Name: マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶマウス膝窩リンパ節の生体内イメージング手法。2光子顕微鏡を用いて免疫細胞のリアルタイム移動と相互作用を観察し、免疫応答の動態を解明するための外科的手技とサンプル固定法を詳しく説明します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、NCI 1R01CA154656、NIAID 1R21AI092299、がん研究所、聖剣帯財団、ダナ財団、ガブリエルのエンジェル財団、アメリカの現代（ヒョンデ）自動車の &quot;ホープ·オン·ホイール&quot;プログラムからの助成金によってサポートされています。

1。マウス·ホルダ·アセンブリ<ol><li>下向きに100 mmのプラスチックシャーレの蓋の上に100 mmのガラスシャーレの蓋を重ねる。ガラスはほとんどプラスチック皿の中心点に触れなければならない。ステンシルとしてガラスを使用して、プラスチック製の皿の上にマークをトレースします。 </li><li>三日月型のプラットフォームを作成するには、100 mmのプラスチックシャーレの蓋の部分を削除するには、ハンドドリル（すなわち、ドレメル）を使用します。この三日月形のプラスチック製のふたは、マウスの上部の胴（図1a）のサポートとして機能します。金属製のツイストタイでガスマスクを確保するために三日月形の蓋にある2つの穴を開けます。スーパー接着剤または同等の強力な接着剤（図1b）を用いて、ガラスペトリ皿の縁にプラスチック製の蓋を固定します。 </li><li>接着剤2ドーム型キャップPCRチューブ（ヒンジで切断）離れて膝の皮膚フラップを固定する目的で底皿の中央に1cmのふた。 </li></ol> 2。マウスの準備<stroNG&gt;注意：十分な練習では、1つは20-30分で、マウスの準備や手術の手順を実行することができるはずです。 <ol><li> IACUC承認されたプロシージャを使用して、1L/minの流量で空気の混合物：1:1 O 2の混合イソフルランとマウス（誘導のための2から2.5パーセント、手術/イメージングのための1.5から2パーセント）を麻酔。マウスを麻酔したら、テープで鼻を介してガスマスクを固定します。マウスは、TOE及び/またはテールピンチへの応答の欠如によって完全に麻酔をかけているかどうかを判断します。イソフルランのレベルは、動物が完全に60から80回/分の間に安定した、非苦しい呼吸で鎮静されていることを確認するに応じて調整することができます。 </li><li>右後足とマウスの鼠径部の毛を削除するには、電動トリマーを使用しています。 </li><li>抜け毛をはらっゆっくりと綿棒で剃った領域にNairさんのローションのささやかなコートを適用します。最初のアプリケーションの1分後に、Nairさんを削除し、湿った露出した皮膚をきれいにペーパータオル。マウスが先に進む前に、清潔で乾燥していることを確認します。 </li><li>伸筋腱を公開するには、右膝にはさみで小さな2〜3mmの切開を行います。 </li><li>マウス本体と脚が配置され、マウスホルダーの中心に沿ってVetbond適用されます。慎重に右膝窩を公開するために、ダウンして右膝で、ホルダーの上にマウスを固定します。イメージング分野の安定化を助けるために2皮弁ホルダーの間にVetbondで右膝の腱を固定します。 </li><li>ホルダーの上位プラットフォームにストレッチやテープ腕と左脚。 </li><li>代わりに、ガスマスクを確保するためにツイストタイを使用しています。 </li><li>解剖顕微鏡下でホルダーを配置します。 LNは、絶対にまだマウスの呼吸運動の独立したままでなければなりません。足の安定性を最適化するために手術を行っている間そのため、注意が必要である。最大に貢献していきますテール（典型的に頭の上）の位置を決定する右脚とテープの下にテールの安定性。 </li></ol> 3。手術<ol><li>解剖スコープ下にある間、スペースヒータや加熱パッドを使用してマウスの体温を維持します。膝窩LNの成功イメージングするためには、常に露出した組織に温かいPBSを適用することにより、組織の水分を保持するだけでなく、手術中の適切な体温を維持することが重要です。 </li><li> Betadineで皮膚を消毒する。滅菌したハサミを使用して、右ふくらはぎに皮膚を通して正中切開を行い、右大腿部の優れた部分に垂直に切断し続けています。 </li><li>いずれかの側に皮膚フラップを作成するために垂直切開線の上部にある2つの水平方向の皮膚切開を行います。 </li><li> Vetbondの両方の皮膚フラップダウン撤回と接着剤。 Vetbondを適用する前にピンと張った皮膚を引っ張るとさらに足の安定性を促進しますが、（vesseすなわち変化皮膚の緊張が血流を閉塞しないことを確認してくださいlは、色や直径）。 LNを公開する前に、足の安定性を確保するために、皮膚の他の分野ダウン糊に進みます。マウスのサイズは、余分な皮膚が接着剤にダウンがどの程度必要であるかを決定します。一般的に、より大きなマウスは皮膚がホルダーに接着することが必要になります。 </li><li> LNは、ホルダーの上にマウスの位置に応じて、膝窩静脈の右側または左側のいずれかに膝窩内にある必要があります。ミクロ解剖ピンセットや鉗子を使用して、周囲の脂肪組織や筋肉からLNを慎重に分離します。出血や外傷を最小限に抑えるために、独立した組織へのマイクロ解剖ピンセットで溶射技術を使用しています。慎重に求心性と遠心性血管や求心性リンパ管の整合性を損なうことなく膝LNを公開します。 </li><li>追加された組織を安定させるために、正方形のカバーガラスは、血管閉塞を回避しながら、ぎりぎりLNに触れて、湿ったLN上に配置されることがあります。カバーガラスはSECURかもしれませんマウスのいずれかの側に粘土をモデリングするとED。 </li><li>様々なサイズ（例えばTRITC-デキストラン、70kDaの最小値）の蛍光血管色素は、撮影時のLNの構造的関係と整合性を強調するために、この時点で静脈内に導入することができる。 </li></ol> 4。 