Name: 免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学ぶ 支持平面二重層を用いた免疫シナプス形成の可視化手法。TIRF顕微鏡で細胞接着タンパク質の動態を観察し、免疫応答におけるシナプス相互作用の理解を深める研究法を解説します。

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1。脂質の準備<ol><li>二重層の上部のリーフレットにタンパク質をリンクするために、我々は、Ni 2を使用してください+キレート脂質、ポリヒスチジンタグを持つアンカー組換えタンパク質を。特定の細胞型は、Ni 2 +でコーティングされた二重層へ非特異的に付着する可能性がありますが、T細胞は、一般的にT細胞活性化を研究するためのこの方法が最適なこと、しないでください。 </li><li>脂質二重層液をクロロホルム-メタノールの1〜2 mlのガラス管に適当な量のNi 2 +キレート脂質と80％のホスファチジルコリン20％の溶液を調製することによって行われます。 <ol><li>暖かい（30〜37℃）の水浴中で窒素ガス気流下で溶媒を蒸発させる。これは通常、約15分かかります。 </li><li> 90分間凍結乾燥機を使用して、高真空下で、残りの溶剤を削除します。 </li></ol></li><li>混合界面活性剤/リン脂質ミセルのソリューションを作成するトリス - 生理食塩水緩衝液、2％N -オクチル-グルコシドの洗剤で脂質を溶解する。最終的なリン脂質濃度は、0.4mMのはずです。リポソームを形成するために、洗剤とフォームリポソームを削除するには、トリス - 生理食塩水を3変更を避けるために、このソリューションを透析。我々は通常、10 kDaの周りのカットオフを持つスペクトラ/ POR第2配管直径6mm 1 mlの順に容量ボリュームで機能します。我々は、チューブをクランプするとき、任意の気泡のを除外するように注意です。我々は典型的には、滅菌フィルターこのソリューションおよび70％エタノール、滅菌手袋を使用してそれを処理し、クリーンな条件下での透析を行う。 </li><li>このソリューションでは、水晶明確にする必要があります。それは酸化を防ぐために、アルゴンガス下に格納されています。解決策が濁っている場合は、多層小胞が生成されている、と再度起動する必要があります。 </li></ol> 2。 ICAM - 1とMHCは平面二重膜上に堆積されているどのくらいの決定<ol><li>実験をセットアップするためには、可溶性タンパク質の特定の濃度でのNi 2 +キレート二重層の特定の表面積上に堆積されているどのくらいのICAM - 1とMHCを決定するためにまず必要です。 5マイクロメートル径のガラスビーズでの預金二重層、これを行うには、イメージングに使用されるフ​​ローの細胞のもの、およびフロー免疫蛍光アッセイによる結合タンパク質の密度を読み出すおおよそその条件下でのタンパク質溶液とガラスビーズをインキュベートする。 </li><li>フルオレセイン分子当たりの知られている番号とFITC標識抗体を表面に結合したタンパク質を検出するために使用されます。フルオレセイン標準ビーズをフローmicrofluorimeterをキャリブレーションに使用されます。 </li><li>我々は、I - EK - MCC91 - 103複合体のICAM - 1の200molecules/μm2と0.2から20molecules/μm2と抗原提示細胞上のものに近似する条件を確立します。 </li></ol> 3。平面脂質二重層を形成するためのガラスのカバースリップのクリーニング<ol><li>平面脂質二重層は、リポソームがガラスに融合するときに自発的に形成するが、ガラスが適切に洗浄されている場合のみ。 </li><li>ピラニアで作業する場合、我々は酸のエプロンと重い、耐酸性の籠手を含む、完全な防護服を着用してください。慎重に、有機廃棄物から廃棄物を分離し、適切に処分する。 </li><li>酸のピラニア溶液を調製するために、乾燥したビーカーに濃硫酸75mlのを追加し、慎重に30％過酸化水素25mlを加える。ソリューションは、急速に超えて100℃に加熱</li><li> 15分間溶液中で乾燥したカバーグラスを浸し。ソリューションから削除し、それぞれの側分間精製水ですすいでください。精製水を切るために真空源を用いてカバースリップを乾かします。ピラニア溶液を冷却し、よくドラフト内でマークキャップ緩み、が残っているピラニアの廃棄物コンテナに追加することができます。