Name: マイクロダイセクションによる開発小脳とは異なる細胞集団の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶマイクロダイセクションと蛍光活性化細胞分選を用いて、新生マウスの発育中小脳からネスチン発現前駆細胞を単離する方法。生細胞培養が可能で、小脳発生の研究に有用です。

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著者らは、フローサイトメトリーの支援をジェームズOesterlingに感謝したいと思います。この研究は、米国国立がん研究所（R01-CA178380、ZY）および米国国立衛生研究所博士研究訓練助成金（5T32CA009035-37、LWY）からの助成金によってサポートされていました。

このプロトコルにおける動物の使用は、フォックスチェイスがんセンター動物実験委員会によって承認された手順に従って行われている。 楽器、ソリューション、およびカバーガラスの作製<ol><li> ＃5細かい鉗子のクリーン二組、＃7の1組の罰金、湾曲鉗子、一つの大きな外科はさみ、1 microdissectingはさみ、1へら一あきスプーン。セルフシール滅菌袋とオートクレーブ中で楽器を置きます。使用するまで袋に楽器を保管してください。 </li><li> 3％の低融点アガロース溶液を調製する。 <ol><li>気泡が出現するまで、電子レンジ、暑さの中に置くの滅菌ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）50ml中に1.5グラムのアガロースを追加します。スワールフラスコと再加熱すべてアガロースを溶解するまで。塊が現れた場合、加熱前に攪拌棒を備えたソリューションを混ぜる。 </li><li> 37℃の水浴に保管ソリューションまで、必要に応じ。 </li><li>長期的なSTORAG​​用E、カ月間室温または4℃で、将来の使用のためにアガロース溶液を格納します。液化するために、電子レンジで再加熱する。アガロース溶液を繰り返し加熱するために、温かい滅菌蒸留水との初期重量を維持するために加熱する前に、フラスコの重量を量る。 </li></ol></li><li>以前に2に記載されているように、パパインベースの細胞解離のために以下の手段を準備します。 <ol><li>赤含有DPBSを滅菌フェノールでパパイン（100 U / ml）を、システイン（0.2 mg / mlで）およびDNase（250 U / ml）でパパイン溶液。 </li><li>ウシ血清アルブミンとオボムコイド溶液（BSA; 8 mg / ml）を、大豆トリプシンインヒビター（8 mg / ml）で）およびDNase（250 U / ml）の滅菌フェノールレッドを含有するDPBS中。 フィルターは両方のソリューションを殺菌し、フェノールレッドを含有するDPBSの元の色を返すようにpHを調整する。 </li></ol></li><li>細胞培養培地（NB / B27）を調製：1 mMピルビン酸ナトリウム、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）及びB27サプリメントを基本培地を補う。 FilteR殺菌し、光から保護します。使用前に37℃で媒体を平衡化し、5％CO 2。 </li><li> FACS緩衝液を準備しDPBS中の5％ウシ胎児血清（FBS）を。 47.5ミリリットルのDPBSに2.5ミリリットルのFBSを追加します。 </li><li>ポリ-D-リジン（PDL）でコーティングされたカバースリップを準備します。 <ol><li>オートクレーブ新しいカバーガラス。 </li><li>コー​​トPDLとカバースリップ（滅菌蒸留水中に100μgの/ ml）を37℃で一晩または室温で2時間インキュベートする。 </li><li>ウォッシュは、滅菌蒸留水を用いてカバースリップ。 NB / B27培地で一回洗浄する。カバースリップは使用前に、組織培養フード内で完全に乾燥させます。 </li></ol></li></ol> 2解剖と組織スライスの調製<ol><li>解剖の日に、吸収パッドと、70％のエタノールとカバーで解剖領域を拭う。 </li><li>滅菌袋から解剖ツールを削除します。氷の上の小さなペトリ皿や場所に氷冷滅菌DPBS / 1％P / Sを追加します。 </li><li>首を切るP4 のMath1-GF大手術用ハサミでP / ネスチン-CFPの仔マウスを微湾曲した鉗子で頭を押したままにします。皮膚を外し、静かにへらを使って頭蓋骨から脳をかき出すとDPBS / 1％P / Sを含むペトリ皿に移すし、＃5細かい鉗子で頭蓋骨をはがす。 <ol><li> ＃5細かい鉗子を使用して、慎重に脳の他の部分から小脳を分離する。可能な限り迅速に一度に一つの子犬を解剖してください。 </li><li>分子·機能解析のための十分なNEPのを得るために、8小脳の最小値を収集します。 </li></ol></li><li> 3％低融点アガロース溶液で2×2×2cmの埋め込み型を満たす。アガロースの温度はせいぜい37℃ではないことを確認してください。 </li><li>実験室の組織を軽くたたくことにより、小脳から余分な液体を除去します。縦位置で金型内に小脳を置きます。それはすぐに固化するできるように、氷の上に金型を配置します。ブロックあたり〜4小脳を使用してください。 </li><li>李を取得振動ブレードビブラトームを用いて組織切片をヴィング。かみそりの刃で小脳を含むアガロースブ​​ロックをトリミング。垂直位置に配向小脳でビブラトーム板にアガロースブ​​ロックを接着。 </li><li>氷冷滅菌DPBS / 1％P / Sをビブラトームのトレイを記入し、下に氷を置く。 <ol><li>小脳の全長を通して600μmのセクションをカット。穴あきスプーンを使用して、製氷皿からの切片を収集します。氷上でDPBS / 1％P / Sで満たされたペトリ皿内の場所セクション。 </li></ol></li></ol> 3マイクロダイセクションおよび細胞解離<ol><li>蛍光解剖顕微鏡下で組織切片を含むペトリ皿を置きます。 <ol><li> CFP +分子層およびGFP + EGL（ 図1の点線を参照）との間での解剖による細かい鉗子を用いて小脳セクションの残りの部分からEGLを慎重に分離。になり、これ分子層の任意の部分を含まないように注意してくださいネスチン発現バーグマングリアの汚染。 </li><li>可能な限り迅速に、この手順を完了し、細胞死を回避するために、氷上で組織を維持する。 </li><li>次のステップに進む前に、周囲の組織アガロースを削除します。 </li></ol></li><li>以前に、単一細胞懸濁液を得るために、2に記載のようにパパインベースのプロトコルを使用して顕微解剖EGL組織を消化する。 <ol><li>再懸濁FACSを介して、CFP-陽性細胞の収集のためのFACS緩衝液で細胞を。 </li></ol></li></ol> 4。セルソーティングおよびめっき<ol><li>適切なCFPフィルターを含む滅菌、高速フローサイトメーターを使用して、CFP蛍光のソート細胞と氷上で、FACS緩衝液で細胞を集める。各P4小脳からの約10万のNEPを取得します。 </li><li> 5分間300×gで遠心分離した細胞。さらなる実験のための分子解析や培養のために、すぐに細胞を使用してください。 </li><li>培養細胞に、予め温めておいたNB / B27 mの細胞を再懸濁以前に2に記載されているように、PDLコーティングしたカバーガラス上EDIAとプレート。 </li></ol>

