出生後マウス小脳からの幹細胞の単離と神経細胞への分化

幹細胞、ニューロン、グリアを含む新生マウス小脳から単離された細胞を取ります。

幹細胞特異的表面糖タンパク質に結合する抗体でコーティングされた磁気マイクロビーズを追加します。

心分離し、結合していないビーズを取り除き、細胞をバッファーに再懸濁します。

気分離器に配置された分離カラムに細胞をロードし、他の細胞が流れる間、マイクロビーズ結合幹細胞を保持します。

ニューロスフィア培地を加えて細胞を溶出し、マイクロプレートに移します。幹細胞の自己複製コロニーである一次神経球の形成を誘導するためにインキュベートします。

遠心分離して培地を廃棄します。細胞接着タンパク質を消化するために酵素を含む培地に神経球を再懸濁します。

素を遠心分離して除去します。神経球培地を加え、細胞を機械的に解離させます。

細胞の増殖と二次神経圏の形成を可能にするためにインキュベートしますが、幹細胞の特性を欠いた分化した細胞は増殖しません。

神経球を分化培地に移してインキュベートし、ニューロンとグリアへの分化を促進します。

遠心分離管を氷の上に置き、解離した細胞を40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに濾します。フィルターの上に10ミリリットルの氷冷HBSS溶液を塗り、細胞がメッシュを通過するようにします。

ろ過した細胞を新鮮な15ミリリットルの遠心分離管に移し、懸濁液を摂氏4度で10分間300回gで遠心分離します。次に、真空吸引器を使用して上清を完全に除去します。

細胞ペレットを160マイクロリットルの氷冷の磁気カラムバッファーに再懸濁します。40マイクロリットルの抗プロミニン-1マイクロビーズを細胞懸濁液に加えます。次に、チューブを冷蔵庫で15分間インキュベートし、抗体がプロミニン-1発現細胞に結合できるようにします。

細胞を1〜2ミリリットルのカラムバッファーXで洗浄し、300倍gで10分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを1ミリリットルのカラムバッファーXに再懸濁します。磁気カラムを磁気スタンドに置き、500マイクロリットルのバッファーXで一度すすぎます。標識された細胞懸濁液をカラムに塗布し、フロースルーを新鮮な15ミリリットルチューブに収集します。

カラムを500マイクロリットルのバッファーXで3回洗浄します。次に、カラムを磁場から取り出し、1.5ミリリットルのチューブに入れます。1ミリリットルの培地を加え、プランジャーをカラムに押し込み、プロミニン-1ビーズでタグ付けされた細胞を洗い流します。

神経球を継代するには、培地と一緒にそれらを滅菌の15ミリリットル遠心分離管に移します。神経球を300回gで5分間遠心分離してペレット化し、上清を廃棄します。

レットをパパインまたは0.05%トリプシン溶液を含む5ミリリットルの解離培地に再懸濁し、細胞を摂氏37度で10分間インキュベートします。細胞懸濁液を再度遠心分離します。次に、細胞を5ミリリットルのニューロスフィア培地に再懸濁し、牧草ピペットでゆっくりと上下に10回ピペッティングして解離します。テキストプロトコルに記載されているように細胞を神経球培地にプレートし、前述のように培養中で7〜10日後に二次神経球で細胞を濃縮する。