リポソーム、カバーガラス、及びタンパク質のすべてが準備されている場合、免疫シナプスが形成される準備ができています。 </li></ol> 4。二重層を形成する<ol><li>脂質二重層を形成するために、私たちの研究室では、統合された加熱の利点を持っているBioptechs FCSIIチャンバーを、使用しています。 FCSIIシステムは、ステンレス製のベースになりますが一緒にクランプの反対側の流体溝と0.5ミリメートルトップガスケット、一方の表面に加熱するためのインジウムスズ酸化物で被覆microaqueductスライド、マイクロ流体マニホールド、ダストフリー0.25ミリメートルフローチャンバーとピラニアの高さを定義するガスケットは、二重層が形成されている40mmの円形のカバースリップを掃除した。 </li><li>二重層が形成される際に、カバースリップは、親水性の高い、クリーンにする必要がある一方でそれはより疎水性なら、microacqueductスライドは、実際にうまく機能します。 microaqueductを作ることはより多くの疎水性は、純水で洗浄し、この調整のプロセスの後、同様の用途の間で完全に乾燥、室温で60分間、1％HSAで処理することにより達成されます。この手順によって残された変性タンパク質のコーティングは、リポソーム懸濁液を1μl、ラウンド、hemisphericaを形成することができます&gt; 0.25 mmの高であるlのドロップ。 </li><li>フローセルとフォーム平面二重膜を組み立てるには、平らな表面上に、上向きに指示チューブで、マニホールドを配置。その後、0を置きます。それが平らに装着さ​​れていることを確認して、流体管の上に置く穴と5 mmのガスケット。ゆっくりと上向きに流体チャンネルとガスケットにmicroaqueduct側に配置し、スライドの穴がマイクロ流体管に合わせていることを検証するまでは、どんな下向きの圧力を適用せずにフラットシートを確認してください。チャネルが流体チャネルと揃うとは大きな空気のスペースがないことになるようにmicroaqueductスライドの上から長方形のカットでダストフリー0.25mmのガスケットを置きます。 </li><li>各ドロップの中心間距離が2.5mmになるようなパターンでmicroaqueductスライドの表面に5にリポソーム懸濁液のX1μlの水滴を置きます。 5リポソーム滴は異なる組成を持つことができますが、この場合、我々は2つだけ二層、ニッケル2 + +キレート脂質および10％のNi 2 + +のキレート脂質とつのNOを持つものを形成します。 </li><li>これらのドロップが正しく設定されると、慎重にカバーが一つの動きの面を下にスリップ置きます。できるだけ早くベースの上にクランプ。リポソーム滴はカバースリップとの接触を確認する必要があります。脂質二重層は、おそらくすでに形成されているので、この接点は、異常はありません。すべての中断は、欠陥のある二層になることがあります。 </li><li>顕微鏡のカバーの位置決めを支援するためにmicroacqueductスライド上のいくつかの小さなインクスポットのある二層の位置をマークするために覚えておくことが重要です。システムが平衡しているか確かめる為に、20分待ってください。約20フレキシブルチューブのcmおよび3方活栓に接続した20mlの注射器を使用して、すべてのソリューションを転送します。コックとフローセルの間にデッドボリュームを最小限に抑えるためにチューブの短い長さでフローセルに活栓の別のポートを接続します。 2mMのMgCl 2、1mMのCaCl 2、5mMグルコースと1％ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水HEPES緩衝でシリンジを埋める。 </li><li>に気泡がないので素数ではチューブとコック。フローセルにこれを接続していない空気の泡が二重層を通過しないことを確認するために、見ながら一つの動きで5ミリリットルを介してプッシュ。今、あなたの二重膜を持つことになります。 </li></ol>条件：このビデオの記事は&quot;アメーバロコモーションの主題による変奏曲など、免疫学的シナプスとKinapsesギャザラと戻るハンター&quot;サポートされています<a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">マイケルL.ダスティン</a> 、 <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">細胞および発生生物学の年次レビュー</a> 、ボリューム24、2008。