<ol><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li>
<li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li>
<li>Riobo, N. A., Manning, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+signal+transduction+employed+by+vertebrate+Hedgehogs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs.</a> Biochem J. 403, 369-379 (2007).</li>
<li>Dahmane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sonic+Hedgehog-Gli+pathway+regulates+dorsal+brain+growth+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis.</a> Development. 128, 5201-5212 (2001).</li>
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<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li>
<li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li>
<li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li>
<li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li>
<li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li>
<li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li>
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<li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

ここで説明顕微解剖法は、分子的および機能的分析において使用するための生細胞の純粋な集団を単離することができる最初の手順である。 Li ら9によって実証されるように、 この方法で得られたのNEPを培養し、各種実験に組み込むことができ、その高い純度で、マイクロアレイ分析のためにも使用することができる。 これは顕微解剖技術に習熟するには時間がかかることが非常に重要です。のNEPは、ネスチン発現バーグマングリアはNEP細胞単離を汚染し、純度を損なうおそれのある分子層に非常に近接して、EGLの深い領域に位置している。マイクロダイセクションは、したがって、隣接する組織中の混入細胞が含まれておりませんことを確認し、保存的に行われる必要があります。ここで説明顕微解剖技術の主な利点は、furtheのために培養することができる生細胞を得る能力であるr個の実験。このため、この手順の間、全ての工程が迅速に行われることが重要であり、その組織は、できるだけ氷上に維持する。また、すべての機器·試薬は無菌でなければならない。この手順に従うと、細胞死と細胞...

