セル通信解析のための単一細胞のマイクロインジェクション

こんにちは、私の名前はアナエルです。私はオズワルド・クルス財団のセルラー・コミュニケーション研究所で働いています。ここでは、免疫系と肝臓の文脈におけるP2受容体とギャップ注射を研究します。

今日は、細胞のマイクロインジェクションについてご紹介します。ギャップ注射は、シナプス伝達、心臓収縮など、いくつかの生理学的役割を果たします。この手法では、ギャップ注入が機能するかどうかを調べることができます。

では、マイクロインジェクションのセットアップの基本コンポーネントを見てみましょう。ここには、細胞を見る倒立型蛍光顕微鏡があります。結果を記録するためのCCDカメラです。

ここには、色素を細胞に導入する電流発生器があります。次に、微小電極が接続されるホルダーがあります。そして、ホルダーに接続され、Z、Y、Xの3軸で微小電極を動かすことができるマイクロマニピュレータは、実験を開始する前に、微小電極を作る必要があります。

私たちはこのホウケイ酸ガラスキャピラリーとこの装置を極と名付けました。ここにホウケイ酸毛細血管を取り付けます。このタングステンフィラメントを加熱して2つの微小電極を作ります。

今、タングステンフィラメントの加熱とここでの波は、2つの微小電極を作るために引き下げます。易しい。最初のステップは、微小電極を染料で満たすことです。ここでの1つのヒントは、実験を行うには先端だけを数マイクロリットルで満たす必要があるということです。

すべてを埋める必要はありません。詳細については、注意してください。先端だけを埋めます。

さっそく実験を始めましょう。ここには、ペトリ皿の中のナトリウム溶液の細胞があります。電流発生器に接続された銀線。

次に、ヘッドステージに微小電極を取り付けます。このヘッドステージには、電流発生器にも接続された別の銀線があります。微小電極を取り付けたら、浴槽の中に入れることができます。

ピペットの先端がお風呂に丁寧に触れていることに注意してください。この手順は、ペトリ皿の底に先端がクラッシュしないように非常に慎重に行われます。お風呂に入ったら、顕微鏡に行ってマイクロピペットの影を探すことができます。

倍率レンズで見始めることをお勧めします。ピペットの影を見つけたら、マイクロマニピュレーターを使用して微小電極を細胞に向かって動かすことができます。セルに非常に近づいたら、微小電極が詰まっていないかどうかを確認するためのテストポストを行うことができます。

次にどうなるか。ここでは、マイクロピペットを見ており、マイクロピペットを細胞に非常に近い位置で調整しています。細胞の動きが左右に見えます。

その後、フィルター、蛍光フィルターに交換します。過分極パルスを適用して、ピペットの先端が塞がれていないかどうかをテストできます。マイクロピペットは細胞の内部にあるため、過分極パルスを印加して細胞に色素をロードすることができます。

ここでは、ルースフリーの黄色の染料を使用しています。細胞に色素をロードした後、隣接する細胞がギャップ注入によって接続されている場合、数分待つと、これらのギャップ注入による色素の拡散によって隣接する細胞が明るくなるのがわかります。私たちの実験では、星でマークされた5つの細胞が蛍光を示しているのを見ることができます。

ここには胸腺上皮細胞におけるマイクロインジェクションの実験の良い例があり、図CおよびDのAおよび B.In では、緩い遊離黄色の胸腺不活性細胞におけるマイクロインジェクションと、ギャップ注入に透過性ではない別の色素が挿入物に示されていることを示している。図EおよびF胸腺上皮細胞株にルースフリーイエローをマイクロインジェクションし、インサートにルースフリーイエローとギャップインジェクションブロックを注入しました。その結果、ルーズフリーイエローは隣接細胞に広がっていなかった。

次に、デキサメタゾンの存在下で胸腺上皮細胞にマイクロインジェクションを行い、B.デキサメタゾンの定量化によりカップリングの程度が増加し、図Bに示されているように、100回の注射のうち、この薬物の存在下では、接続された3つまたは4つの細胞の数がより頻繁になりました。私は、初心者が細胞通信研究にこの重要なテクニックを行うのを助けることができれば幸いです。ありがとう、さようなら。