免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

こんにちは、Geral Instituteおよびニューヨーク大学医学部のMike Dustinです。本日は、免疫シナプスの研究に用いる支持平面バイレイ（supportive planar Biolay）の作製手順について解説します。それでは始めましょう。

脂質二重層を作製するために、ガラスチューブ内で、20%のニッケルキレート脂質と80%のホスファチジルコリンを適切な量で、1〜2 mLのクロロホルム・メタノールに溶解させ溶液を調製します。最初のステップとして、30〜37 °Cの温水バス中で、窒素ガス気流下で溶媒を蒸発させます。この操作には通常、約15分かかります。

次に、ライオフィライザーを用いて高真空下で90分間、残存する溶媒をすべて除去します。続いて、脂質を2%N octal glucocide界面活性剤を含む生理食塩水バッファーに溶解し、最終濃度を0.4 millimolarにします。これにより、リポソームを形成するための界面活性剤とホスホリピドの混合ミセル溶液が作成されます。

この溶液をTris塩溶液で3回交換しながら透析し、界面活性剤を除去してリポソームを形成させます。通常、1 mL程度の容量を用い、カットオフ値が約10 kDaの直径6 mmのチューブを使用し、チューブをクランプする際に気泡が入らないよう注意します。この溶液を滅菌フィルターでろ過し、クリーンな条件下で透析を行い、70%エタノールで滅菌した手袋を用いて取り扱います。

この溶液は結晶のように透明である必要があり、酸化を防ぐためにアルゴンガス下で保存します。溶液が濁っている場合は、多重層小胞が生成されているため、最初からやり直す必要があります。実験を準備するために、まず、可溶性タンパク質の特定の濃度において、ニッケルキレート脂質二重層の一定の表面積にどれだけのICAM-1およびMHCが沈着するかを決定する必要があります。

この操作を行うため、直径5 µmのガラスビーズ上に二層膜を堆積させます。イメージングに使用するフローセルに近い条件下で、ガラスビーズをタンパク質溶液とともにインキュベートし、その後、フロー免疫蛍光測定法によって結合タンパク質の密度を読み取ります。分子あたりのフルオレセイン数が既知のFITC標識抗体を用いて表面結合タンパク質を検出し、フルオレセイン標準ビーズを用いてフローマイクロフルオリメーターの校正を行います。

ICAM-1を1平方マイクロメートルあたり200分子、I-E-K-M-C-C 91 1 0 3複合体を1平方マイクロメートルあたり0.2～20分子とし、抗原提示細胞に近い条件を構築します。リポソームがガラスに融合すると平面脂質二重層が自発的に形成されますが、これはガラスが適切に洗浄されている場合にのみ起こります。我々は、有機物をすべて除去し、ガラス表面を非常に親水性にすることのできる、硫酸と30%過酸化水素の調製直後の混合液であるピラナ溶液を使用します。

ピラニア溶液を使用する際は、耐酸エプロンや厚手の耐酸手袋を含む完全な保護衣を着用します。廃液は有機廃液と慎重に分別し、適切に処理する必要があります。ピラニア溶液を調製するには、乾燥したビーカーに濃硫酸 75 milliliters を加え、そこに 30%過酸化水素 25 milliliters を慎重に加えます。

溶液が急速に加熱され100 °C以上に達した後、乾燥させたカバーガラスを溶液に15分間浸します。ピラニア溶液でのインキュベーション後、カバーガラスを精製水に浸し、その後各面を1分間ずつすすぎます。次に、真空源を用いて精製水を排出し、カバーガラスを乾燥させます。

ピラニア溶液を冷却させ、ドラフト内に設置し、キャップを緩めて明確に標記したピラニア廃棄容器に回収します。二層膜を形成させるため、当研究室では加熱機能が統合されている利点を持つbi FCS twoチャンバーを使用しています。FCS twoシステムはステンレス製のベース上に設置されており、マイクロ流体マニホールドと0.5 millimeterのトップガスケット、および一方の面に加熱用の酸化インジウムスズ（ITO）がコーティングされ、もう一方の面に流路溝があるマイクロアクアダクトスライドをクランプで固定する構造となっています。

フローチャンバーの高さを規定するダストフリーの0.25 millimeterガスケットと、ピラニア溶液で洗浄した、バイレイヤーを形成させるための40 millimeter円形カバーガラスを用いて、フローセルを組み立て平面バイレイヤーを形成します。チューブが上を向くようにマニホールドを平らな面に置きます。次に、流体チューブの上に穴が位置するように0.5 millimeterガスケットを配置し、平らに密着していることを確認します。

マイクロアクアダクトスライドの流体チャネルを上にして静かに置き、スライドの穴がマイクロ流体チューブと一致していることを確認するまで、下方向への圧力をかけずに平らに設置されていることを確認します。次に、長方形の切り抜きがある、ダストフリーの0.25 millimeterガスケットをマイクロアクアダクトスライドの上に載せ、チャネルが流体チャネルと整列し、大きな気泡が生じていない状態にします。マイクロアクアダクトスライドの表面に、液滴同士の中心間距離が2.5 millimetersとなるパターンで、リポソーム懸濁液を1 µLずつ最大5滴滴下します。これら5つのリポソーム液滴は異なる組成であっても構いませんが、今回は、ニッケルキレート脂質を含まないものと、10%のニッケルキレート脂質を含むものの2種類の二分子層のみを形成します。