小脳は、それぞれが異なる細胞型を含む、複数の細胞層から構成されている。開発中は、EGLは分子層とプルキンエ層はそれぞれ、バーグマングリアとプルキンエニューロンを含み、一方顆粒ニューロン前駆体（のGNP）が増殖して含まれています。小脳内のディープは、神経幹細胞（NSC）およびオリゴデンドロサイト1が含まれている白質を、ある。 ソニックヘッジホッグ（Shhが）小脳発生の調節において重要な役割を果たしており、特に、パッチが適用その受容体（PTC）、Shhの2-4シグナルの負の調節因子への結合を介してのGNPの増殖を促進する。 Shhシグナル伝達の異常な活性化は、髄芽腫（MB）、小児5,6で最も一般的な悪性脳腫瘍を生成します。 PTCミュータントMBトランスジェニックマウスモデルは、MBの研究のための強力なツールであり、人間のMB 7,8に似た腫瘍を発症。これらを使用したマウスは、それがのGNPはハリネズミ型MB 7起源の細胞であることが発見された。さらに、のG​​NPに加えて、私たちは最近、またMBを生じさせることができる開発する小脳のEGL内の神経前駆細胞のユニークな集団を同定した。これらの細胞は、タイプVIの中間フィラメントタンパク質、ネスチンを高レベルで発現し、9のNEPと呼ばれる。のNEPは、EGLの深部内に配置され、唯一の新生児小脳の開発中に一過的に存在している。彼らはのGNPのような顆粒細胞系譜にコミットしますが、彼 ​​らは静止状態にしてのMath1、従来のGNP 10のためのよく確立されたマーカーを発現しないように区別されます。さらに、NEPのは彼らMBの腫瘍形成のための新規の原点になりShhのシグナル伝達経路9、起動後のMBの上昇よりも効率的にのGNPを与える。 私たちは、以前に顕微解剖技術によって生後4日目（P4）での小脳のEGLからのNEPを隔離ここで9について説明した。組織の直接顕微鏡可視化を介したマイクロダイセクションは、小脳のEGLの特定の解剖を可能にします。ネスチンはまた、分子層1,7,11,12に小脳白質中のNSCによってとバーグマングリアによって発現し、それは彼らが分析を混乱さと同じように、これらの細胞は、含まれていないことが非常に重要でしているように、これが必要です。顕微解剖組織から単離された細胞は、分子分析のために直ちに使用することができ、またはそれらは、さらなる用途のために培養することができる。 具体的にはEGLをmicrodissectingにおいて補助するために、さらなるのNEPを精製する、 のMath1-GFP（緑色蛍光タンパク質）マウスは、 ネスチン-CFP（シアン蛍光タンパク質）マウスと交配した。 Math1または特異的のGNP及びGFPの発現によって発現される転写因子は、EGL 9,13においてはっきりと見える。 ネスチン-CFPマウスはCFPの核型を発現し、容易に分子層9,14に視覚化することができる。一緒に、GFPとCFP式がEGLのマイクロダイセクションのための境界を作成します（ 図1を参照）。 CFP陽性のNEPは、その後解剖しEGLsの酵素的解離に続いて、FACSによって単離した。 現在、EGLから細胞を単離するための最もよく利用される方法は、全小脳組織15,16のパーコール勾配遠心分離である。しかし、この方法は、完全に分子層と白質のネスチン+細胞集団を除外することができないのでのNEPの研究のために使用することができない。関心のある細胞を除去するためにレーザエネルギーの転送を利用するレーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、異種の組織17,18内の特定の細胞を単離するために使用されるが、捕捉された細胞のみがDNA、RNAおよびタンパク質の回収のために使用されないことができる別の方法である培養することができるように。 このプロトコルは、具体的には、EGLからのNEPの生きている、純粋な集団を単離する方法を提供します。この技術は、認識可能な解剖学的アーキテクチャまたは蛍光標識された細胞/領域のいずれかを有する異なる組織タイプに適用することができる。したがって、細胞単離プロトコールにこの新規顕微解剖技術を組み込むの主な利点は、細胞が隣接する組織を汚染除去するために、特定の組織領域から単離することができ、細胞は、他のアプリケーションの分析または培養のためにすぐに収集することができることである。

