は、創薬標的の特性評価に重要です。
この手法の主な利点は、簡単にアクセスできるイメージング装置を使用して、細胞表面でのクラスタリングイベントを定量化するためのアクセス可能な方法論を提供することです。まず、10, 000個のA431表皮がん細胞を8チャンバーイメージングスライドの各ウェルに播種します。翌日、EGF受容体の凝集を刺激するために、EGFリガンドの1ミリリットルあたり100ナノグラムを細胞に直ちに追加します。
細胞をリガンドと室温で10分間インキュベートしてから、固定します。次に、付属のテキストプロトコルの免疫細胞化学および共焦点イメージプロトコールに従い、収集中に使用される設定に細心の注意を払いながら、取得したデータセットをフィジーにロードします。飽和状態は避ける必要があります。
最終的な画像には、1 ミクロン四方未満のピクセル サイズが含まれている必要があります。さらに、頂端表面または基底表面の平坦な表面と、後でサンプルを標準化するために無細胞領域を捕捉します。まず、最初の画像で関心のある細胞の頂端または基底細胞表面膜領域を特定します。
256 x 256、128 x 128、または 64 x 64 の範囲で 2 から n のピクセル サイズを選択します。次に、画像メニューに移動し、[複製]を選択します。次に、分析に進み、測定に進みます。
トリミングされた対象領域の平均強度を計算します。次に、元の画像と同じサイズの背景領域を特定します。前と同じように複製します。
そして、背景にトリミングされた関心領域の平均強度を計算します。関心領域と背景の両方を測定したら、[処理]に移動し、[画像計算機]を選択します。対象領域を画像 1 として、背景画像を画像 2 として配置し、操作として減算を選択します。
次に、プロセスメニューに移動します。FFTに進み、FD数学を選択します。[FFT math] ダイアログ ボックスで、ここに示すように [enter the images] を選択し、操作を [correlate] に設定します。
逆変換がオンになっていることを確認します。結果の画像を正規化するには、プロセスを選択し、数学まで下にスクロールし、除算を選択し、ダイアログボックスに合計ピクセル数を入力します。次に、正規化されたトリミングされた領域の平均強度を 2 乗して再度正規化します。
次に、ポイントスプレッド関数を通じて線を引きます。この線のプロファイルをプロットしてピーク値を計算するには、分析に移動し、プロットプロファイルを選択します。ビーム面積あたりのクラスター数を計算するには、ピーク値をスプレッドシートに転写します。
次に、ビーム面積あたりのクラスターを、ピーク値から 1 を引いた値に対して 1 に等しくなるように設定します。画像をバッチ処理するには、フィジーマクロを設定することをお勧めします。これにより、画像相関分光分析のための複数の共焦点画像の一貫性と迅速な分析が可能になります。
画像相関分光法のワークフローのマクロを確立するには、プロトコル内の各メニューコマンドを記録するようにプログラムを設定します。これを行うには、プラグインに移動し、marcosまで下がって、録音を選択します。次に、メイン ウィンドウに戻り、このビデオの前のセクションで説明したプロトコルを実行します。
終了したら、マクロ・ウィンドウに戻り、「作成」を選択してマクロを生成します。次に、マクロ編集ウィンドウで、言語をLJ1マクロとして選択してください。選択しない場合、プログラムは実行できません。
最後に、マクロを保存します。顕微鏡の光学伝達機能により、分子サイズの物体でもXY平面上に200〜300ナノメートルの画像として現れます。このプロトコルに記載されているように、細胞と同じ方法でサブ解像度のフレジンビーズをイメージングすることにより、顕微鏡の点像分布関数の面積を計算することができます。
これらの画像は、細胞表面EGF受容体を標的とするセツキシマブ一次抗体で標識された、EGF刺激され、シミュレートされていない付着性A431表皮がん細胞を表しています。黄色のボックスは、ピクセル寸法が 64 x 64 のクロップ領域を含む細胞膜を表しています。これらの画像を使用して、画像相関分光分析を行いました。
自己相関関数の正規化に続いて、線ツールを使用して点像分布関数を測定できます。このライン関数のプロファイルは、ピーク値を検出するためにプロットされます。これらの方法を用いて、EGF刺激は、刺激を受けていない細胞と比較して、ビーム面積当たりの検出EGFRクラスターの2.56倍減少を誘導することが観察された。
一度習得すれば、共焦点画像の分析は画像ごとに数分しかかかりません。この手順を試行する際には、このプロトコルで概説されている設定を使用して、すべての実験条件の複数の反復を収集することが重要です。この手順に続いて、画像相関分光法を拡張して、タイムラプス顕微鏡を使用して生細胞内のクラスタリングイベントの時間的変化を調べることができます。
開発後、この技術は、研究者が光漂白ICSを使用して高次の凝集状態を探索し、画像相互相関分光法を使用して2つの膜ベースのタンパク質の共局在化を行う道を開きました。このビデオを見れば、目的の細胞表面分子のクラスタリング状態を計算する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、画像相関分光法を用いて細胞表面での受容体クラスタリングを定量化するための方法論を概説しています。この技術は、薬物標的の特徴付けを理解する上で重要です。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 薬理学
背景
- 抗体は細胞表面受容体の構造変化を誘導する可能性があります。
- 受容体クラスタリングは薬物開発にとって重要です。
- 画像相関分光法はこれらのプロセスの詳細な分析を可能にします。
- アクセス可能なイメージング技術により、より広範な研究応用が容易になります。
研究目的
- 細胞表面でのクラスタリング事象を定量化すること。
- 研究者向けの信頼性の高いプロトコルを提供すること。
- 薬物標的における受容体ダイナミクスの理解を深めること。
使用方法
- 共焦点顕微鏡
- 画像相関分光法
- ImageJ/FIJIソフトウェアの使用
- EGFリガンドによる細胞播種と刺激
主要な結果
- 受容体クラスタリングの定量化を達成しました。
- EGFが受容体集合に与える影響を実証しました。
- 将来の研究のための明確な方法論を提供しました。
- 薬物開発における受容体ダイナミクスの重要性を強調しました。
結論
- このプロトコルは受容体クラスタリングの研究に効果的です。
- アクセス可能なイメージング方法は薬物標的研究を進歩させることができます。
- 受容体ダイナミクスの理解は薬理学的応用にとって重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying receptor aggregation on the cell surface provides critical insights into target engagement and mechanism of action for antibody-based therapeutics. This methodology enables preclinical assessment of receptor dynamics, supporting target validation and lead optimization by linking ligand-induced clustering to functional outcomes. Accessible confocal-based image correlation spectroscopy offers a scalable approach to de-risk therapeutic candidates through quantitative, reproducible measurements of membrane protein organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypothesis by quantifying ligand-induced receptor clustering as a functional readout of target engagement.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, reproducible assessment of receptor aggregation states using widely available confocal microscopy.