2光子イメージングの取得** <ol><li> LNが十分に露出されると安定性が達成されたら、速やかに37℃に保た環境顕微鏡チャンバー℃でプログラマブルな温度フィードバック制御ヒーティングパッドを装備顕微鏡ステージ上に全体のマウス·ホルダ·アセンブリを転送水没LNをするのに十分な滅菌暖かい（37℃）PBSまたはHBSSを追加します。ボリュームは、マウスのサイズと配置に応じて変更されます。また、温かいPBSまたはHBSSは、蠕動ポンプに取り付けられた微細なガラスピペットを介して解剖LNに直接適用され、浸レンズ対物レンズの列にテープで固定することができます。液体の流れがそのようにすべきである安定した水柱は、レンズと組織の間で維持することができます。 </li><li> 37℃でPBSまたはHBSS温度を維持°Cのフィードバックプローブを用いて加熱パッドを使用します。独立した温度プローブは、36.5から37.5℃の範囲でPBSの温度を確認するには、マウスホルダーに配置する必要があります直腸プローブはまた、イメージングセッションを通して、実験マウスの中核体温を監視するために使用されることがあります。 </li><li>目的の下にガイドLNの配置を支援するために落射蛍光灯を使用しています。希望する細胞間相互作用（通常は各xyzの画像スタックの間に10秒〜1分）に適した時間間隔を用いた蛍光画像スタックを取得します。 </li><li>目視検査したり、動物のモニタリングシステムを用いて頻繁に顕微鏡チャンバー内に動物の状態を監視します。マウスが完全につま先および/または爪のピンチへの応答の欠如により麻酔し、60〜80 Bの間の安定した、非苦しい呼吸であるかどうかを判断reaths /分。イソフルランのレベルは、動物が完全に鎮静されていることを確認するに応じて調整することができます。適切な監視と水和して、動物は4-6時間のために撮影されるか、あるいは長くすることができます。 </li><li>イメージング実験の後、IACUC承認された安楽死のプロトコルを使用して、CO 2チャンバーで動物を安楽死させる。動物は安楽死の前に麻酔から出てくることを許してはならない。 </li></ol> **この手術はまた、2P-LSM以外の生体内イメージングの他の形態のために役に立つかもしれません。 5。代表的な結果様々な循環免疫細胞移入後に異なるレートでLNに動員されています。 CD4 +およびCD8 +リンパ球、これらの細胞は2〜4時間6,17-18後、膝窩LNに到着した実質的な数字のIV転送後、高内皮細静脈（HEV）分を介してLNに到着し始める。 Bセルのためにlsは、かなりの数が8から24時間19後、蓄積されます。活性化樹状細胞は、足蹠注射3,11,16-17以下の排出膝窩LN 8から16時間以内に表示されるように開始する必要があります。図2aには、他のランドマークがない、そのようなB細胞濾胞として構造が2P-LSM 19歳未満に見える丸い球状の細胞の蓄積によって容易に識別できることを示しています。このようなユビキチン-GFPの脾細胞（図2、補足動画1と2）の内因性蛍光レポーターを使用して、1つは、非刺激性の生理学的条件の下で週に日、これらのリンパ球の移行や行動を追跡することができます。マルチチャンネルの高感度検出器と、それは構造情報だけでなく、17,19、複数の携帯パートナー間の相互作用のダイナミクスを含む多重イメージングのデータセットを取得することが可能です。 手術手技が適切に実行され、環境条件が注意深く監視され、lymphocy図2C、2Dおよび他13-14,16で示すようにTESは、特徴的な移動速度を示すべきである。リンパ球はまた、血管（のような容器染料の導入によって強調表示された）のようなので、追加のマークは、全体的な画像品質（すなわち、適切な温度制御を判断するのに役立ちますが、イメージングを受けたLNのサブ領域に応じて移動速度の違いを示すことができる、LN等への最小限の外傷）3,6,20。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> 図1。マウス膝窩LNイメージングのためのマウスホルダーの建設 ）は、マウス·ホルダ·アセンブリの概略図; b）の代表的な生体マウスの準備、c）に完成したマウス·ホルダ·アセンブリと、d）手術の暴露後窩LNの景色をクローズアップ。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> 図2。 GFP +リンパ球の移行解析膝窩LNに（a）はC57BL / 6レシピエントマウスに膝LNの2P-LSMの撮像シーケンスから取得した3Dスナップショットは、養子前の画像への1×10 7 GFP +リンパ球が1日に転送されます。破線は、B細胞濾胞の境界を示し、（b）の連続撮影1時間の間にリンパ球遊走の曲、全体のリンパ球遊走速度のc）の分布。 B細胞濾胞（オープンバーで見出される細胞のd）の差動細胞の移行速度分布;速度= 10.04±4.26μm/分を（解析15125トラックの合計）平均= 8.79±3.90μm/分の速度を意味し、合計1525トラックを分析）とT細胞ゾーン（黒棒、平均速度= 13.77±5.93μm/分、分析した1250トラックの合計）。スケールバー=50μmである。 補足ビデオ1、図2で説明したマウス膝窩のLNのタイムラプス生体2P-LSMのイメージング。 1×10 7リンパ球の合計が単離されたFROMユビキチン-GFP +ドナーマウスと養子、24時間イメージングする前に、C57BL / 6レシピエントマウスに静脈内転送されます。 xyのシリーズは（750μmのX 750μm）の蛍光画像は20秒ごとに繰り返されたXYZ画像のスタック（750μmのX 750ミクロン×65μm）を、得​​るために固定のZスタック（5μmのステップ、13ステップ）を介して撮影された60分の合計は、速度解析（図2C、2D）のxyzt撮像シーケンスの結果。再生速度= 450X。スケールバー=50μmである。タイムスタンプ=分：秒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">補足ビデオを見るにはここをクリックしてください</a> 。 補足ビデオ2ズーム·イン、B細胞の毛包でのサプリメンタル·ビデオ1の撮像シーケンスの観点から- 。T細胞ゾーンの境界線。再生速度= 450X。スケールバー=25μmである。タイムスタンプ=分：秒<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>補足ビデオを見るにはここをなめる。