免疫シナプスとkinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

サポートされている平面脂質二重層は、免疫学的シナプスの分子間相互作用をモデル化するために使用できる強力なツールです。リンパ球と抗原提示細胞間の相互作用を模倣するために、我々は、ポリ - ヒスチジンタグを持つ二層の上部のリーフレットに組換え細胞接着およびMHCタンパク質を固定するNI2 +キレート脂質を使用してください。平面脂質二重層は、脂質の準備二重層が形成されるガラスの表面を処理し、リンパ球が追加されるフローセルを含む特殊なチャンバー内の二重層を形成することによって生成されます。その後、二層をNiで起訴され、Hisタグ融合組み換えタンパク質が追加されます。最後に、リンパ球は、フローセルに注入され、全反射顕微鏡は、画像のシナプス形成とメカニズム、その制御性T細胞の移動運動、受容体のソートのサイト、および受容体の劣化の部位に使用することができます。

サポートされている平面脂質二重層は、免疫学的シナプスの分子間相互作用をモデル化するために使用できる強力なツールです。ここで、我々は、脂質のbilyerの上部のリーフレットにシナプス形成を調節し、全反射顕微鏡を用いてシナプス形成を可視化するために知られている細胞接着タンパク質を固定するための方法を示しています。

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

支持平面脂質二重層は、免疫シナプスにおける分子相互作用をモデル化するために利用できる強力なツールである。相互作用を模倣するために……

こんにちは、Geral Instituteおよびニューヨーク大学医学部のMike Dustinです。本日は、免疫シナプスの研究に用いる支持平面バイレイ（supportive planar Biolay）の作製手順について解説します。それでは始めましょう。脂質二重層を作製するために、ガラスチューブ内で、20%のニッケルキレート脂質と80%のホスファチジルコリンを適切な量で、1〜2 mLのクロロホルム・メタノールに溶解させ溶液を調製します。最初のステップとして、30〜37 °Cの温水バス中で、窒素ガス気流下で溶媒を蒸発させます。この操作には通常、約15分かかります。次に、ライオフィライザーを用いて高真空下で90分間、残存する溶媒をすべて除去します。続いて、脂質を2%N octal glucocide界面活性剤を含む生理食塩水バッファーに溶解し、最終濃度を0.4 millimolarにします。これにより、リポソームを形成するための界面活性剤とホスホリピドの混合ミセル溶液が作成されます。この溶液をTris塩溶液で3回交換しながら透析し、界面活性剤を除去してリポソームを形成させます。通常、1 mL程度の容量を用い、カットオフ値が約10 kDaの直径6 mmのチューブを使用し、チューブをクランプする際に気泡が入らないよう注意します。この溶液を滅菌フィルターでろ過し、クリーンな条件下で透析を行い、70%エタノールで滅菌した手袋を用いて取り扱います。この溶液は結晶のように透明である必要があり、酸化を防ぐためにアルゴンガス下で保存します。溶液が濁っている場合は、多重層小胞が生成されているため、最初からやり直す必要があります。実験を準備するために、まず、可溶性タンパク質の特定の濃度において、ニッケルキレート脂質二重層の一定の表面積にどれだけのICAM-1およびMHCが沈着するかを決定する必要があります。この操作を行うため、直径5 µmのガラスビーズ上に二層膜を堆積させます。イメージングに使用するフローセルに近い条件下で、ガラスビーズをタンパク質溶液とともにインキュベートし、その後、フロー免疫蛍光測定法によって結合タンパク質の密度を読み取ります。分子あたりのフルオレセイン数が既知のFITC標識抗体を用いて表面結合タンパク質を検出し、フルオレセイン標準ビーズを用いてフローマイクロフルオリメーターの校正を行います。ICAM-1を1平方マイクロメートルあたり200分子、I-E-K-M-C-C 91 1 0 3複合体を1平方マイクロメートルあたり0.2～20分子とし、抗原提示細胞に近い条件を構築します。リポソームがガラスに融合すると平面脂質二重層が自発的に形成されますが、これはガラスが適切に洗浄されている場合にのみ起こります。我々は、有機物をすべて除去し、ガラス表面を非常に親水性にするこ

supported-planar-bilayers-for-formation-study-immunological-synapses

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JoVE Journal

Biology

生物学

この資料では、全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡による平面脂質二重層をサポートしてガラス基板上にHIV-1エンベロープによって誘導されるウイルス学的シナプスの形成を可視化する方法について説明します。方法はまた、HIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプス形成時に発生するシグナル伝達分子の活性化および再配布を検出する免疫​​蛍光染色と組み合わせることができます。...

