Name: ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼの可視化法。BiFCレポーターを用いて生細胞内のカスパーゼ活性化複合体の局在と構成要素を同定し、免疫応答の分子メカニズムを解明する。

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この技術の開発に貢献したLBHの過去と現在の研究室のメンバーに感謝します。このラボは、NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB)、NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB)、NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH) によってサポートされています。図2は、Biorenderソフトウェアを使用して描画されました。

このプロトコルは、ベイラー医科大学のヒト研究倫理委員会のヒトサンプルの操作に関するガイドラインに従っています。血液サンプルは、ヒトサンプルの機関安全ガイドラインに従って取り扱われます。血液サンプルは地域の血液バンクで得られ、そこでクエン酸リン酸デキストロース(CPD)溶液で収集されます。しかしながら、ヘパリンナトリウム、リチウムヘパリン、またはEDTAのような他の抗凝固剤を用いて収集された血液も、このプロトコル28,29に使用することができる。
1. ヒト単球の単離とマクロファージへの分化
<ol><li>地域の血液バンクで非同定健常者から抗凝固血液を取得し、以下に示すように末梢血単核球(PBMC)を単離する。 メモ: 組織培養層流フードですべての手順を実行します。滅菌チューブのみを使用し、手袋を着用してください。廃棄時にすべての血液関連製品に10%の漂白剤を加えてください。滅菌PBS(1x)またはDPBS(Caなし)2+ および Mg2+) は、同じ意味で使用できます。<ol><li><li><li></li><li><li><li><li></li><li><li></li><li></li><li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li></li><li><ol><li><li></ol></li><li></li></ol><ol><li><li></li><li><li><li></li><li><li></li><li></li></ol><ol><li><li><li><li> </li><li><li><li></li><li><li></li><li></li><li> </li><li><li></li><li> </li><li><li></li><li></li><li><ol><li><li><li> </li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li><li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li><li><li></ol></li></ol>

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<li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+inflammasome+activation+targets+caspase-11%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11.</a> Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+inflammasome+activation+by+intracellular+LPS+independent+of+TLR4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4.</a> Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).</li>
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<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+gasdermin+D+for+noncanonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
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<li>Schmid-Burgk, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-4+mediates+noncanonical+activation+of+the+NLRP3+inflammasome+in+human+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).</li>
<li>Baker, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+activation+downstream+of+cytoplasmic+LPS+recognition+by+both+caspase-4+and+caspase-5%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).</li>
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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このプロトコルは、ヒト血液サンプルから単離された単球からマクロファージを得るワークフローと、細胞の生存率および挙動を損なうことなく炎症性カスパーゼBiFCレポーターをヒトMDMに効率的に導入する方法を記述している。
このプロトコルは、BiFC技術35 を利用して、カスパーゼリクルートメントドメイン(CARD)における炎症性カスパーゼを、分割蛍光タンパク質Venusの非蛍光断片でタグ付けする。炎症性カスパーゼは、大きな(p20)サブユニットと小さな(p10)サブユニットからなる触媒ドメインと、それらのN末端またはプロドメイン36 でCARDと呼ばれる保存されたタンパク質間相互作用モチーフをコードする(図1B)。それらの活性化プラットフォームへの炎症性カスパーゼの募集は、無傷のCARDに依存する。このアプローチのために、2つのカスパーゼプロドメイン構築物(CARDモチーフをコードする)が生成され、それぞれが、写真化可能な黄色タンパク...