- Predictive Value: Provides quantitative data on receptor clustering that informs target confidence and portfolio triage decisions in early discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline receptor clustering metrics under controlled conditions.
- Reproducibility: Delivers quantitative, normalized outputs suitable for assay standardization and cross-laboratory comparability in target validation workflows.
- Scalability: Enables high-throughput analysis via Fiji macro automation, supporting consistent evaluation of compound effects on receptor dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses EGFR in A431 cells as a disease-relevant system to model receptor aggregation mechanisms applicable to oncology targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical validation by quantifying receptor dynamics that correlate with internalization and signaling outcomes.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects stem from receptor aggregation, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead identification, providing quantitative receptor clustering data that informs hit-to-lead progression and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring ligand-induced changes in receptor organization as a direct functional output of target modulation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts on receptor clustering that enable reliable comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Analytics: Generates normalized cluster density measurements per beam area, enabling statistical comparison of aggregation states under stimulated vs. basal conditions.
- Translational Research: Connects in vitro receptor dynamics to preclinical relevance by modeling EGFR aggregation mechanisms observed in tumorigenic cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline via Fiji macros, allowing consistent application across multiple targets and experimental settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct quantification of receptor clustering events.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined imaging parameters, normalization protocols, and automated macro-based analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target engagement metrics to functional receptor aggregation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on receptor dynamics that inform advancement decisions in preclinical pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, fluorescent immunocytochemistry, and image analysis using Fiji/ImageJ.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate laser lines and detectors for fluorophore excitation.
- Necessitates standardization of cell seeding density, ligand stimulation timing, and imaging settings across experimental replicates.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different receptor systems, cell types, or fluorescent labels beyond EGFR and cetuximab.
- Limited to fixed-cell analysis in this protocol; temporal dynamics in live cells would require additional validation and optimization for time-lapse applications.
