機械感覚受容体に対する抗体で処理した血小板に対するせん断応力の影響

多血小板血漿を含むマルチウェルプレートから始めます。血小板は、機械的刺激に反応する表面機械受容体複合体を発現します。

機械受容器複合体は、細胞外リガンド結合ドメインと機械感覚ドメインに結合したマクロ糖ペプチド領域を含んでいます。

抗機械受容体抗体を導入し、対向する血小板上の受容体のリガンド結合ドメインと架橋します。

抗体処理された血漿懸濁液の液滴を粘度計のアセンブリの間に配置します。

せん断応力を加え、機械的力をシミュレートし、抗体結合受容体を血小板から引き離し、マクロ糖ペプチド領域を機械感覚ドメインから解離させます。

これにより、機械感覚領域のコンフォメーション変化が引き起こされ、血小板が活性化され、表面マーカーの発現が起こります。

ん断した血小板懸濁液をマルチウェルプレート内の新しいウェルに移します。

対応する血小板表面マーカーと相互作用する蛍光色素標識マーカー特異的分子のカクテルを導入し、固定液で細胞を固定します。

フローサイトメトリーでは、明確な蛍光シグナルは、抗体処理された血小板に対するせん断応力の影響と相関しています。

リガンド処理の場合は、目的の抗体またはリガンドを多血小板血漿にゆっくりと添加し、血小板を穏やかに混合します。インキュベーション中、コーンプレート粘度計の電源を入れ、プレート温度を摂氏22度に設定します。5〜10分後、処理された多血小板血漿をプレートの中央にある温度制御されたコーンプレート粘度計に直接移し、すべてのサンプルが接触点のコーンとプレートの間に沈着するように注意します。

サンプルにせん断を加えるには、粘度計のマニュアルに従ってせん断を計算し、適切な速度と持続時間でサンプルにせん断を加えます。塗布の最後に、サンプルがプレートとコーンの両方に接触したままになるように、コーンをプレートから約2ミリメートル持ち上げ、ゲルローディングピペットチップを使用して、サンプル容量の中心から5〜10マイクロリットルを収集します。次に、せん断したサンプルを目的の表面マーカーに対する抗体とともに室温で20分間インキュベートし、サンプルを室温で20分間2%パラホルムアルデヒドに固定します。

フローサイトメトリーでサンプルを分析するには、各条件で少なくとも20,000のイベントを収集し、各蛍光色素の強度の高さ値を使用して各蛍光マーカーのシグナル強度を定量します。次に、ウシ血清アルブミンまたはビヒクルを含むネガティブコントロールを使用して、陰性のバックグラウンド蛍光イベントを除外したゲートを描画し、すべての実験条件でゲート内のイベントの割合を定量化します。