カスパーゼは、システインアスパラギン酸プロテアーゼのファミリーであり、イニシエーターカスパーゼおよび死刑執行人カスパーゼにグループ化することができる。死刑執行人カスパーゼは、カスパーゼ-3、-6および-7を含む。それらは二量体として細胞内に自然に見出され、アポトーシス1を実行するために開始カスパーゼによって切断される。開始カスパーゼには、ヒトカスパーゼ−1、−2、−4、−5、−8、−9、−10および−12が含まれる。それらは、近接誘導二量体化によって活性化され、自己タンパク質分解切断によって安定化される不活性ザイモゲン(プロカスパーゼ)として見出される2,3。炎症性カスパーゼは、開始カスパーゼ2のサブセットであり、ヒトにおけるカスパーゼ−1、−4、−5、および−12、ならびにマウス4、5におけるカスパーゼ−1、−11、および−12を包含する。アポトーシスの役割ではなく、炎症において中心的な役割を果たします。それらは、病原性侵入者8,9に応答して放出される最初のサイトカインであるプロインターロイキン(IL)−1βおよびプロIL−18 6,7のタンパク質分解的プロセシングおよび分泌を媒介する。カスパーゼ-1は、その活性化プラットフォームへの募集時に活性化される。インフラマソームと呼ばれる大きな分子量のタンパク質複合体(図1A)10。カスパーゼ−4、−5、および−11の二量体化は、非正準インフラマソーム経路11、12を介してこれらのプラットフォームとは独立して起こる。
正準インフラマソームは、インフラマソームセンサータンパク質、アダプタータンパク質ASC(CARDを含むアポトーシス関連スペック様タンパク質)、およびエフェクタータンパク質カスパーゼ-110からなる細胞質ゾル多量体タンパク質複合体である。最もよく研究された正準インフラマソームは、ピリンドメイン(NLRP)、NLRP1およびNLRP3を含むNOD様受容体ファミリー、CARD(NLRC)、NLRC4を含むNLRファミリー、および黒色腫2に存在しない(AIM2)である。それらはそれぞれ、ピリンドメイン、CARD、またはその両方のドメインを含む。CARD ドメインは、CARD を含むカスパーゼとそのアップストリーム アクティベーター間の相互作用を仲介します。したがって、N末端ピリンドメイン(PYD)とC末端CARDモチーフ13,14とからなる足場分子ASCは、NLRP110、NLRP3 15、およびAIM216インフラマソームへのカスパーゼ-1のリクルートに必要である。
各インフラマソームは、明確な炎症促進性刺激を認識する独自のセンサータンパク質にちなんで名付けられました(図1B)。この経路の活性化因子は、正準刺激と呼ばれる。インフラマソームは、微生物成分および組織ストレスのセンサとして機能し、炎症性カスパーゼ17の活性化を介して堅牢な炎症反応を誘発するように組み立てられる。インフラマソームアセンブリは、カスパーゼ−1活性化を開始し、その主要基質であるプロ−IL−1βおよびプロIL−18の成熟および分泌を媒介する。このプロセスは、2段階のメカニズムを介して行われます。第1に、プライミング刺激は、NF−κB経路の活性化を介して、ある種のインフラマソームタンパク質およびプロIL−1βの発現をアップレギュレートする。第二に、細胞内(正準)刺激は、プロカスパーゼ-1 6,7のインフラマソーム集合および動員を誘導する。
カスパーゼ−4およびカスパーゼ−5は、マウスカスパーゼ−11 11のヒトオルソログである。それらは、グラム陰性菌18、19、20の外膜に見られる分子である細胞内リポ多糖(LPS)および赤血球溶血21の産物である細胞外ヘムによって、インフラマソーム非依存的に活性化される。LPSがこれらのタンパク質のCARDモチーフに直接結合し、それらのオリゴマー化を誘導することが提案されている20。カスパーゼ-4またはカスパーゼ-5の活性化は、孔形成タンパク質ガスデルミンD(GSDMD)の切断を介してピロトーシスと呼ばれる炎症型の細胞死を誘導することによってIL-1β放出を促進する18,19。さらに、カスパーゼ−4およびGSDMD媒介性パイロプトーシス死から生じるカリウムイオンの流出は、NLRP3インフラマソームの活性化およびその後のカスパーゼ−1の活性化を誘導する22,23。したがって、カスパーゼ−4、−5、および−11は、特定の刺激に応答してパイロプトーシスおよびカスパーゼ−1活性化を誘導することができるLPSの細胞内センサと考えられる11、24。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig01.jpg"> 図1:炎症性カスパーゼおよびカスパーゼ-二分子蛍光相補(BiFC)アッセイ。(A)カスパーゼ-BiFC系を示す図では、金星の各非蛍光断片(Venus-CまたはVenus-N)に連結された2つのカスパーゼ-1プロドメイン(C1-pro)がNLRP3活性化プラットフォームにリクルートされ、金星にリフォールドと蛍光が強制されます。この複合体は、顕微鏡下で緑色の斑点として現れ、開始カスパーゼ活性化の最初のステップである炎症性カスパーゼ誘発近接の読み出しとして機能する。(b)インフラマソーム成分および炎症性カスパーゼのドメイン組織を示す模式図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
特定の開始剤カスパーゼ活性化を測定することは困難であり、イメージングアプローチによってこれを行うために利用可能な方法は多くない。カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)は、生細胞における炎症性カスパーゼ活性化を直接可視化するために使用できます(図1A)25。この技術は、最近、ヒト単球由来マクロファージ(MDM)21における使用に適応されている。カスパーゼBiFCは、炎症性カスパーゼ活性化における第1ステップを測定し、二量体化を促進するために近接を誘導する。CARD含有カスパーゼプロドメインをコードするプラスミドの発現は、光線上黄色蛍光タンパク質Venusの非蛍光断片に融合(Venus−C[VC])およびVenus−N[VN])が使用される。2つのカスパーゼプロドメインが活性化プラットフォームにリクルートされるか、または誘導された近接を受けると、金星の2つの半分が近接し、リフォールドおよび蛍光を発することを余儀なくされる( 図1A、B参照)。これは、特定の炎症性カスパーゼ活性化のリアルタイム読み出しを提供する。
ヒトMDMは、危険シグナルや病原体産物を同定するインフラマソーム遺伝子やパターン認識受容体を豊富に発現しています。これは、炎症性カスパーゼ経路の尋問に理想的な細胞型を提供する。さらに、それらは末梢血から、さらには患者サンプルから誘導して、特定の疾患状態における炎症性カスパーゼ活性化を評価することができる。このプロトコルでは、ヌクレオフェクションを使用してBiFCカスパーゼレポーターをMDMに導入する方法、エレクトロポレーションベースのトランスフェクション法、炎症性カスパーゼ活性化を誘導するために細胞を治療する方法、および顕微鏡アプローチを使用して活性カスパーゼ複合体を視覚化する方法について説明しています。さらに、この方法論は、これらの複合体の分子組成、細胞内局在化、動態、およびこれらの高度に秩序付けられた構造のサイズを決定するために適合させることができる25、26、27。