<ol><li>Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+activation+by+dendritic+cells+in+the+lymph+node%3A+lessons+from+the+movies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).</li>
<li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+friends+in+out-of-the-way+places%3A+how+cells+of+the+immune+system+get+together+and+how+they+conduct+their+business+as+revealed+by+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging.</a> Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).</li>
<li>Huang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+landscape+of+in+vivo+immunity%3A+insights+from+dynamic+in+situ+imaging+of+secondary+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li>
<li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-recognition+promotes+the+foreign+antigen+sensitivity+of+naive+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes.</a> Nature. 420, 429-434 (2002).</li>
<li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+self-recognition+in+T+cell+responses+to+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen.</a> Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).</li>
<li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li>
<li>Celli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+dynamics+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo.</a> Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).</li>
<li>Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rulers+over+randomness%3A+stroma+cells+guide+lymphocyte+migration+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes.</a> Immunity. 25, 867-869 (2006).</li>
<li>Worbs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+stimulate+the+intranodal+motility+of+T+lymphocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).</li>
<li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((byways+and+breadcrumbs%3A+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
<li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+visualizing+immunity+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li>
<li>von Andrian, U. H., Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+cellular+traffic+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Homing and cellular traffic in lymph nodes.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).</li>
<li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CD8%2B+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).</li>
<li>Castellino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8%2B+T+cells+to+sites+of+CD4%2B+T+cell-dendritic+cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li>
<li>Halin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li>
<li>Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrafollicular+activation+of+lymph+node+B+cells+by+antigen-bearing+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells.</a> Science. 312, 1672-1676 (2006).</li>
<li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+vision+for+dynamic+high-resolution+intravital+immune+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging.</a> Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).</li>
</ol>

