免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

サポートされている平面脂質二重層は、免疫学的シナプスの分子間相互作用をモデル化するために使用できる強力なツールです。ここで、我々は、脂質のbilyerの上部のリーフレットにシナプス形成を調節し、全反射顕微鏡を用いてシナプス形成を可視化するために知られている細胞接着タンパク質を固定するための方法を示しています。

こんにちは、ジェラル研究所とニューヨーク大学医学部のマイク・ダスティンです。今日は、免疫学的シナプスの研究のために支持的な平面Biolayを形成する手順をご案内します。それでは始めましょう。

脂質二重層を作るために、1〜2ミリリットルのクロロホルムメタノールを含むガラス管に、20%ニッケル、キレート脂質、および80%ホスファチジルコリンの適量溶液を調製します。最初のステップは、摂氏30〜37度の温かい水浴で窒素ガスの流れの下で溶媒を蒸発させることです。通常、これには約 15 分かかります。

次に、凍結乾燥機を使用して高真空下で90分間残っている溶媒を除去します。次に、脂質を2%Nオクタルグルコサイド界面活性剤インタレスト生理食塩水バッファーに溶解し、最終濃度0.4ミリモルにします。これにより、混合界面活性剤リン脂質菌の溶液が作成され、リポソームが形成されます。

この溶液をトリス生理食塩水の3回の変化に対して透析し、界面活性剤を除去してリポソームを形成します。通常、直径6mmのチューブで1ミリリットル程度の体積で作業し、カットオフは約10キロダルトンで、チューブをクランプする際に気泡を排除するように注意しています。この溶液を滅菌ろ過し、清潔な条件下で透析を行い、70%エタノール滅菌手袋を使用して取り扱います。

この溶液は透明で、酸化を防ぐためにアルゴンヌガスの下に保管する必要があります。溶液が濁っている場合は、多層小胞が生成されているため、最初からやり直す必要があります。実験を開始するには、まず、ニッケルキレート二重膜の所定の表面積に、所定の濃度の可溶性タンパク質でICAMワンとMHCがどれだけ沈着するかを決定する必要があります。

これを行うには、直径5マイクロメートルのガラス速度に二重膜を堆積させます。イメージングに使用したフローセル内の条件に近い条件下で、ガラスビーズをタンパク質溶液とインキュベートし、フロー免疫蛍光測定法で結合タンパク質の密度を読み取ります。分子あたりのフルオレセイン数がわかっているFSI標識抗体を使用して表面結合タンパク質を検出し、フルオレセイン標準ビーズを使用してフローマイクロ蛍光計のキャリブレーションを行います。

抗原提示細胞に近似する条件を、ICAM 1の1平方マイクロメートルあたり200分子、1平方あたり0.2〜20分子で設定します。I-E-K-M-C-C 91 1 0 3のマイクロメータは、リポソームがガラスに融合するときに複雑な平面二重層が自然に形成されますが、ガラスをきれいにするために適切に洗浄された場合に限ります。硫酸と30%の過酸化水素を新たに調製した混合物である酸性ピアーナ溶液を使用しており、すべての有機材料を破壊し、ガラス表面を非常に親水性にします。

ピラニアを扱うときは、酸性エプロンや重酸耐性のあるガントレットなど、完全な防護服を着用します。廃棄物は有機廃棄物から慎重に分別し、適切に処分する必要があります。酸性ピラニア溶液を調製するには、ドライビーカーに75ミリリットルの濃硫酸を加え、次に25ミリリットルの30%過酸化水素を慎重に加えます。

溶液は急速に摂氏100度以上まで加熱され、その後、ドライカバースリップを溶液に15分間浸します。このピラニアでのインキュベーションに続いて、カバースリップを精製水に浸し、両側で1分間すすぎます。次に、真空源を使用してカバースリップを乾燥させ、精製水を排出します。

ピラニア溶液を冷まし、キャップを緩めたままにしておくピラニア廃棄物容器に加え、ヒュームフードによくマークを付けて二重層を形成します。私たちの研究室では、統合された加熱の利点を持つbi FCS 2つのチャンバーを使用しています。FCS 2システムは、0.5ミリメートルのトップガスケットを備えたマイクロ流体マニホールドをクランプするステンレス鋼ベース上にあり、一方の表面に加熱用の酸化インジウムスズでコーティングされたマイクロ水道橋スライドと、もう一方の表面に流体溝があります。

フローチャンバーの高さを定義するほこりのない0.25ミリメートルガスケットと、ピラニアが洗浄された40ミリメートルの丸いカバースリップで、その上にバイレイヤーが形成されてフローセルを組み立て、平面のバイレイヤーを形成します。チューブを上に向けてマニホールドを平らな面に置きます。次に、0.5mmガスケットを流体チューブの上に穴が開いて置き、これが平らに取り付けられていることを確認します。