<table><tbody><tr><td>48ウェル組織培養2:34プレート</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-108</td><td></td></tr><tr><td>10 cm組織培養皿VWR</td><td></td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>2メルカプトエタノール1000x</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>8ウェルチャンバーカバーガラスと1.5 HPカバーグラス</td><td>Cellvis</td><td>c8-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACSカラム</td><td>Miltenyi(Biotec)</td><td>130-021-101</td><td>AutoMACS Proセパレーターのみによる自動分離の場合</td></tr><tr><td>AutoMACS Proセパレーター</td>のみ <td>Miltenyi(バイオテック)</td><td>130-092-545</td><td>AutoMACS Proセパレーターのみを使用した自動分離の場合</td></tr><tr><td>AutoMACS Pro洗浄液</td><td>ミルテニー(バイオテック)</td><td>130-092-987</td><td>AutoMACS Proセパレーターのみを使用した自動分離の場合</td></tr><tr><td>AutoMACSリンス液</td><td>ミルテニー(バイオテック)</td><td>130-091-222</td><td>AutoMACS Proセパレーターを使用した自動分離の場合</td></tr><tr><td>AutoMacsのみ ランニングバッファー</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-091-221</td><td>QuadroMACSまたはAutoMACS pro Separator</td></tr><tr><td>Axio Observer Z1 CSU-X1A 5000回転ディスクユニット</td><td>Zeiss</td><td></td><td>を搭載した電動倒立顕微鏡を使用した手動または自動分離の場合568 nm (RFP) と 488 nm または 512 nm (GFP または YFP) の波長のレーザーラインを装着したレーザーモジュールを装備した共焦点顕微鏡を使用することができます</td></tr><tr><td>AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>568 nm (RFP) と 488 nm または 512 nm (GFP または YFP) の波長を励起できる蛍光フィルターを備えた任意の落射蛍光顕微鏡を使用することができます</td></tr><tr><td>CD14+ MICROBEADS</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-050-201</td><td>QuadroMACSまたはAutoMACS pro Separator DPBSを使用した手動または自動分離の場合</td></tr>、<tr><td>塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まない</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>DsRed mito plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>蛍光レポーターとして使用できる同様のプラスミドは、Addgene</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS 6 x 100にあります。mL</td><td>Sigma</td><td>GE17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050079</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC2011</td><td></td></tr><tr><td>Hemin BioXtra, from Porcine, &ge;96.0% (HPLC)</td><td>Sigma</td><td>51280-1G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>炎症性カスパーゼ BiFC プラスミド</td><td></td><td></td><td>LBHラボからのリクエストにより入手可能</td></tr><tr><td>LPS-EB Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-3PELPS</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-042-401</td><td>QuadroMACSセパレーターのみを使用した手動分離用</td></tr><tr><td>MACS 15 mL チューブラック</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-091-052</td><td>QuadroMACSセパレーターのみを使用した手動分離用</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-042-303</td><td>QuadroMACSセパレーターのみを使用した手動分離の場合</td></tr><tr><td>mCherryプラスミド</td><td>Yungpeng Wang Lab</td><td></td> 蛍光<td>レポーターとして使用できる同様のプラスミドは、Addgene</td></tr><tr><td>Neon Transfection Systemで見つけることができます</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MPK5000</td><td>ネオンエレクトロポレーション装置、ピペット、ピペットステーション</td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム 10 & マイクロ;Lキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MPK1096</td><td>再懸濁緩衝液R、再懸濁緩衝液T、電解緩衝E、96 x 10 &micro;L ネオンチップとネオンエレクトロポレーションチューブ</td></tr><tr><td>ニゲリシンナトリウム塩、既製溶液</td><td>シグマ</td><td>SML1779-1ML</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン臭化水素酸塩</td><td>シグマ</td><td>P7280-5mg</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター</td><td>ミルテニー (バイオテック)</td> <td>130-090-976</td><td>手動分離用QuadroMACS セパレーターのみ</td></tr><tr><td>qVD-OPh</td><td>Fisher (ApexBio)</td><td>50-101-3172</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 中</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA、pH 8.0</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen 2.6 (ブルーエディション) ソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td></td>は<td>、選択した共焦点顕微鏡を操作するために使用される任意のソフトウェア</td></tr></tbody></table>