著者らは、開示には何もありません。

特に現場のイメージング技術、2P-LSM の高解像度での最近の進歩は、 生体内での動的な細胞挙動の研究への関心の高まりを伴っています。ライブマウスの膝窩LN上の4Dイメージング技術は、undisrupted組織微小環境内で免疫細胞の動的挙動のそのような分析を可能にします。可視スペクトル全体にまたがる複数の検出器と2P-LSMを使用すると、複数の細胞集団の同時イメージングデータ収集を可能にします。これは現在（有機蛍光細胞色素を用いた差動標識細胞集団の移入の使用と組み合わせてin vivoで細胞特異的な蛍光レポーターマウス（例えば、ユビキチン-EGFP-RFP、または-ECFP） での使用によって達成することができます例えば、CFSE 、SNARF-1、セルトラッカーオレンジ）LN内の細胞のメカニズムと機能を調べることができます。差動追跡cとの間の相互作用の直接観測に加えてエルの人口は、多重イメージングのデータセットには、さらに細胞の挙動と機能を解明するために市販の画像処理ソフトウェアのプログラム（例えばImaris、ビットプレーン社製）でさらに分析を受けることができます。可能性の広範な配列は、in vivoおよびin silicoでのテクニックでこれらを使用して細胞の相互作用のメカニズムを研究するために存在しています。 ここで説明する実験的なアプローチの主な制限は、手術のアプローチに内在する技術的な複雑さです。このテクニックは、関連する解剖と正確な技術的手続きと、このプロトコルで必要とされるスキルに精通するための厳しい訓練を必要とします。さらに複雑な要因は、撮像中に組織の安定性を最適化し、撮像実験の前と間にLNにサーマル、レーザー損傷を防止するため、LNの探査中に組織の損傷を最小限に抑えることの難しさがあります。これらの要因のいずれかへの摂動は、より少なくより最適なリンパ節になりますocyte運動したがって、イメージングデータの解析結果としての適切な解釈に干渉します。

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt;試薬</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;イソフルラン、USP</td&gt;<td&gt;バクスターヘルスケア株式会社</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nairさん - 脱毛ローション</td&gt;<td&gt; Nairさん</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS、1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;暖房パッド</td&gt;<td&gt;ワトロー</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;暖房パッドコントローラ</td&gt;<td&gt;ワトロー</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;航空O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgasの</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;温度プローブ</td&gt;<td&gt;ハーバード装置</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ピンセットデュモン第5位</td&gt;<td&gt;世界の精密機器株式会社</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td7センチメートル曲線&gt;鉗子、グレーフェアイリス、</td&gt;<td&gt;世界の精密機器株式会社</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;はさみ</td&gt;<td&gt; Roboz手術器具（株）、（株）</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td100x20 mmのガラスの細胞培養皿の&gt;カバー</td&gt;<td&gt;コーニング</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td100x20 mmのポリスチレン細胞培養皿の&gt;カバー</td&gt;<td&gt;コーニング</td&gt;<td&gt; 430167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Betadine溶液（10％Povidine-ヨウ素外用ソリューション）</td&gt;<td&gt;パデュー製品、LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

