Name: 免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学ぶ 支持平面二重層を用いた免疫シナプス形成の可視化手法。TIRF顕微鏡で細胞接着タンパク質の動態を観察し、免疫応答におけるシナプス相互作用の理解を深める研究法を解説します。

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1。脂質の準備<ol><li>二重層の上部のリーフレットにタンパク質をリンクするために、我々は、Ni 2を使用してください+キレート脂質、ポリヒスチジンタグを持つアンカー組換えタンパク質を。特定の細胞型は、Ni 2 +でコーティングされた二重層へ非特異的に付着する可能性がありますが、T細胞は、一般的にT細胞活性化を研究するためのこの方法が最適なこと、しないでください。 </li><li>脂質二重層液をクロロホルム-メタノールの1〜2 mlのガラス管に適当な量のNi 2 +キレート脂質と80％のホスファチジルコリン20％の溶液を調製することによって行われます。 <ol><li>暖かい（30〜37℃）の水浴中で窒素ガス気流下で溶媒を蒸発させる。これは通常、約15分かかります。 </li><li> 90分間凍結乾燥機を使用して、高真空下で、残りの溶剤を削除します。 </li></ol></li><li>混合界面活性剤/リン脂質ミセルのソリューションを作成するトリス - 生理食塩水緩衝液、2％N -オクチル-グルコシドの洗剤で脂質を溶解する。最終的なリン脂質濃度は、0.4mMのはずです。リポソームを形成するために、洗剤とフォームリポソームを削除するには、トリス - 生理食塩水を3変更を避けるために、このソリューションを透析。我々は通常、10 kDaの周りのカットオフを持つスペクトラ/ POR第2配管直径6mm 1 mlの順に容量ボリュームで機能します。我々は、チューブをクランプするとき、任意の気泡のを除外するように注意です。我々は典型的には、滅菌フィルターこのソリューションおよび70％エタノール、滅菌手袋を使用してそれを処理し、クリーンな条件下での透析を行う。 </li><li>このソリューションでは、水晶明確にする必要があります。それは酸化を防ぐために、アルゴンガス下に格納されています。解決策が濁っている場合は、多層小胞が生成されている、と再度起動する必要があります。 </li></ol> 2。 ICAM - 1とMHCは平面二重膜上に堆積されているどのくらいの決定<ol><li>実験をセットアップするためには、可溶性タンパク質の特定の濃度でのNi 2 +キレート二重層の特定の表面積上に堆積されているどのくらいのICAM - 1とMHCを決定するためにまず必要です。 5マイクロメートル径のガラスビーズでの預金二重層、これを行うには、イメージングに使用されるフ​​ローの細胞のもの、およびフロー免疫蛍光アッセイによる結合タンパク質の密度を読み出すおおよそその条件下でのタンパク質溶液とガラスビーズをインキュベートする。 </li><li>フルオレセイン分子当たりの知られている番号とFITC標識抗体を表面に結合したタンパク質を検出するために使用されます。フルオレセイン標準ビーズをフローmicrofluorimeterをキャリブレーションに使用されます。 </li><li>我々は、I - EK - MCC91 - 103複合体のICAM - 1の200molecules/μm2と0.2から20molecules/μm2と抗原提示細胞上のものに近似する条件を確立します。 </li></ol> 3。平面脂質二重層を形成するためのガラスのカバースリップのクリーニング<ol><li>平面脂質二重層は、リポソームがガラスに融合するときに自発的に形成するが、ガラスが適切に洗浄されている場合のみ。 </li><li>ピラニアで作業する場合、我々は酸のエプロンと重い、耐酸性の籠手を含む、完全な防護服を着用してください。慎重に、有機廃棄物から廃棄物を分離し、適切に処分する。 </li><li>酸のピラニア溶液を調製するために、乾燥したビーカーに濃硫酸75mlのを追加し、慎重に30％過酸化水素25mlを加える。ソリューションは、急速に超えて100℃に加熱</li><li> 15分間溶液中で乾燥したカバーグラスを浸し。