In Vitroでのニューロンとマクロファージの共培養の開発

成長培地中の単離されたマウス後根神経節ニューロンから始めます。

それらをポリマーでコーティングされたマルチウェルプレートに播種して、ニューロンの付着を促進します。

次に、解剖した安楽死マウスを取り、氷のように冷たいPBSを腹腔に注入します。

腹膜を優しくマッサージして、腹膜壁からマクロファージを取り除きます。

マウスを絞って腹液を採取し、溶解バッファーで処理して、汚染物質として現れる赤血球を選択的に溶解します。細胞を遠心分離し、培地に再懸濁します。

マクロファージを、培養ニューロンを含むウェル内に配置された多孔質インサートに移します。

この共培養により、ニューロンとマクロファージを近接させることができます。

共培養物をdb-cAMPで処理し、細胞への侵入を促進するためにインキュベートします。これにより、ニューロンが活性化され、シグナル伝達分子が分泌されます。

これらのシグナル伝達分子は、db-cAMP とともに、マクロファージに再生促進表現型を採用し、ニューロンの増殖に必須の因子を分泌するように誘導します。

培養物を設定する前に、6ウェルプレートをポリ-D-リジンとラミニンでプレコートします。次に、6ウェルプレートを0.01ポリ-D-リジンとともに摂氏37度で2時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。その後、プレートを蒸留水で2回洗います。

次に、プレートを1ミリリットルあたり3マイクログラムの濃度でラミニン溶液とともに室温で2時間インキュベートします。この後、プレートを蒸留水で2回洗浄し、プレートを室温で少なくとも1時間乾燥させます。

次に、安楽死させたマウスの脊柱を覆う皮膚を手術用ブレードで切開し、傍脊椎筋を両側に解剖して椎骨を露出させます。DRGが完全に露出するまで、先端の狭い外科用ロンデュールを使用して椎骨を細心の注意を払って除去します。

解剖顕微鏡下で、虹彩切除はさみと先端の細い鉗子を使用して、DRGをS1からC1レベルまで両側に除去します。切り口が付いた青色のピペットチップを使用して、DRGを1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブに移します。

次に、ミニ遠心分離機を使用して数秒間素早く回転させた後、DMEMを除去します。1ミリリットルあたり125単位の11型コラゲナーゼを含むDMEMを1ミリリットルに加え、摂氏37度でツイストまたはシェーカーを使用して穏やかに回転させながらチューブを90分間インキュベートします。

その後、コラゲナーゼを含むDMEMを廃棄し、1ミリリットルの新鮮なDMEMを加えます。切り口が付いた青いピペットチップを使用して、DRGを15ミリリットルの円錐形チューブに移します。次に、少なくとも15回穏やかに上下にピペットで移動させ、均一な細胞懸濁液を作ります。

チューブを239 gで3分間遠心分離し、浮遊破片のある上清を慎重に廃棄します。B27を添加した神経基底培地1ミリリットルを加え、5〜10回上下に穏やかにピペッティングして細胞ペレットを再懸濁します。

次に、細胞懸濁液を、50ミリリットルの円錐形チューブの上に重ねた70マイクロメートルの細胞ストレーナーに通します。次に、収集したすべてのDRGニューロンを6ウェルプレートの2つのウェルにプレートします。

成体マウスから初代腹膜マクロファージを調製するには、腹部皮膚を繊細に切開して腹膜を露出させ、洗浄液の漏れを防ぐために腹膜を切断しないようにします。

次に、22ゲージの針が付いた注射器を使用して腹膜に穴を開け、10ミリリットルの氷冷PBSを腹腔に注入します。腹膜を1〜2分間優しくマッサージします。次に、針を引き抜き、針穿刺部位からPBSを絞り出し、50ミリリットルの円錐形チューブに洗浄液を集めます。

その後、洗浄液を摂氏4度で10分間239gで遠心分離し、細胞成分をペレット化します。続いて、ペレットを3ミリリットルの赤血球溶解バッファーで室温で3分間再懸濁します。

次に、細胞懸濁液を239 gで摂氏4度で10分間再度遠心分離します。ペレット化された細胞を1ミリリットルの神経基底B27培地に再懸濁します。回収されたすべてのマクロファージの半分を、解離したDRGのウェルの上に置かれた有効面積4.2センチメートル四方の細胞培養インサートにプレートします。

ニューロンマクロファージを共培養してから4時間後、2マイクロリットルの100マイクロモルdb環状AMP溶液をニューロンマクロファージ共培養に加えます。24時間後、同じ6ウェルプレートに1ミリリットルのマクロファージ培地を空のウェルに充填します。

ニューロンマクロファージ共培養中の細胞培養インサートを、マクロファージ培養培地を含む空のウェルに移します。