リンパ節（LNS）は、戦略的適応免疫応答を準備するために末梢組織からの外来抗原の捕捉とプレゼンテーションを可能にするために体全体に配置されており、二次リンパ器官である。自然免疫と適応免疫応答の間の並置、LNは、免疫細胞の相互作用1,2を研究する理想的なサイトです。リンパ球（T細胞、B細胞およびNK細胞）、樹状細胞（DC）、マクロファージは、LNの骨髄由来細胞成分の大部分を構成しています。これらの細胞は、戦略的に自己抗原および潜在的な外来抗原3-5の効率的な監視を可能にするためにLNに配置されている。リンパ球が正常に同族抗原に遭遇するプロセスは、近年の激しい調査の対象となり、抗原受容体、接着分子、ケモカイン、およびそのような線維網状ネットワーク2,6-12として間質構造体を含む分子の連絡先の統合を含む。 </p&gt; 前の唯一の形態、位置、およびアーキテクチャに関する答えを提供してin vivoイメージング、静的な画像に頼った捜査官、で高解像度のリアルタイム蛍光灯の開発に。これらの質問は、免疫細胞の挙動の理解に根本的なものですが、この手法の本質的な制限が解読リンパ球人身売買や動的な細胞の挙動に影響を与える環境手がかりに分析を許可されていません。最近、生体内の開発は二光子レーザー走査顕微鏡（2P-LSM）は、捜査官は現場 12月16日 のライブLNS内でダイナミックな動きと個々の細胞の相互作用を表示することができました。特に、我々と他のものは、そのコンパクトな、緻密な自然は、多様な組織のサブ構造11,17-18で大きな組織領域上の多重データ取得の利点を提供して膝LN、内のイメージ細胞挙動との相互作用にこの手法を適用している。それは私のこのテクニックは植血液の中断を必要とする組織のイメージング技術、リンパの流れ、およびシステムの最終的に細胞のダイナミクス上の追加の利点を提供していることに注意することが重要です。さらに、外植組織は、組織が外植後のイメージングのための生きたままでいる時間の非常に限られたウィンドウを持っています。動物の環境条件の適切な水分補給と監視により、撮像時間が大幅にこの生体内技術で拡張することができます。ここでは、生体内イメージングを行う目的で、マウス膝窩LNの準備の詳細な手法を提案する。

2光子顕微鏡の最近の進歩により、リアルタイムを有効にしている<em&gt;の</em&gt;その場の動物モデルでのライブの組織のイメージングことにより、生理学的および病理学の両方の条件で細胞の挙動を調べるために我々の能力を高める。ここでは、マウス膝窩リンパ節の生体内イメージングを実行するために必要な準備を概説しています。

リンパ節（LN）は二次リンパ器官であり、体中に戦略的に配置されることで、外来の物質を捕捉し、提示することを可能にしている...