ソリューションから削除し、それぞれの側分間精製水ですすいでください。精製水を切るために真空源を用いてカバースリップを乾かします。ピラニア溶液を冷却し、よくドラフト内でマークキャップ緩み、が残っているピラニアの廃棄物コンテナに追加することができます。リポソーム、カバーガラス、及びタンパク質のすべてが準備されている場合、免疫シナプスが形成される準備ができています。 </li></ol> 4。二重層を形成する<ol><li>脂質二重層を形成するために、私たちの研究室では、統合された加熱の利点を持っているBioptechs FCSIIチャンバーを、使用しています。 FCSIIシステムは、ステンレス製のベースになりますが一緒にクランプの反対側の流体溝と0.5ミリメートルトップガスケット、一方の表面に加熱するためのインジウムスズ酸化物で被覆microaqueductスライド、マイクロ流体マニホールド、ダストフリー0.25ミリメートルフローチャンバーとピラニアの高さを定義するガスケットは、二重層が形成されている40mmの円形のカバースリップを掃除した。 </li><li>二重層が形成される際に、カバースリップは、親水性の高い、クリーンにする必要がある一方でそれはより疎水性なら、microacqueductスライドは、実際にうまく機能します。 microaqueductを作ることはより多くの疎水性は、純水で洗浄し、この調整のプロセスの後、同様の用途の間で完全に乾燥、室温で60分間、1％HSAで処理することにより達成されます。この手順によって残された変性タンパク質のコーティングは、リポソーム懸濁液を1μl、ラウンド、hemisphericaを形成することができます&gt; 0.25 mmの高であるlのドロップ。 </li><li>フローセルとフォーム平面二重膜を組み立てるには、平らな表面上に、上向きに指示チューブで、マニホールドを配置。その後、0を置きます。それが平らに装着さ​​れていることを確認して、流体管の上に置く穴と5 mmのガスケット。ゆっくりと上向きに流体チャンネルとガスケットにmicroaqueduct側に配置し、スライドの穴がマイクロ流体管に合わせていることを検証するまでは、どんな下向きの圧力を適用せずにフラットシートを確認してください。チャネルが流体チャネルと揃うとは大きな空気のスペースがないことになるようにmicroaqueductスライドの上から長方形のカットでダストフリー0.25mmのガスケットを置きます。 </li><li>各ドロップの中心間距離が2.5mmになるようなパターンでmicroaqueductスライドの表面に5にリポソーム懸濁液のX1μlの水滴を置きます。 5リポソーム滴は異なる組成を持つことができますが、この場合、我々は2つだけ二層、ニッケル2 + +キレート脂質および10％のNi 2 + +のキレート脂質とつのNOを持つものを形成します。 </li><li>これらのドロップが正しく設定されると、慎重にカバーが一つの動きの面を下にスリップ置きます。できるだけ早くベースの上にクランプ。リポソーム滴はカバースリップとの接触を確認する必要があります。脂質二重層は、おそらくすでに形成されているので、この接点は、異常はありません。すべての中断は、欠陥のある二層になることがあります。 </li><li>顕微鏡のカバーの位置決めを支援するためにmicroacqueductスライド上のいくつかの小さなインクスポットのある二層の位置をマークするために覚えておくことが重要です。システムが平衡しているか確かめる為に、20分待ってください。約20フレキシブルチューブのcmおよび3方活栓に接続した20mlの注射器を使用して、すべてのソリューションを転送します。コックとフローセルの間にデッドボリュームを最小限に抑えるためにチューブの短い長さでフローセルに活栓の別のポートを接続します。 2mMのMgCl 2、1mMのCaCl 2、5mMグルコースと1％ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水HEPES緩衝でシリンジを埋める。 </li><li>に気泡がないので素数ではチューブとコック。