<table><tbody><tr><td>神経基礎培地</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>ミリポア</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>超高純度低融解温度 アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロダイセクションによる開発小脳とは異なる細胞集団の単離

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

顕微解剖は、組織の特定の領域を分離し、隣接領域における細胞源からの汚染を排除することができる新規な技術である。この方法は、最初にネスチン発現前駆細胞（のNEP）の研究では、小脳の外部胚層（EGL）内の細胞の新たに同定された集団において利用した。蛍光活性化細胞分類（FACS）と組み合わせてマイクロダイセクションを使用して、のNEPの純粋な集団は、小脳におけるEGLにおける従来の顆粒神経細胞前駆体から及び他の汚染ネスチン発現細胞とは別に収集した。マイクロダイセクションがなければ、のNEPの機能解析は、パーコール勾配遠心分離およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクションとして利用可能な現在の方法では不可能でした。この技術は、認識可能な領域または蛍光標識された細胞のいずれかを含むさまざまな組織との使用のために適用することができる。最も重要なことは、このmicrodissectioの主な利点n個の技術は、単離された細胞が生きていると、他に記載された方法で、現在は不可能であるさらなる実験のために培養することができるということです。

図1Aに示すように、小脳スライスは小脳EGLは、GFP発現のGNPによって支配された分子層がCFP陽性グリア細胞によって濃縮された、P4 のMath1-GFP / ネスチン-CFPマウスから調製した。 （; 図1A点線に沿って）EGLの深部に位置しているのNEPを単離するために、スライスは、EGLと分子層の間に顕微解剖された。解剖EGLs（ 図1B）は、次いで、FACS続い酵素的解離のために収集された。 予想されたように、解剖しEGLにおける細胞の大部分（85％以上）は、GFP（ 図2A）について陽性であった従来のGNPであった。のNEP（CFP +）は、EGL細胞集団のわずか約5％を占めている。ほとんどの細胞はいずれも、FACS分析に基づくGFP及びCFPのための二重陽性はなかった。 FACSによって精製CFP +細胞は、分化poteを調べるために、in vitroで培養したntial。 <...

ネスチン発現前駆細胞は、発展途上小脳における神経前駆細胞の新たに同定された集団である。蛍光活性化細胞選別と組み合わせてここで示さ顕微解剖技術を用いて、この細胞集団は、他の小脳領域から汚染を含んでいない精製することができ、さらなる研究のために培養することができる。

