In Vitroでのニューロンとマクロファージの共培養の開発

成長培地中の単離されたマウス後根神経節ニューロンから始めます。

それらをポリマーでコーティングされたマルチウェルプレートに播種して、ニューロンの付着を促進します。

次に、解剖した安楽死マウスを取り、氷のように冷たいPBSを腹腔に注入します。

腹膜を優しくマッサージして、腹膜壁からマクロファージを取り除きます。

マウスを絞って腹液を採取し、溶解バッファーで処理して、汚染物質として現れる赤血球を選択的に溶解します。細胞を遠心分離し、培地に再懸濁します。

マクロファージを、培養ニューロンを含むウェル内に配置された多孔質インサートに移します。

この共培養により、ニューロンとマクロファージを近接させることができます。

共培養物をdb-cAMPで処理し、細胞への侵入を促進するためにインキュベートします。これにより、ニューロンが活性化され、シグナル伝達分子が分泌されます。

これらのシグナル伝達分子は、db-cAMP とともに、マクロファージに再生促進表現型を採用し、ニューロンの増殖に必須の因子を分泌するように誘導します。

培養物を設定する前に、6ウェルプレートをポリ-D-リジンとラミニンでプレコートします。次に、6ウェルプレートを0.01ポリ-D-リジンとともに摂氏37度で2時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。その後、プレートを蒸留水で2回洗います。

次に、プレートを1ミリリットルあたり3マイクログラムの濃度でラミニン溶液とともに室温で2時間インキュベートします。この後、プレートを蒸留水で2回洗浄し、プレートを室温で少なくとも1時間乾燥させます。

次に、安楽死させたマウスの脊柱を覆う皮膚を手術用ブレードで切開し、傍脊椎筋を両側に解剖して椎骨を露出させます。DRGが完全に露出するまで、先端の狭い外科用ロンデュールを使用して椎骨を細心の注意を払って除去します。

解剖顕微鏡下で、虹彩切除はさみと先端の細い鉗子を使用して、DRGをS1からC1レベルまで両側に除去します。切り口が付いた青色のピペットチップを使用して、DRGを1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブに移します。

次に、ミニ遠心分離機を使用して数秒間素早く回転させた後、DMEMを除去します。1ミリリットルあたり125単位の11型コラゲナーゼを含むDMEMを1ミリリットルに加え、摂氏37度でツイストまたはシェーカーを使用して穏やかに回転させながらチューブを90分間インキュベートします。

その後、コラゲナーゼを含むDMEMを廃棄し、1ミリリットルの新鮮なDMEMを加えます。切り口が付いた青いピペットチップを使用して、DRGを15ミリリットルの円錐形チューブに移します。次に、少なくとも15回穏やかに上下にピペットで移動させ、均一な細胞懸濁液を作ります。

チューブを239 gで3分間遠心分離し、浮遊破片のある上清