流体チャネルを上に向けてマイクロ水道スライドを静かに置き、スライドの穴がマイクロ流体チューブと位置合わせすることを確認するまで、下向きの圧力をかけずに平らに座ることを確認します。次に、マイクロ水道橋スライドの上部に長方形の切り欠きが付いたほこりのない0.25ミリメートルガスケットを敷き、チャネルが流体チャネルと一直線に並び、主要な空間がないように、マイクロ水道橋スライドの表面にリポソーム懸濁液を5滴ほど配置します各液滴間の中心間距離が2.5ミリメートルになるようにパターンで。5つのリポソーム滴は異なる組成を持つ場合がありますが、この場合、ニッケルキレート脂質を含まないものと10%ニッケルキレート脂質を含むものの2つの二重層のみを形成します。

これらのドロップが所定の位置に配置されたら、カバーを慎重に表面に置き、一気に表面に滑り落ち、できるだけ早くベースにクランプします。リポソーム滴はカバースリップに接触するはずです。.この接触は、二重層がすでに形成されている可能性があり、中断すると二重層に欠陥が生じる可能性があるため、切断しないでください。

この時点で、顕微鏡でのカバースリップの位置を容易にするために、スライド上にいくつかの小さなインクスポットで二重層の位置をマークすることを覚えておくことが重要です。システムが平衡化したことを確認するために20分待って、約20センチメートルのフレキシブルチューブと3ウェイストップコックに接続された20ミリリットルのシリンジを使用してすべての溶液を転送します。次に、ストップコックの別のポートを短いチューブでフローセルに接続し、ストップコックとフローセルの間のデッドボリュームを最小限に抑えます。

シリンジに塩化マグネシウム、塩化カルシウムグルコース、ヒト血清アルブミンを含むハイス緩衝生理食塩水を入れます。チューブとストップコックをプライミングして、気泡が入らないようにします。次に、これをフローセルに接続し、気泡が二重層を通過しないことを確認しながら、1回の動作で5ミリリットルを押し込みます。

これで、ヒスタグ付きタンパク質をバイレイヤーに導入するためのバイレイヤーができました。最初にカセンでブロックし、ニッケルで充填する必要があります。1ミリリットルのシリンジにカセンニッケルイオン溶液を充填し、気泡を閉じ込めずにサイドポートに接続します。

溶液を注入した後、20分間待って完全にブロッキングします。次に、20ミリリットルのシリンジからH-B-S-H-S-Aでブロッキング溶液を洗い流します。次に、ポリヒスのタグ付きICAMワンとIEKを含む0.5ミリリットルのH-B-S-H-S-A溶液を注入します。

この実験では、ICAMの1つにSCI 5のラベルが付けられています。したがって、LFA one ICAM 1の相互作用は、ICAM Oneの二層での再構成をイメージングすることで追跡でき、タンパク質が二重層に付着している間、タンパク質がニッケル荷電二重層に結合するまで30分間かかります。カスタムステージインサートを使用して、フローセルを倒立顕微鏡に固定します。

次に、加熱電子機器を接続して、システムが摂氏37度で平衡化できるようにします。前に付けたマークを使用して、対物レンズが二重膜の1つと位置合わせされるようにフローセルを配置し、干渉反射顕微鏡を使用して、フィールドダイアフラムの反射光画像に焦点を合わせて焦点面を特定します。最後に、結合していないICAMをフローセルから洗い流します。

ICAMの二重層、芝Mおよび広視野モードの1チャネルの蛍光画像を取得します。これは、ニッケルフリー二重膜に対してニッケル被覆二重層上のICAM One結合を確認するためです。これで、フローセルがセルを受け取る準備が整いました。

このデモンストレーションでは、レトロウイルスENCコーティングGFPs P zap 70で形質導入されたND T細胞受容体トランスジェニックT細胞を使用し、細胞をH-B-S-H-S-Aで一度洗浄した後、Alexa 5 68で標識されたFABで細胞をT細胞受容体にインキュベートし、TCRマイクロクラスターを追跡できるようにします。15分後、細胞を1〜10に希釈します。これにより、H 57抗体が十分に希釈され、ターフMイメージングに干渉することはありませんが、最初に結合したファブが解離し始め、フローセルに注入されるときにT細胞受容体の飽和が維持されます。

免疫シナプスを3色のターフMモードで画像化します。これには、LFA 1、ICAM 1 相互作用の形成、TCR クラスターと C smac の形成、GFP ZAP 70 をリクルートする TCR マイクロクラスターの持続的な形成が含まれます。これらの結果の中には、取得中に明らかなものもあれば、完全に評価するために後処理分析が必要なものもあります。

さて、私たちはちょうど免疫学的シナプスを研究するためにサポートされている平面二重膜を使用する方法を示しました。これらの実験が機能するためには、T細胞が非常に良好な状態にあり、PPS緩衝生理食塩水が長期のT細胞培養にはあまり適していないことが非常に重要です。ですから、細胞を培養から取り出し、この培地に入れて、非常に迅速に使用したいのです。

より長期的な実験を行いたい場合は、緩衝生理食塩水の代わりに使用できる非常に優れた無血清培地製剤がいくつかあります。これにより、サイトカイン産生やT細胞の増殖など、より長い最終エンドポイントを実行したい場合、細胞をより長く生存させることができます。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。