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

炎症性カスパーゼは、カスパーゼ−1、−4、−5、−11、および−12を含み、開始カスパーゼのサブグループに属する。カスパーゼ-1は、炎症シグナル伝達の正しい調節を確実にするために必要であり、インフラマソームへの動員に続く近接誘導二量体化によって活性化される。カスパーゼ-1は単球系細胞系譜に豊富であり、炎症誘発性サイトカインインターロイキン(IL)-1βおよびIL-18の成熟を活性分泌分子に誘導する。他の炎症性カスパーゼでは、カスパーゼ−4および−5(ならびにそれらのマウスホモログカスパーゼ−11)は、ピロトーシスを誘導することによってIL−1β放出を促進する。カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)は、カスパーゼ活性化の読み出しとして炎症性カスパーゼ誘導近接を測定するために使用されるツールです。インフラマソームに結合する領域を含むカスパーゼ-1、-4、または-5プロドメインは、黄色蛍光タンパク質Venus(Venus-N [VN]またはVenus-C [VC])の非蛍光断片に融合され、カスパーゼが誘導近接したときに蛍光金星複合体を改質する。このプロトコルは、ヌクレオフェクションを使用してこれらのレポーターを初代ヒト単球由来マクロファージ(MDM)に導入する方法、炎症性カスパーゼ活性化を誘導するために細胞を治療する方法、および蛍光および共焦点顕微鏡を用いてカスパーゼ活性化を測定する方法を記述している。このアプローチの利点は、生細胞における炎症性カスパーゼ活性化複合体の成分、要件、および局在を同定するために使用することができることである。しかし、細胞の生存率と挙動を損なわないように、慎重な制御を考慮する必要があります。この技術は、インフラマソームレベルでの動的カスパーゼ相互作用の分析、ならびにヒト血液サンプル由来の生きたMDMおよび単球における炎症シグナル伝達カスケードの尋問のための強力なツールである。

