T細胞と支持された平面脂質二重膜との相互作用を研究するためのIn Vitro技術

支持された脂質二重層(SLB)を含むフロースライドを取ります。

SLBは、蛍光色素で標識された特定のリガンド(細胞間接着分子1またはICAM-1および抗CD3抗体)に結合します。

T細胞と蛍光色素タグ付き抗CD107a Fab(脱顆粒マーカーに対する抗体の抗原結合フラグメント)を追加します。

T 細胞受容体 CD3 または TCR-CD3 複合体は抗 CD3 抗体に結合し、TCR を誘発します。

トリガー誘発性インサイドアウトシグナル伝達は、固定化されたICAM-1に結合する表面のインテグリンを活性化します。

結合は、細胞骨格の再編成、つまり微小管の再配列、およびSLB表面での細胞の横方向の広がりにつながるアクチン重合を誘導します。

拡散により、より多くのリガンドと受容体の相互作用が超分子活性化クラスターまたはSMACを形成し、免疫シナプスを作成します。

T細胞溶解顆粒は微小管に沿って移動し、原形質膜と融合し、細胞表面に脱顆粒マーカーを露出させ、抗CD107a Fabに結合します。

蛍光顕微鏡を使用して、TCR-CD3複合体、インテグリン、および脱顆粒マーカーが豊富な免疫シナプスを視覚化します。

ポリプロピレンハサミタイプの鉗子を使用して、ガラスカバーガラスを調製したての酸性ピラニア溶液に25〜30分間沈めます。洗浄の最後に、洗浄ごとにカバーガラスを新鮮な量の超純水で7回すすぎ、濡れたカバーガラスを脇に置いて、残りの水をきれいなガラスから転がします。

カバーガラスが乾いたら、最終的なリポソーム混合物2マイクロリットルを、滅菌フローフード内の粘着スライドチャネルの中央に正確に分注し、すぐに、しかし慎重に、1つの清潔で乾燥したカバーガラスをスライドに合わせて、カバーガラスをスライドの粘着面に静かに下げ、ポリプロピレンはさみタイプの鉗子の外輪を使用して、スライドでカバースリップを貼り、漏れを防ぐためにスリップがスライドにしっかりと取り付けられていることを確認してください。次に、スライドを裏返し、油性マーカーを使用して、スライドアセンブリの外側にある二重層の周りに 4 つの点を描きます。

最初の注入の前に、チャネルの1つのポートを入口ポートとして指定し、もう1つのポートを出口ポートとして指定し、実験全体を通してこの指定を維持します。気泡の発生を避けるため、スライドチャネルのゴム製シールがチップに浸透しているのを感じるまで、ピペットチップの端を入口ポートに直接挿入します。

ゆっくりと、チャネルに50マイクロリットルの温かいアッセイバッファーを入れます。カゼインブロッキング溶液中の200マイクロリットルの塩化ニッケル(II)を入口ポートに注入し、出口ポートから50マイクロリットルのバッファーを取り出します。45分間のインキュベーション後、余分なカゼイン溶液を出口ポートから取り除きます。

100マイクロリットルのICAM-1とストレプトアビジン溶液をエントリーポートに注入し、室温で45分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、出口ポートから余分なタンパク質溶液を取り除き、洗浄ごとに100マイクロリットルのアッセイバッファーで二重層を2回洗浄します。次に、実証されているように、100マイクロリットルの蛍光色素結合抗CD3抗体で二重層を室温で45分間標識し、続いて洗浄ごとに100マイクロリットルのアッセイバッファーで2回洗浄します。

T細胞と二重層の相互作用を画像化するには、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡の摂氏37度加熱ステージにスライドを置き、インクマークを使用してステージを調整し、二重層を100度対物レンズの中央に配置します。

顆粒放出イメージングの場合は、蛍光結合抗CD107a抗体FabフラグメントをCD4 T細胞懸濁液に加え、標識細胞を50マイクロリットルのアッセイバッファーに再懸濁してスライドチャネルの入口ポートに注入します。次に、適切な数の実験フィールドを選択し、注入後30分間、各フィールドの画像を1分に1回記録します。