フローセルにこれを接続していない空気の泡が二重層を通過しないことを確認するために、見ながら一つの動きで5ミリリットルを介してプッシュ。今、あなたの二重膜を持つことになります。 </li></ol>条件：このビデオの記事は&quot;アメーバロコモーションの主題による変奏曲など、免疫学的シナプスとKinapsesギャザラと戻るハンター&quot;サポートされています<a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">マイケルL.ダスティン</a> 、 <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">細胞および発生生物学の年次レビュー</a> 、ボリューム24、2008。

免疫シナプスとkinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

サポートされている平面脂質二重層は、免疫学的シナプスの分子間相互作用をモデル化するために使用できる強力なツールです。リンパ球と抗原提示細胞間の相互作用を模倣するために、我々は、ポリ - ヒスチジンタグを持つ二層の上部のリーフレットに組換え細胞接着およびMHCタンパク質を固定するNI2 +キレート脂質を使用してください。平面脂質二重層は、脂質の準備二重層が形成されるガラスの表面を処理し、リンパ球が追加されるフローセルを含む特殊なチャンバー内の二重層を形成することによって生成されます。その後、二層をNiで起訴され、Hisタグ融合組み換えタンパク質が追加されます。最後に、リンパ球は、フローセルに注入され、全反射顕微鏡は、画像のシナプス形成とメカニズム、その制御性T細胞の移動運動、受容体のソートのサイト、および受容体の劣化の部位に使用することができます。

サポートされている平面脂質二重層は、免疫学的シナプスの分子間相互作用をモデル化するために使用できる強力なツールです。ここで、我々は、脂質のbilyerの上部のリーフレットにシナプス形成を調節し、全反射顕微鏡を用いてシナプス形成を可視化するために知られている細胞接着タンパク質を固定するための方法を示しています。

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

支持平面脂質二重層は、免疫シナプスにおける分子相互作用をモデル化するために利用できる強力なツールである。相互作用を模倣するために……

こんにちは、Geral Instituteおよびニューヨーク大学医学部のMike Dustinです。本日は、免疫シナプスの研究に用いる支持平面バイレイ（supportive planar Biolay）の作製手順について解説します。それでは始めましょう。脂質二重層を作製するために、ガラスチューブ内で、20%のニッケルキレート脂質と80%のホスファチジルコリンを適切な量で、1〜2 mLのクロロホルム・メタノールに溶解させ溶液を調製します。最初のステップとして、30〜37 °Cの温水バス中で、窒素ガス気流下で溶媒を蒸発させます。この操作には通常、約15分かかります。次に、ライオフィライザーを用いて高真空下で90分間、残存する溶媒をすべて除去します。続いて、脂質を2%N octal glucocide界面活性剤を含む生理食塩水バッファーに溶解し、最終濃度を0.4 millimolarにします。これにより、リポソームを形成するための界面活性剤とホスホリピドの混合ミセル溶液が作成されます。この溶液をTris塩溶液で3回交換しながら透析し、界面活性剤を除去してリポソームを形成させます。通常、1 mL程度の容量を用い、カットオフ値が約10 kDaの直径6 mmのチューブを使用し、チューブをクランプする際に気泡が入らないよう注意します。この溶液を滅菌フィルターでろ過し、クリーンな条件下で透析を行い、70%エタノールで滅菌した手袋を用いて取り扱います。この溶液は結晶のように透明である必要があり、酸化を防ぐためにアルゴンガス下で保存します。溶液が濁っている場合は、多重層小胞が生成されているため、最初からやり直す必要があります。実験を準備するために、まず、可溶性タンパク質の特定の濃度において、ニッケルキレート脂質二重層の一定の表面積にどれだけのICAM-1およびMHCが沈着するかを決定する必要があります。