選択されたCD14+単球をGM-CSFと共に7日間インキュベートした後、細胞形態は分化期間の過程で変化し(図3A)、球状浮遊細胞からスピン状および完全に付着する(3日目および4日目)まで、 そして最後に、完全に分化したときに細胞をより広げる(7日目)。次いで、完全に分化した細胞をプレートから剥離し、カスパーゼBiFC対(VCおよびVN)をレポータープラスミド(例えば、ミトコンドリアを標的とする赤色蛍光タンパク質をコードするプラスミド)と共にトランスフェクトし(例えば、dsRedmito)、トランスフェクトされた細胞を標識するために使用され(図3B)、24時間後のトランスフェクションの効率を評価するために使用される。 NLRP3インフラマソームの組み立てを誘発する既知の炎症促進刺激であるニゲリシン(5μM)で20時間処理したカスパーゼ−...

このプロトコルは、ヒト血液サンプルから単球由来マクロファージ(MDM)を取得するワークフロー、細胞の生存率と挙動を損なうことなく炎症性カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)レポーターをヒトMDMに効率的に導入する簡単な方法、および生細胞における炎症性カスパーゼ活性化を測定するためのイメージングベースのアプローチを記述しています。

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

このプロトコルは、特定の疾患状態の生細胞における炎症性カスパーゼ経路を分子レベルで視覚化および尋問するために使用することができるため、重要である。この技術の主な利点は、初代免疫細胞における炎症性カスパーゼ活性化複合体の成分、要件、および局在を同定するために使用することができることである。わずかな最適化により、この方法は、他の初代細胞およびオリゴマー化によって活性化された一連のタンパク質に適合させることができ、その適用可能性は顕微鏡的方法論に限定されない。まず、完全に分化したマクロファージから10センチメートルの皿に培地を吸引し、温かい無血清RPMI-1640培地で細胞単層を洗浄し、すべての培地を完全に除去する。10センチメートルディッシュあたり2ミリリットルの0.25%温かいトリプシン-EDTA溶液を加えて細胞を回収する。トリプシン−EDTAをP−1000マイクロピペットでディッシュ全体に上下に穏やかにピペットし、次いで懸濁液を5ミリリットルの温かい完全培養培地を含む15ミリリットルの円錐形チューブに移す。明視野顕微鏡下で細胞の剥離を確認し、必要に応じて再度剥離する。培地を吸引し、摂氏37度に予め加温した10ミリリットルの1倍滅菌PBSに細胞を再懸濁する。その後、20マイクロリットルのアリコートを取り、血球計数器を用いて細胞数を決定した。トランスフェクションごとに 10 ~ 5 番目の細胞を 1 ~ 2 回取り、15 ミリリットルのチューブに入れます。予め加温した1X滅菌PBSで15ミリリットルの最終容量にする。PBSを吸引し、250 x gで1分間もう一度遠心分離します。P-200マイクロピペットを用いて細胞ペレットから残留PBSを除去する。トランスフェクションごとに 1.5 ミリリットルの滅菌マイクロチューブを取り、適切なレポータープラスミドとカスパーゼ BiFC プラスミドをフードに加えます。ピペットステーション、装置、チップ、エレクトロポレーションチューブ、およびピペットを滅菌層流フード内に置く。ヌクレオフェクション装置を接続して電源を入れます。表示された起動画面に断面パラメータを入力します。電圧を押し、1000と入力し、Doneを押して1000ボルトに設定します。「幅」を押し、「40」と入力し、「完了」を押してパルスを 40 ミリ秒に設定します。最後に、パルスを押し、2と入力し、完了を押して電気パルスの数を2に設定します。エレクトロポレーションチューブの1つを取り、室温で3ミリリットルの電解バッファーEで満たします。エレクトロポレーションチューブをピペットステーションのピペットホルダーに挿入し、チューブ側面の電極が内側を向いており、チューブを挿入するとカチッという音が聞こえることを確認します。細胞ペレットを取り、5番目の細胞にそれぞれ1〜2回ずつ10〜2回ずつ10マイクロリットルの予め加温した再懸濁R緩衝液を加え、P−20マイクロピペットで穏やかに混合する。10マイクロリットルの細胞懸濁液を各トランスフェクションチューブに加え、P-20マイクロピペットで穏やかに混合する。プッシュボタンを2番目のストップに押してチップをピペットに挿入し、クランプが先端のピストンの取り付けステムを完全に持ち上げていることを確認します。