この手順の全体的な目的は、生体内イメージングのために膝窩リンパ節を露出させ、固定することです。まずマウス用のホルダーを作成し、処置中に脚を固定できるようにします。次に、麻酔をかけたマウスをホルダーの上に適切に配置します。第3の手順は、周囲の血管やリンパ節自体を損傷させないよう注意しながら、膝窩リンパ節を慎重に露出させることです。最後のステップは、露出させた膝窩リンパ節に対して生体内イメージングを行うことです。最終的に、生体内顕微鏡を用いることで、リンパ節内における免疫細胞のリアルタイムな遊走と相互作用を観察し、解析することができます。本手法の視覚的な実演は極めて重要です。外科的な手順の習得が困難であること、また、リンパ節を損傷させることなく適切に固定することが不可欠であるためです。本手順の実演はRachel Liuが行います。当研究室の技術者が、100 mmのガラス製ペトリ皿の蓋を正立させ、逆さまに置いた100 mmのプラスチック製ペトリ皿の蓋の上に配置し、ガラス皿がプラスチック皿の中心点にわずかに触れるようにします。ガラス皿を型として使い、プラスチック皿の上に三日月形の線をなぞります。次に、ハンドドリルを使用して、100 mmのプラスチック製ペトリ皿の蓋を三日月形のプラットフォーム状に切り出します。プラットフォームに2つの穴を開け、強力接着剤を用いてプラスチック製の蓋をガラス製ペトリ皿の縁に固定します。最後に、ドーム型PCRキャップ2個をチューブのヒンジ部分から切り離し、底面の皿の中央に1 cm間隔で接着します。マウスに麻酔をかけた後、テープでガスマスクを動物の鼻に固定します。動物が十分に鎮静されるよう、イソフルランの濃度を適宜調整します。次に、電気バリカンを使用して、マウスの右後肢および鼠径部の除毛を行います。抜け落ちた毛をブラシで取り除いた後、綿棒を用いて除毛クリームを剃毛部位に薄く丁寧に塗布します。最初に塗布してから1分後、デトリークリームを拭き取り、露出した皮膚を湿らせたペーパータオルで清浄します。マウスの皮膚が乾いたら、ハサミを用いて右膝に2〜3 mmの小さな切開を加え、伸筋腱を露出させます。次に、マウスの体と脚を慎重に配置できるよう、マウスホルダーの中央にVet Bondを塗布します。マウスをホルダーに固定し、右膝を下げて右膝窩を露出させます。次に、撮像視野を安定させるため、2つの皮膚フラップホルダーの間にveboを用いて右膝腱を固定します。続いて、マウスの両腕と左脚を伸ばし、ホルダーの上部プラットフォームにテープで固定します。2本の金属製ツイストタイを穴に通し、タイを使用してガスマスクを蓋に固定します。最後に、ホルダーを解剖顕微鏡の下に配置します。右脚が最も安定する位置に尾を配置します。通常は、ここで示すように頭の上に配置します。そして、尾をテープで固定します。解剖顕微鏡下では、スペースヒーターを使用してマウスの体温を維持してください。滅菌済みのハサミを用いてBetadineで皮膚を滅菌し、処置を開始します。右側の下腿中央部の皮膚に正中切開を加え、右大腿上部まで垂直に切り進めます。次に、垂直切開線の末端で皮膚を水平に2箇所切開し、両側に皮膚フラップを作成します。露出した組織には温めたPBSを絶えず塗布し、組織の保湿を維持してください。皮膚をピンと張り、フラップにvet bondを塗布して脚の安定性をさらに高めます。リンパ節を露出させる前に、皮膚の他の領域も接着し、脚の安定性を向上させます。周囲の組織を損傷することなくリンパ節を露出させることが、この手順で最も困難な部分です。周囲の血管やリンパ管を損傷させないよう、脂肪組織と筋肉を分離させる際に細心の注意を払ってください。分離させる際は、一度に数本の筋束を持ち上げ、リンパ節から遠ざけるようにするのが最適な方法です。次に、マイクロ解剖用ピンセットと鉗子を用いて、流入および流出血管ならびに流入リンパ管の完全性を損なわないよう、周囲の脂肪組織と筋肉を慎重に広げ、膝窩リンパ節を露出させます。リンパ節が十分に露出し、安定した状態になったら、速やかにマウスホルダーアセンブリ全体を2光子イメージング顕微鏡のステージへ移します。その際、環境制御顕微鏡チャンバーに十分な量の滅菌済み37 °C PBSを加え、リンパ節が浸されるようにしてください。フィードバックプローブ付きのヒーティングパッドを用いて、PBSの温度を37 °Cに維持します。別途温度プローブをマウスホルダー内に設置し、PBSの温度が36.5から37.5 °Cの範囲内に保たれていることを確認してください。実験動物の深部体温をモニタリングするために、直腸プローブを使用することもあります。エピ蛍光ランプを使用して、対物レンズの下にリンパ節を配置させる際のガイドとしてください。その後、目的の細胞相互作用に適した時間間隔で蛍光画像スタックを取得します。Action。顕微鏡チャンバー内の動物の状態を、目視検査によって頻繁にモニタリングしてください。この3Dスナップショットは、イメージングの1日前に1×10⁷個のGFP陽性リンパ球を適応的に移入したマウスのポップリテアルリンパ節を、2光子レーザー走査顕微鏡でイメージングしたシーケンスから取得したものです。他の指標がなくても確認可能です。点線で示されたB細胞濾胞などの構造は、円形の細胞によって容易に識別できます。この図では、1時間の連続イメージング中におけるリンパ球の移動経路の蓄積が示されています。これにより、細胞の移動パターンの追跡だけでなく、速度、方向性、細胞間相互作用などの細胞挙動の複雑な解析が可能になります。遊走するリンパ球の卵形（OID shape）に注目してください。ここでは、合計15,125本のトラックを解析し、リンパ節のサンプルにおいて追跡した養子移入リンパ球の遊走速度の全体的な分布を示しています。平均速度は6〜14 µm/minの間であることが判明しました。このグラフは、白抜きのデータバーで示されるB細胞濾胞と、塗りつぶしのデータバーで示されるT細胞領域において観察された細胞の分化細胞遊走速度分布を示しています。平均して、B細胞濾poisにおける細胞遊走の頻度は、T細胞領域で追跡された細胞遊走の頻度を上回っていました。今回のマウス腋窩リンパ節の時間経過 intravital 二光子レーザー走査顕微鏡ムービーでは、T細胞領域の細胞の方が平均速度は速かったものの、ムービーに見られるように、ユビキチンGFP陽性ドナーマウスから合計 1×10⁷ 個のリンパ球を単離し、イメージングの24時間前にレシピエントマウスに静脈内投与して適応移転させています。この手法により、リンパ節内におけるリンパ球の挙動をダイナミックに可視化することが可能になります。ここでは、前のビデオに続き、B細胞濾胞とT細胞領域の境界領域のイメージングシーケンスを拡大して示します。詳細な解析を行うことで、リンパ節内の異なる微小環境における細胞挙動を区別することができます。このビデオを視聴することで、膝窩リンパ節のイメージングに適したマウスホルダーの作製方法、膝窩リンパ節を外科的に露出させる方法、およびC2における免疫細胞の挙動を観察するための生体内顕微鏡観察の手法について十分に理解することができます。