この操作を行うため、直径5 µmのガラスビーズ上に二層膜を堆積させます。イメージングに使用するフローセルに近い条件下で、ガラスビーズをタンパク質溶液とともにインキュベートし、その後、フロー免疫蛍光測定法によって結合タンパク質の密度を読み取ります。分子あたりのフルオレセイン数が既知のFITC標識抗体を用いて表面結合タンパク質を検出し、フルオレセイン標準ビーズを用いてフローマイクロフルオリメーターの校正を行います。ICAM-1を1平方マイクロメートルあたり200分子、I-E-K-M-C-C 91 1 0 3複合体を1平方マイクロメートルあたり0.2～20分子とし、抗原提示細胞に近い条件を構築します。リポソームがガラスに融合すると平面脂質二重層が自発的に形成されますが、これはガラスが適切に洗浄されている場合にのみ起こります。我々は、有機物をすべて除去し、ガラス表面を非常に親水性にすることのできる、硫酸と30%過酸化水素の調製直後の混合液であるピラナ溶液を使用します。ピラニア溶液を使用する際は、耐酸エプロンや厚手の耐酸手袋を含む完全な保護衣を着用します。廃液は有機廃液と慎重に分別し、適切に処理する必要があります。ピラニア溶液を調製するには、乾燥したビーカーに濃硫酸 75 milliliters を加え、そこに 30%過酸化水素 25 milliliters を慎重に加えます。溶液が急速に加熱され100 °C以上に達した後、乾燥させたカバーガラスを溶液に15分間浸します。ピラニア溶液でのインキュベーション後、カバーガラスを精製水に浸し、その後各面を1分間ずつすすぎます。次に、真空源を用いて精製水を排出し、カバーガラスを乾燥させます。ピラニア溶液を冷却させ、ドラフト内に設置し、キャップを緩めて明確に標記したピラニア廃棄容器に回収します。二層膜を形成させるため、当研究室では加熱機能が統合されている利点を持つbi FCS twoチャンバーを使用しています。FCS twoシステムはステンレス製のベース上に設置されており、マイクロ流体マニホールドと0.5 millimeterのトップガスケット、および一方の面に加熱用の酸化インジウムスズ（ITO）がコーティングされ、もう一方の面に流路溝があるマイクロアクアダクトスライドをクランプで固定する構造となっています。フローチャンバーの高さを規定するダストフリーの0.25 millimeterガスケットと、ピラニア溶液で洗浄した、バイレイヤーを形成させるための40 millimeter円形カバーガラスを用いて、フローセルを組み立て平面バイレイヤーを形成します。チューブが上を向くようにマニホールドを平らな面に置きます。次に、流体チューブの上に穴が位置するように0.5 millimeterガスケットを配置し、平らに密着していることを確認します。マイクロアクアダクトスライドの流体チャネルを上にして静かに置き、スライドの穴がマイクロ流体チューブと一致していることを確認するまで、下方向への圧力をかけずに平らに設置されていることを確認します。次に、長方形の切り抜きがある、ダストフリーの0.25 millimeterガスケットをマイクロアクアダクトスライドの上に載せ、チャネルが流体チャネルと整列し、大きな気泡が生じていない状態にします。マイクロアクアダクトスライドの表面に、液滴同士の中心間距離が2.5 millimetersとなるパターンで、リポソーム懸濁液を1 µLずつ最大5滴滴下します。これら5つのリポソーム液滴は異なる組成であっても構いませんが、今回は、ニッケルキレート脂質を含まないものと、10%のニッケルキレート脂質を含むものの2種類の二分子層のみを形成します。これらの液滴を配置したら、カバーガラスを一度の動作で慎重に表面に置き、できるだけ速くベースに固定します。リポソームの液滴がカバーガラスに接触している必要があります。この接触を断たないでください。二層膜はおそらくすでに形成されており、いかなる乱れも欠陥のある二層膜につながる可能性があるためです。この時点で、顕微鏡上でのカバーガラスの配置を容易にするため、スライド上のバイレイヤーの位置にインクで小さな点をいくつか付けておくことが重要です。システムが平衡状態に達するまで20分間待ちます。その後、約20 cmの柔軟なチューブと三方活栓に接続した20 mLシリンジを用いて、すべての溶液を移送します。