次に、ピペットのプッシュボタンを押して最初の停止し、細胞またはプラスミドDNA混合物を含む第1のチューブに浸漬してサンプルを吸引します。サンプルを含むピペットをピペットホルダーに慎重に挿入し、ピペットがカチッと音を立てて適切に配置されていることを確認します。タッチスクリーンでStartを押し、電気パルスが届くまで待ちます。ステーションからピペットをゆっくりと取り外し、プッシュボタンをゆっくりと押して最初の停止まで押して、トランスセクトされた細胞懸濁液を、予め加温された抗生物質を含まない培地で対応するウェルに直ちに加える。プレートを形質移入細胞で穏やかに揺らし、加湿組織培養インキュベーター内で1〜3時間インキュベートし、次いで200マイクロリットルの予め加温した培養培地を各ウェルに加える。ディッシュをインキュベーターに入れ、遺伝子発現のために少なくとも24時間放置する。翌日、落射蛍光顕微鏡を用いて細胞生存率およびトランスフェクション効率を検査する。P-1000マイクロピペットで細胞から培地を慎重に取り出し、ウェルの側面に500マイクロリットルの刺激溶液を加えます。未処理のコントロールウェルを稼働させるには、刺激を与えずにイメージング培地を加える。落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して細胞を視覚化するには、指示に従って顕微鏡と蛍光光源をオンにします。10回または20回対物レンズを選択し、培養皿を顕微鏡ステージ上に置きます。アイピースで568ナノメートルフィルターの下の細胞を見つけます。レポーター赤血球を発現する細胞に着目した。視野内のすべての赤いセルを数えます。同じ視野で、488 または 512 フィルターに変更し、緑色の赤いセルの数を数えます。少なくとも 3 つのフィールドの赤セルを少なくとも 100 個数えます。視野あたりの金星陽性形質移入細胞の割合を計算し、得られたパーセンテージを各処理ウェルの平均化して標準偏差を求めます。落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化するには、カメラによって取得されたコンピュータ画面上の細胞のライブ画像を視覚化する。ジョイスティックコントロールとフォーカスホイールを使用して、セルのフォーカスと位置を微調整します。512 ナノメートルまたは 488 ナノメートルおよび 568 ナノメートルのレーザーのレーザー出力と露光時間の割合を設定して、画像内の信号が飽和せずに良好に見えるようにします。ライブキャプチャをオンにして、結果の画像を調べて、両方のチャンネルの表示ヒストグラムで各フロアに明確なピークが見られることを確認します。細胞のライブ画像を視覚化しながら、プレートの各ウェルについてmCherryまたはdsRedmitoレポーターを発現する1つ以上の細胞を含むフィールドの複数の代表画像を撮影する。GM-CSFと共に7日間インキュベートした選択されたCD-14陽性単球は、分化期間の経過にわたって細胞形態の変化を示し、球状の浮遊細胞からスピン状かつ完全に付着し、最後に、完全に分化するとより広がった細胞へと変化した。完全に分化した細胞を、レポータープラスミドdsRedmitoと共にカスパーゼBiFC対VCおよびVNで形質移入し、これを形質移入細胞を標識するために使用した。未処理の細胞は金星蛍光を示さなかった。そしてニゲリシン処理された細胞では、カスパーゼ-1 BiFCはASC斑点の典型的な形状を有する単一の穿刺として現れた。金星陽性MDMの定量は、LPSプラスニゲリシン治療群においてカスパーゼ−1 BiFCの最も高い割合が見られることを示した。カスパーゼ-1、4、および5つのpro-BiFCペアのプラスミド滴定では、金星陽性細胞の割合が最も高かったのは、それぞれ400、500、および1,000ナノグラムのトランスエクトプラスミドから生じました。細胞のフィールドを24時間後切除して得られた共焦点画像は、未処理の経流細胞がミトコンドリアが無傷であるように生存可能であることを示した。ヘムで処理した後、カスパーゼ-1複合体は、ニゲリシンによって誘導されるものと同様の単一の緑色の穿刺として現れる。分化、トランスフェクション、および治療中に細胞の過酷な条件や過度の操作は、自発的な活性化とカスパーゼ活性化の高いバックグラウンドレベルをもたらす可能性があるため、避けてください。

visualization-inflammatory-caspases-induced-proximity-human-monocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

