マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

この手順の全体的な目標は、生体内イメージングのために大腸リンパ節を露出させ、安定させることです。これは、最初にマウス用のホルダーを作成することによって達成され、これにより、処置中に脚を安定させることができます。2番目のステップは、麻酔をかけたマウスをホルダーに適切に置くことです。

3番目のステップは、ポピカルリンパ節や周囲の血管系に損傷を与えることなく、ポピカルリンパ節を慎重に露出させることです。最後のステップは、露出した恥骨リンパ節で生体内イメージングを実行することです。最終的には、リンパ節内の免疫細胞のリアルタイムの移動と相互作用を、生体内顕微鏡で観察および分析できます。

この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。外科的な手順を学ぶのは難しく、リンパ節を損傷することなくリンパ節を適切に安定させることが重要であるため、手術の手順を学ぶことは非常に重要です。手順を実演するのはレイチェル・リューです。

私たちの研究室の技術者 まず、100ミリメートルガラスのペトリ皿の蓋を右側を上にして、ガラスがプラスチック皿の中心点にほとんど触れないように、逆さまの100ミリメートルのプラスチックペトリ皿の蓋の上に置きます。ガラスをステンシルとして使用して、プラスチック皿を横切る三日月形の線をトレースします。次に、ハンドドリルを使用して、100ミリメートルのプラスチック製の皿の蓋を三日月形のプラットフォームに切ります。

プラットフォームに2つの穴を開けてから、強力な接着剤を使用してプラスチック製の蓋をガラスのペトリ皿の端に固定します。最後に、2つのドーム型キャップPCRキャップをヒンジでチューブから切り取り、底皿の中央にキャップを1cm離して接着します。マウスに麻酔をかけたら、ガスマスクを動物の鼻にテープで固定します。

それに応じてイソフフッ素レベルを調整し、動物が完全に鎮静していることを確認します。次に、電動トリオールを使用して、マウスの右後肢と鼠径部の毛を取り除きます。抜け毛を払い落とし、綿棒を使って剃った部分に適度な脱毛クリームを優しく塗ります。

最初の塗布から1分後、デトリークリームを取り除き、湿らせたペーパータオルで露出した肌をきれいにします。マウスが乾いたら、右膝のハサミで2〜3ミリメートルの小さな切開を行い、伸筋腱を露出させます。次に、マウスホルダーの中央に沿って獣医用ボンドを塗布し、マウス本体と脚を慎重に配置します。

マウスをホルダーに固定し、右膝を下にして右頭蓋窩を露出させます。次に、2つのスキンフラップホルダーの間にveboで右膝腱を固定し、イメージングフィールドを安定させます。次に、マウスの腕と左脚をホルダーの上部プラットフォームに伸ばしてテープで固定します。

穴に2本の金属ツイストタイを挿入し、タイを使用してガスマスクを蓋に固定します。最後に、ホルダーを解剖顕微鏡の下に置きます。ここに示すように、右脚の安定性を最大限に高める位置、通常は頭の上にテールを配置します。

そして、テールをテープで留めます。解剖範囲内で、スペースヒーターを使用してマウスの体温を維持します。滅菌ハサミを使用してベタジンで皮膚を滅菌することから手順を開始します。

右ふくらはぎの真ん中で皮膚を正中線切開し、右大腿部の上部まで垂直に切り続けます。次に、垂直切開線の上部に2つの水平方向の皮膚切開を行い、両側に皮膚フラップを作成します。露出した組織に温かいPBSを常に塗布することにより、組織の水分を保持します。

皮膚をぴんと張った状態で引っ張り、フラップに獣医用ボンドを塗布して、脚の安定性をさらに促進します。リンパ節を露出させる前に、皮膚の他の領域を接着し続けて脚の安定性を高めます。周囲の組織に損傷を与えることなくリンパ節を露出させることは、この手順の最も難しい部分です。

脂肪組織と筋肉を分離するときは、周囲の血管やリンパ管を傷つけないように注意して、特に注意してください。これを行う最良の方法は、一度に数本の筋肉を持ち上げてリンパ節から離すことです。次に、マイクロ解剖ピンセットと鉗子を使用して、求心性血管と耳鼻咽喉科血管、求心性リンパ管の完全性を危険にさらすことなく、周囲の脂肪組織と筋肉を慎重に広げます。

リンパ節が十分に露出し、安定性が達成されたら、マウスホルダーアセンブリ全体を、十分な滅菌摂氏37°CPBSの2光子イメージング顕微鏡ステージに迅速に移し、リンパ節を沈めるために環境顕微鏡チャンバーに移します。フィードバックプローブ付きの加熱パッドを使用して、PBSの温度を摂氏37度に維持します。マウスホルダーに別の温度プローブを置き、PBSの温度が摂氏36.5〜37.5度の範囲内にとどまっていることを確認します。

直腸プローブは、実験動物の深部体温を監視するためにも使用されてもよい。落射蛍光灯を使用して、対物レンズの下でリンパ節の配置をガイドします。次に、目的の細胞相互作用に適した時間間隔を使用して蛍光画像スタックを取得します。

顕微鏡チャンバー内の動物の状態を目視検査で頻繁に監視します。この3Dスナップショットは、イメージングの1日前に1×10で7番目のGFP陽性リンパ球に養子移植したマウスのポパールリンパ節の2光子レーザー走査型顕微鏡イメージングシーケンスから取得されました。他のランドマークがなくても。

ここで点線で示されているB細胞卵胞などの構造は、丸い球形の細胞によって容易に識別できます。この図の蓄積は、1時間の連続イメージング中のリンパ球の移動の軌跡を示しています。これにより、細胞の移動パターンの追跡だけでなく、速度、方向性、細胞間相互作用などの細胞挙動の複雑な解析が可能になります。

移動するリンパ球のOID形状に注意してください。ここでは、サンプルの恥骨で追跡された養子縁組に移されたリンパ球の移動の全体的なリンパ球移動速度の分布が提示され、分析された合計15、125トラックのリンパ節。平均速度は毎分6〜14マイクロメートルであると決定されました。

このグラフは、オープンデータバーで表されるB細胞卵胞とクローズドデータバーで表されるT細胞ゾーンに見られる細胞の細胞移動速度の差分布を示しています。平均して、B細胞卵胞における細胞移動の頻度は、T細胞ゾーンで追跡された細胞移動の頻度を上回った。この間、T細胞ゾーンの細胞はより速い平均速度で移動したが、マウスのポパルリンパ節の生体内2光子レーザー走査型顕微鏡動画では、ユビキチンGFP陽性ドナーマウスから第7リンパ球の合計10個を単離し、動画で見られるようにイメージングの24時間前にレシピエントマウスに養子静脈内投与した。

この技術により、リンパ節内のリンパ球の挙動を動的に可視化することが可能になります。ここでは、前のビデオからB細胞卵胞T細胞ゾーン境界領域のイメージングシーケンスを拡大して示しています。慎重な分析により、リンパ節のさまざまな微小環境における細胞の振る舞いを区別することができます。

このビデオを見た後、膝窩リンパ節のイメージングに適したマウスホルダーを作成する方法、膝窩リンパ節を外科的に露出する方法、およびC Twoの免疫細胞の挙動を観察するための生体内顕微鏡検査の実施方法についてよく理解しているはずです。