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

このビデオは、支持脂質二重膜(SLB)上のナチュラルキラー(NK)細胞における免疫学的シナプスの形成を視覚化する技術を示しています。SLBは、最初に蛍光色素でタグ付けされたNK細胞活性化受容体リガンドで標識され、続いてNK細胞とインキュベートされます。続いて、重合アクチンおよびパーフォリン陽性溶解顆粒について細胞を染色します。このアプローチにより、STED(Stimulated Emission...

担持脂質二重膜上におけるNK細胞免疫学的シナプス形成の超解像イメージング

このビデオは、初代ヒトT細胞と担持脂質二重膜(SLB)との間の免疫シナプス形成を研究するin...

T細胞と支持された平面脂質二重膜との相互作用を研究するためのIn Vitro技術

このビデオは、免疫学的シナプストポロジーの生細胞イメージングを実演し、Tリンパ球と蛍光抗原を運ぶ上皮細胞との間の相互作用を調査しています。蛍光顕微鏡法では、内皮細胞に赤い細胞質の変位と黄色の膜輪が見られ、免疫学的シナプスの形成が示唆されています。...

生細胞イメージングによる免疫学的Synapseトポロジーの評価

ここでは、免疫学的シナプスを形成するガラス支持脂質二重膜技術と、誘導放出枯渇(STED)顕微鏡の超解像イメージング技術の組み合わせについて説明します。このプロトコルの目標は、これら 2...

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

タンパク質官能基化平面ガラス支持脂質二重膜の調製、タンパク質内のタンパク質移動度の決定、およびタンパク質密度の測定がここに示されている。ノイズを低減した全反射顕微鏡を構築するためのロードマップが概説されており、これにより、高い時空間分解能で単一の二重層常在蛍光色素を視覚化できます。...

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

適応免疫は、T細胞と抗原提示細胞との間に形成される動的な「免疫学的シナプス」によって制御されます。このプロトコルは、研究が進んでいない生理学的APCとして、また新しいタイプの「平面細胞APCモデル」として、内皮細胞を調査するための方法を説明しています。...

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

本明細行では、ISの形成中にBリンパ球における細胞偏光事象を特徴付ける2つのアプローチについて説明する。第1に、シナプス膜におけるオルガネラ募集および細胞骨格再配列の定量化を含む。第2は、免疫シナプスに偏光を受けるセントロソームの組成の変化を特徴付ける生化学的アプローチである。...

免疫シナプス形成中のB細胞におけるオルガネラダイナミクスの研究

このプロトコルは、免疫学的シナプス形成とその後の分極分泌トラフィックの両方を免疫学的シナプスに向かって画像化する。細胞コンジュゲートは、超抗原パルスラジ細胞(抗原提示細胞として作用する)とユルカトクローン(エフェクターヘルパーTリンパ球として作用する)との間に形成された。...

ヒト免疫シナプスのイメージング

ここでは、ビーズ支持脂質二重層を用いた合成抗原提示細胞の段階的再構成のためのプロトコルと、活性化T細胞からのシナプス出力を調べるためのそれらの使用を提示する。...

T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製

グラミキシジンAドープされた液滴界面二重層を組み立て、電気刺激し、解析する実験プロトコルを提示します。脂質-タンパク質の構造-機能関係は、膜面積、イオンフラックス、単一チャネル伝導の変化を測定し、これらの応答を電気シナプスに着想を得た膜モデルにおける可塑性様のイオン伝導変化と関連付けることで定量化されます。...

液滴界面二重層を用いた脂質-タンパク質膜構造-機能の特徴解析

学ぶ 支持平面二重層を用いた免疫シナプス形成の可視化手法。TIRF顕微鏡で細胞接着タンパク質の動態を観察し、免疫応答におけるシナプス相互作用の理解を深める研究法を解説します。

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

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