内皮のCa2 +シグナリングのパラクリン由来ROSの誘導を可視化についての洞察を得るために効率的な方法が記載されている。このメソッドは、共培養モデルにおける血管内皮細胞におけるCa 2...

血管のCaの可視化 2 +パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

このビデオは、二分子蛍光相補レポータータンパク質を使用して、ヒトマクロファージのカスパーゼタンパク質の活性化を示しています。カスパーゼ-1のプロドメインは、Venusタンパク質の非蛍光フラグメントと融合しており、Venusタンパク質はインフラマソーム複合体に動員されます。インフラマソームの近接性は、Venusフラグメントのリフォールディングと蛍光を誘導し、マクロファージにおけるカスパーゼの活性化を確認します。...

ヒト単球由来マクロファージにおけるカスパーゼ活性化の可視化

このビデオでは、蛍光レポータープローブを使用してマクロファージのNLRP3インフラマソーム活性化を検出する方法を示します。細胞をイオノフォアカリウムとグリシンで処理して、インフラマソームの組み立てとカスパーゼ-1の活性化を誘導します。蛍光レポータープローブは活性化されたカスパーゼ-1を可視化し、細胞を蛍光色素で染色して核を可視化します。...

蛍光顕微鏡法によるインフラマソーム活性化の検出

このビデオは、免疫蛍光法を介して初代マクロファージにおけるNOD様受容体ファミリーピリンドメイン含有3（NLRP3）インフラマソーム形成を研究する技術を示しています。マクロファージは、最初に細菌のリポ多糖(LPS)でプライミングされ、NLRP3タンパク質の発現をアップレギュレートします。マクロファージをニゲリシン(カリウムイオノフォア)に曝露すると、NLRP3が活性化され、インフラマソームが形成され、免疫蛍光法によって可視化されます。...

マクロファージにおけるインフラマソーム複合体形成を研究するためのIn Vitro技術

このビデオは、インフルエンザウイルスによる刺激による骨髄由来マクロファージの複数のカスパーゼ活性化の評価を示しています。マクロファージ溶解、ライセートの熱不活性化、および遠心分離に続いて、細胞内カスパーゼを回収し、その後の免疫学的分析を行います。...

マクロファージにおける複数のカスパーゼの活性化の評価

このプロトコルは、高い細胞活力と分化と偏光のための完全なマクロファージの容量を維持しつつ、高いトランスフェクション効率でエレクトロポレーションによってsiRNAまたはプラスミドDNAを用いたヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクションするための効率的で信頼性の高い手法を提案する。...

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング...

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

蛍光顕微鏡を使用し、アクティブなカスパーゼ 1 のアダプター、ASC 染色細胞単位で炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化の検出について述べる。乳酸脱水素酵素のリリースの試金である人口に基づいて pyroptotic 換散を検出する.

インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

ここでイメージの単一食イベントに回転ディスク共焦点顕微鏡を用いたマウス腹腔マクロファージの方法について述べる。他の貪食細胞に、プロトコルを拡張できます。...

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

このプロトコルは、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシス、およびパンノプトーシスなどの細胞死経路の開始を決定するための感染、無菌の侮辱、および癌のin vitro および in vivo...

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

本プロトコルは、フローサイトメトリーまたは分光蛍光光度計を使用して蛍光発生基質を介してカスパーゼ活性を測定する2つの方法を記載する。...

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

学ぶヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼの可視化法。BiFCレポーターを用いて生細胞内のカスパーゼ活性化複合体の局在と構成要素を同定し、免疫応答の分子メカニズムを解明する。

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

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