活栓のもう一方のポートは、活栓とフローセルの間の死容量を最小限に抑えるため、短いチューブでフローセルに接続します。塩化マグネシウム、塩化カルシウム、グルコース、およびヒト血清アルブミンを含むHEPES緩衝生理食塩水でシリンジを満たします。チューブとストップコックをプライミングし、気泡がない状態にします。次に、これをフローセルに接続し、脂質二層膜上に気泡が通過しないことを確認しながら、一度の動作で5 mLを押し流します。次に、Hisタグ付きタンパク質を脂質二重層に導入するための二重層を準備します。まず、カゼインでブロッキングを行い、ニッケルをチャージさせる必要があります。1 mLのシリンジにカゼイン・ニッケルイオン溶液を満たし、気泡が入らないようにサイドポートに接続してください。溶液を注入した後、完全にブロッキングさせるため20分間待ちます。次に、20 mLシリンジを用いてH-B-S-H-S-Aでブロッキング溶液を洗い流します。その後、polyhisタグ付きICAM-1およびIEKを含むH-B-S-H-S-A溶液 0.5 mLを注入します。本実験では、ICAM-1をSCI-5で標識します。これにより、バイレイヤー（脂質二重層）におけるICAM-1の再編成をイメージングすることで、LFA-1とICAM-1の相互作用を追跡することが可能になります。タンパク質がニッケル電荷バイレイヤーに結合するまで30分間放置し、タンパク質をバイレイヤーに吸着させます。カスタムステージインサートを用いて、フローセルを倒立顕微鏡に固定してください。次に、加熱電子回路を接続し、システムを37 °Cで平衡化させます。先に付けたマークを用いて、対物レンズが二重層のいずれかと一致するようにフローセルを配置し、視野絞りの反射光像に焦点を合わせることで、干渉反射顕微鏡を用いて焦点面を特定します。最後に、フローセルから未結合のICAM-1を洗浄して除去します。turf Mモードおよびワイドフィールドモードを用いて、ICAM-1チャネルでバイレイヤーの蛍光画像を取得します。これにより、ニッケルフリーのバイレイヤーと比較して、ニッケルコーティングされたバイレイヤーにICAM-1が結合していることを確認します。これで、フローセルに細胞を導入する準備が整いました。今回のデモンストレーションでは、retrovirus ENCによってGFPとZap 70が導入されたND T細胞受容体トランスジェニックT細胞を使用します。細胞をHBSSで1回洗浄し、TCRマイクロクラスターを追跡できるよう、Alexa 568で標識したT細胞受容体に対するFab断片とともに細胞をインキュベートします。15分後、細胞を10倍に希釈します。これにより、TIRF顕微鏡イメージングを妨げない程度までAlexa 568抗体を希釈しますが、最初に結合したFabが解離し始めるため、T細胞受容体の飽和状態を維持します。その後、細胞をフローセルに注入します。3色ターフMモードを用いて免疫シナプスをイメージングします。これには、LFA-1とICAM-1の相互作用の形成、TCRクラスターおよびc-SMACの形成、そしてGFP-ZAP-70をリクルートするTCRマイクロクラスターの持続的な形成が含まれます。これらの結果の一部は取得中に明らかになりますが、他の結果を十分に評価するには、後処理による解析が必要となります。以上で、支持平面脂質二重層を用いて免疫シナプスを研究する方法について説明しました。これらの実験を成功させるには、T細胞が非常に良好な状態であることが極めて重要です。PBS緩衝生理食塩水は、T細胞の長期培養には適していません。そのため、細胞を培養液から取り出してこの媒体に移し、速やかに使用するようにしてください。より長期的な実験を行いたい場合は、リン酸緩衝生理食塩水の代わりに使用できる優れた無血清培地の処方がいくつかあります。サイトカイン産生やT細胞の増殖など、より長期的なエンドポイントを測定したい場合には、これらの培地を使用することで細胞をより長く生存させることができます。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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