がん細胞における複製ストレスを定量するための免疫蛍光法

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ミジンヌクレオチドの合成代替物であるIdUを保有し、すでにDNAに組み込まれているがん細胞から始めます。これらの細胞が複製ストレスに遭遇すると、DNA合成が停止し、露出した一本鎖DNA領域内のIdUが明らかになります。

細胞を固定し、界面活性剤分子を加えて細胞膜を透過性にします。

BSAを添加して、非標的抗体結合部位をブロックします。

IdU標識一本鎖DNAと相互作用する抗IdU抗体を導入します。

抗IdU抗体を標的とする緑色の蛍光色素標識二次抗体を追加します。結合していない抗体を除去します。

核を染色する蛍光色素を含む封入剤を含むスライドにカバーガラスを置きます。

蛍光顕微鏡で青い核を観察します。

緑色の蛍光病巣は、一本鎖DNAに結合する抗体を表します。

病巣の数をカウントして、複製ストレスのレベルを定量化します。

24ウェルプレートのウェルに配置されたポリ-L-リジンカバーガラスに1ミリリットルの細胞懸濁液を加え、標準条件下で培地中で細胞を増殖させます。1回の集団倍増後、プレートから既存の培地を吸引し、その後の2つの集団倍増のために10マイクロモルのIdUで細胞をパルスします。

細胞を採取するには、培地を氷上で氷冷した0.5%PBSTxで5分間交換します。細胞の固定には、PBSTxを吸引し、細胞を室温で3%パラホルムアルデヒドと15分間インキュベートします。PBSで3〜4回洗浄した後、さらに使用するまで固定細胞を摂氏4度に保ちます。

固定後、氷上で0.5%PBSTxを使用して細胞を5分間透過処理し、カバーガラス全体を覆うようにします。室温で1ミリリットルの0.2%PBSTで細胞を3〜4回洗浄した後、PBSTを吸引し、PBSで作った5%BSAを室温で30分間用いてサンプルをブロックします。

免疫染色の場合は、平底のタッパーウェアに濡れたペーパータオルを置き、加湿チャンバーを準備します。24ウェルプレートの蓋をパラフィルムで覆います。加湿チャンバーに入れ、プレートの蓋にカバーガラスを置きます。カバーガラスの上部に、60マイクロリットルの希釈抗BrdUマウス一次抗体を追加します。

あるいは、抗体の乾燥を減らし、使用する量を減らすには、希釈した抗体をパラフィルムに一滴置き、カバーガラスをその上に裏返します。その後、摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、一次抗体を吸引します。

カバーガラスを24ウェルプレートに戻し、0.2%PBSTで4回洗浄します。前述のように、希釈した二次抗体をカバーガラスに加え、室温で暗所で1時間インキュベートします。顕微鏡スライドにラベルを付け、DAPI封入剤でスライドにカバーガラスを取り付けます。封入剤を硬化または硬化させる必要がある場合は、スライドを室温で暗所で 24 時間保管してください。