広視野と共焦点顕微鏡によるマウスリンパ節スライスにおけるT細胞のex vivoでのイメージング

この手順の全体的な目標は、広視野顕微鏡および共焦点顕微鏡法により、リンパ節切片中の蛍光T細胞を画像化することです。これは、まずマウスのリンパ節を切除し、低融点エアロに埋め込むことによって達成されます。次に、ノードをビブラートで320ミクロンの厚さのセクションに切断します。

次に、蛍光染色したT細胞をリンパ節切片の上に播種します。最後に、スライスに浸潤したT細胞を広視野顕微鏡および共焦点顕微鏡で可視化します。最終的には、T細胞がリンパ節にどのように動員され、リンパ組織内でどのような運動行動を示すかを示す静止画およびビデオ画像を取得できます。大丈夫です。

2つの顕微鏡法や無傷の臓器など、既存の金属のこれらの技術の主な利点は、ここではT細胞を従来の白色視野顕微鏡で3次元システムで視覚化できることです。さらに、わずかな準備、許可、および組織問題へのアクセスは、4%の低融点を準備することから始めます。アローズ溶液は、アローズをPBSで希釈し、アローズが完全に溶解した後に得られた混合物を電子レンジで加熱します。

使用するまで、溶液を摂氏37度に維持します。次に、プラスチック皿にRPMIを入れます。培地を完成させ、内径4mmのステンレス製ワッシャーを皿に入れます。

別の皿に氷冷したPBSを入れ、約1.1ミリリットルのRPMIを追加します。6ウェル組織培養プレート内のウェルあたりの完全な培地。器官型フィルターを6ウェルプレートの各ウェルに挿入し、摂氏4度のプレートを配置します。

安楽死させたマウスで、末梢リンパ節を周囲の組織から慎重に除去します。リンパ節は非常に柔らかいので、リンパ節を注意深く解剖します。組織からすべての脂肪を取り除くことは非常に重要です。なぜなら、それは細胞にとって非常に有毒だからです。

氷炭PBSが入ったプラスチック皿にリンパ節を置きます。次に、4%aroゲルを35ミリメートルのプラスチック皿に注ぎ、ノードをゲルに繊細に移します。次に、aroを氷の上に5分間置いて、aroが固まった後に固め、皿からブロックを取り除き、寒天を切り取り、各リンパ節の周りに約3〜5mmのゲルを残します。

次に、無毒の接着剤を使用して、埋め込まれたノードをバイオムの標本ディスクに取り付けます。試料ディスクをビオムリムーバブルトレイに取り付け、トレイに氷冷PBSを充填します。ビオーム速度を低速範囲に設定し、振動周波数を中距離セクション、寒天包埋組織を320ミクロンの厚さに設定します。

最初のスライスには表在組織しか含まれていないため、最初のスライスを廃棄し、次に細い鉗子を使用して、器官型培養インサートに切断されるリンパ節スライスを慎重に移します。個々のスライスにステンレス鋼のワッシャーを配置し、ワッシャーがアグロにあり、リンパ節組織を覆っていないことを確認します。次に、5%二酸化炭素加湿インキュベーターで、リンパ節スライスを摂氏37度で培養プレートとインキュベートします。

このステップのためにT細胞を調製する際には、以前にMatthewとCallaghanによるJoVEの記事で実証されているように、MIL 10 max精製を使用してCD4陽性ビーズ選択によって単離されたIL7補充T細胞を一晩培養します。TCELLをHBSSで5分間、重力300倍、摂氏20度で洗浄します。それらを新鮮なHBSSに10倍10倍で1ミリリットルあたり6個の細胞で懸濁します。

次に、HBSSのチューブに1マイクロモルセルトラッカーグリーンC-M-F-D-Aを加え、この溶液を細胞溶液と組み合わせ、最終色素濃度0.5にします。マイクロモルで細胞懸濁液を摂氏37度で5分間インキュベートします。次いで、細胞を完全なRPMI培地で300倍Gおよび摂氏20度で5分間2回洗浄した後、リースは標識されたT細胞を最終濃度の10倍10倍として1ミリリットルあたり6個の細胞に曲げる。

新鮮なRPMI、完全な培養液で、インキュベーターからリンパ節スライスを取り出します。ワッシャーの中央に含まれている余分な媒体をティッシュに触れずにピペットで取り除きます。ピペットの先端で、10〜20マイクロリットルの標識T細胞をワッシャーの中央に静かに分注しました。

細胞懸濁液の滴が所定の位置に留まることを確認してください。スライスとT細胞を少なくとも30分間インキュベートして、リンパ球が組織内に移動するようにします。イメージングを開始するには、顕微鏡の温度制御チャンバーを摂氏37度に設定します。

リンパ節切片の連続灌流を可能にする融合システムを酸素化フェノールレッドフリーRPMIミディアムフィルで満たし、この時点でも酸素化RPMIで小さなプラスチック皿を温めます。ここに示すシステムでは、灌流された媒体は重力によって片側からイメージングチャンバーに入ります。媒体は、廃棄物収集に接続されたポンプで吸引されます。

フラスコは、T細胞に浸潤したリンパ節スライスをインキュベーターから細い鉗子で回収します。微妙。6ウェルプレートからリンパ節スライスを取り出します。スライスを温めた酸素化RPMI培地に数秒間浸して、組織に浸潤していない蛍光細胞を洗い流します。

次に、洗浄したばかりのスライスを逆さまにしてイメージングチャンバーに置きます。ナイロン糸はガラスからスライスを持ち上げ、酸素化された溶液を組織に拡散させます。これは、リンパ節でのT細胞の移動が酸素に強く依存しているためです。

次に、スライスの上にステンレス鋼のワッシャーを配置して固定し、広い視野を捉えます。10倍ドライ対物レンズを使用して画像を収集します。洗いたてのリンパ節スライスをプラスチック皿に表向きに移します。

準備物にワッシャーを置いて固定します。これで、スライスを画像化する準備が整いました。直立共焦点顕微鏡のステージに試料を取り付け、20倍対物レンズでピントを合わせます。

次に、イメージングセッションを開始し、取得を開始します。C-M-F-D-A。緑色で標識されたT細胞は、ここに示すように、画像取得の30分前にリンパ節切片に添加されました。画像は、ここで広視野顕微鏡で撮影したZ方向50ミクロンの5枚の画像を最大投影したものです。

このビデオでも同じ図が明視野画像として見ることができます。リンパ節切片に浸潤した緑色蛍光T細胞を広視野顕微鏡で9分間画像化します。アニメーションは 50 ミクロンの Z 投影を表しています。

スライス内の T 細胞の活発な移動に注意してください。ここでは、同じ顕微鏡フィールドからの個々のT細胞の軌跡を色分けした軌跡として表示し、青色の低運動性細胞から赤色の高運動性細胞への変位の増加を表しています。トレイルは火星を使用して計算されました。

白い線はノードの端を示し、破線の楕円は推定されるB細胞ゾーンを示しています。ここでは、リンパ節切片に添加したT細胞を共焦点顕微鏡で10分間画像化しました。アニメーションは 50 ミクロンの Z 投影を表しています。

はい、この技術は他の種類の組織にも適用できます。そして興味深いのは、スライス自体が、ヒト腫瘍におけるT細胞の移動と局在の根底にあるメカニズムを探求する唯一の方法であるということです。例えば。