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

二光子イメージングには、基礎条件の下でリンパ節内および免疫応答1の間にリンパ球運動と細胞間相互作用を明らかにした。ここで、我々はT細胞、リンパ節の分離、およびCD4 +植リンパ節におけるT細胞のイメージング運動の養子移入を示しています。...

解剖とマウスの末梢リンパ節の2 - フォトンイメージング

鼠径リンパ節（LN）の生体顕微鏡検査を行うための手法が説明されています。そのような技術は、リアルタイムを可能に...

鼠径リンパ節の生体顕微鏡

近赤外蛍光（NIRF）を使用して、最近開発されたイメージング技術は、リンパ系の癌転移、免疫応答、創傷修復、および他のリンパ関連疾患に果たす役割の解明に役立つことがあります。...

マウスのリンパ脈管構造の非侵襲的光イメージング

このビデオは、マウスの後肢から膝窩ドレナージリンパ節を採取する解剖技術を示しています。リンパ節は、自然免疫と適応免疫の橋渡しに重要な役割を果たしており、組織構造と細胞生存率が維持された無傷のリンパ節を採取することで、局所免疫応答と全身免疫応答の研究に役立ちます。...

ex vivoイメージングのためのマウス膝窩ドレナージリンパ節を採取するための解剖法

成体マウスのリンパ節における120μmの深さまでの造影による高解像度の生体内イメージングは​​、空間的に多重焦点二光子顕微鏡の励磁パターンを調節することによって達成される。 100μmの深さでは、このように散乱や回折限界を回避し、（横）487 nmおよび551 nmの（軸方向）の解像度を測定した。...

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

私たちは、麻酔をかけたマウスの生体内共焦点顕微鏡を使用して、定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球の挙動を監視するためのプロトコルを詳述しています。...

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

このプロトコルは、臓器構造に変化を起さずにリンパ節を排出する異なる細胞集団を画像化する技術を説明する。...

生体共焦点顕微鏡を用いてリンパ節構造と細胞局在化を可視化

このプロトコルでは、どの自己反応性のリンパ球を運ぶ活性型緑色蛍光タンパク質 (GFP-PA)...

自己免疫の混合キメラ モデルの光活性化によって個々 の自己反応性濾胞を尋問

尿管性リンパ管の外科的縫合によってリンパの流れを遮断するプロトコルが提示される。...

マウスの不感性リンパ管を縫合することによりリンパ流を遮断する

このプロトコルは、インドシアニングリーン(ICG)近赤外線画像と超音波を組み合わせて、マウスの足底ICGクリアランスおよび膝窩リンパ節の腫大を定量化することで、骨折後のリンパ排液を評価します。...

骨折後のICG近赤外線イメージングおよび超音波を用いたリンパ管排膿の評価

学ぶマウス膝窩リンパ節の生体内イメージング手法。2光子顕微鏡を用いて免疫細胞のリアルタイム移動と相互作用を観察し、免疫応答の動態を解明するための外科的手技とサンプル固定法を詳しく説明します。

マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

さらに動画を探す