これらの液滴を配置したら、カバーガラスを一度の動作で慎重に表面に置き、できるだけ速くベースに固定します。リポソームの液滴がカバーガラスに接触している必要があります。この接触を断たないでください。二層膜はおそらくすでに形成されており、いかなる乱れも欠陥のある二層膜につながる可能性があるためです。

この時点で、顕微鏡上でのカバーガラスの配置を容易にするため、スライド上のバイレイヤーの位置にインクで小さな点をいくつか付けておくことが重要です。システムが平衡状態に達するまで20分間待ちます。その後、約20 cmの柔軟なチューブと三方活栓に接続した20 mLシリンジを用いて、すべての溶液を移送します。活栓のもう一方のポートは、活栓とフローセルの間の死容量を最小限に抑えるため、短いチューブでフローセルに接続します。

塩化マグネシウム、塩化カルシウム、グルコース、およびヒト血清アルブミンを含むHEPES緩衝生理食塩水でシリンジを満たします。チューブとストップコックをプライミングし、気泡がない状態にします。次に、これをフローセルに接続し、脂質二層膜上に気泡が通過しないことを確認しながら、一度の動作で5 mLを押し流します。

次に、Hisタグ付きタンパク質を脂質二重層に導入するための二重層を準備します。まず、カゼインでブロッキングを行い、ニッケルをチャージさせる必要があります。1 mLのシリンジにカゼイン・ニッケルイオン溶液を満たし、気泡が入らないようにサイドポートに接続してください。

溶液を注入した後、完全にブロッキングさせるため20分間待ちます。次に、20 mLシリンジを用いてH-B-S-H-S-Aでブロッキング溶液を洗い流します。その後、polyhisタグ付きICAM-1およびIEKを含むH-B-S-H-S-A溶液 0.5 mLを注入します。

本実験では、ICAM-1をSCI-5で標識します。これにより、バイレイヤー（脂質二重層）におけるICAM-1の再編成をイメージングすることで、LFA-1とICAM-1の相互作用を追跡することが可能になります。タンパク質がニッケル電荷バイレイヤーに結合するまで30分間放置し、タンパク質をバイレイヤーに吸着させます。カスタムステージインサートを用いて、フローセルを倒立顕微鏡に固定してください。

次に、加熱電子回路を接続し、システムを37 °Cで平衡化させます。先に付けたマークを用いて、対物レンズが二重層のいずれかと一致するようにフローセルを配置し、視野絞りの反射光像に焦点を合わせることで、干渉反射顕微鏡を用いて焦点面を特定します。最後に、フローセルから未結合のICAM-1を洗浄して除去します。

turf Mモードおよびワイドフィールドモードを用いて、ICAM-1チャネルでバイレイヤーの蛍光画像を取得します。これにより、ニッケルフリーのバイレイヤーと比較して、ニッケルコーティングされたバイレイヤーにICAM-1が結合していることを確認します。これで、フローセルに細胞を導入する準備が整いました。

今回のデモンストレーションでは、retrovirus ENCによってGFPとZap 70が導入されたND T細胞受容体トランスジェニックT細胞を使用します。細胞をHBSSで1回洗浄し、TCRマイクロクラスターを追跡できるよう、Alexa 568で標識したT細胞受容体に対するFab断片とともに細胞をインキュベートします。15分後、細胞を10倍に希釈します。これにより、TIRF顕微鏡イメージングを妨げない程度までAlexa 568抗体を希釈しますが、最初に結合したFabが解離し始めるため、T細胞受容体の飽和状態を維持します。その後、細胞をフローセルに注入します。

3色ターフMモードを用いて免疫シナプスをイメージングします。これには、LFA-1とICAM-1の相互作用の形成、TCRクラスターおよびc-SMACの形成、そしてGFP-ZAP-70をリクルートするTCRマイクロクラスターの持続的な形成が含まれます。これらの結果の一部は取得中に明らかになりますが、他の結果を十分に評価するには、後処理による解析が必要となります。

以上で、支持平面脂質二重層を用いて免疫シナプスを研究する方法について説明しました。これらの実験を成功させるには、T細胞が非常に良好な状態であることが極めて重要です。PBS緩衝生理食塩水は、T細胞の長期培養には適していません。そのため、細胞を培養液から取り出してこの媒体に移し、速やかに使用するようにしてください。

より長期的な実験を行いたい場合は、リン酸緩衝生理食塩水の代わりに使用できる優れた無血清培地の処方がいくつかあります。サイトカイン産生やT細胞の増殖など、より長期的なエンドポイントを測定したい場合には、これらの培地を使用することで細胞をより長く生存させることができます。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。