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

この手順の全体的な目標は、発生中の小脳から特定の細胞集団を分離することです。これは、まず蛍光タンパク質を保有する新生児マウスから小脳を採取することによって達成されます。手順の2番目のステップは、ビブラートを使用して生きた組織切片を取得することです。3番目のステップは、蛍光解剖顕微鏡で小脳の外部胚細胞層をマイクロダイセクションすることです。最後のステップは、組織を単一の細胞懸濁液に解離し、蛍光活性化細胞ソーティングによって細胞を収集することです。最終的に、結果は、特定の細胞集団を小脳から分離できることを示すことができます。レーザー捕捉、マイクロ解剖などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、細胞が生きており、培養できることです。さらなる実験のために この手順では、オートクレーブを使用して手術器具を滅菌します。新鮮な、または再加熱された37%の低融点のアロスを摂氏37度の水浴で使用する準備ができています。パパヤンベースの細胞解離に必要な溶液を作成します。新鮮なNBB 27培地を準備します。その後、ろ過、滅菌、インキュベーターで保存します。ファックスバッファーを準備し、ポリデリシンカバースリップを準備します。最初にオートクレーブカバーを塗るには、滅菌水1ミリリットルあたり100マイクログラムのポリデリシンが入っています。次に、カバースリップを摂氏37度で2時間、または室温で一晩インキュベートします。その後、カバースリップを使用する前に、カバースリップを蒸留水で洗浄し、続いてNBB 27メディアで洗浄します。それらを完全に乾かします。これは開始までに少なくとも1時間かかります。最初に解剖エリアを準備します。70%エタノールできれいに拭きます。次に、吸収パッドで覆います。次に、滅菌ポーチからツールを取り出し、使用できるように配置します。第三に、氷冷した滅菌DPBSを皿に1%ペンストリップで入れ、氷の上に置きます。蛍光マーカーを発現するP 4の子犬の脳を解剖します。次に、それをDPBSの準備済み皿に移します。鉗子を使用して、小脳を脳の他の部分から慎重に分離します。これらの小脳は、マーカーの数学1、GFPを発現し、EGLがGFPを発現し、分子層がCFPに陽性であるCFPにネストします。次に、2cmの立方体の埋め込み型にアグロ溶液を充填します。摂氏37度より暖かくないことを確認してください。穴の開いたスプーンで小脳を拾い上げ、ティッシュを優しく軽くたたいて乾かします。次に、鉗子を使用して、型にセットします。針を使用して、小脳を垂直方向にします。1回約4つを型に装填します。かみそりの刃を使用して、型をすばやく固めるように型を氷の上に置きます。ブロックをトリムして、切片作成時間を短縮します。次に、小脳が垂直になるようにブロックをプレートに接着します。1%ペントストラップ付きの氷冷DPBSを充填トレイにロードし、トレイの下に氷を置いて冷たく保ちます。次に、バイブレーターでブロックをセクション化します。600ミクロンの切片をカットして収集します。穴あきスプーンを使用して製氷トレイから取り出し、氷の上のA-D-P-B-S充填皿に移します。蛍光解剖顕微鏡下。できるだけ早くスライスを調べてください。EGLを小脳部分の残りの部分から慎重に分離します。細い鉗子を使用して、CFP陽性分子層とGFP陽性EGLの間を解剖します。マイクロダイセクション中は、隣接する領域からの汚染を避けるために非常に保守的であること。GFP陽性EGL組織を氷上の新しいDPBS充填皿に移します。分子層組織を含めると、ネスティングを発現するバーグマングリアで培養物が汚染されるため、避けてください。次に、単離されたEGL組織を囲むアグロスを除去します。EGLは、シングルセル懸濁液のpaanベースのプロトコルを使用して解離できるようになりました。これが完了したら、ファックス バッファ内のセルをサスペンドします。ファックスを使用してCFPセルの収集を進めます。高速サイトメーターとCFPフィルターを使用してそれらを選別し、氷のように冷たいファックスバッファーに引き込みます。Pの4つの小脳あたり約100, 000 NPSを取得する必要があります。次に、プールした細胞を300Gで5分間遠心分離します。細胞をすぐに利用して培養します。それらを温めたNBB 27メディアで吊るします。次に、ポリDリジンコーティングされたカバースリップにそれらをロードします。細胞ベラスライスは、CFPマウスのP 4 math one GFP nestから調製しました。小脳EGLは主にGMPを発現するGFPを含んでおり、グリアを発現するCFPに富む分子層から容易に分離することができました 事実分析は、EGLの細胞の85%以上が従来のGNPであることを示しました。 NEPは、マイクロダイセクションによってEGLの深部から分離され、その後に事実が続きました。これらの細胞は、EGLの4日間の培養における細胞の約5%を占めていました。事実は、NPSを分離し、ベータチューブリン発現ニューロンを生じさせた。これは、系統制限されたニューロン前駆細胞の特徴です。この手順を試みるときは、迅速に作業し、組織をできるだけ氷の上に保つことを忘れないでください。

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神経科学

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ミクログリア生物学の成功の調査の一つの鍵は、CNS組織からの単離の間にex vivoでミクログリア免疫機能の維持である。蛍光イメージング、免疫細胞、および炎症誘発性刺激リポ多糖（LPS）とパム3 CSK 4（PAM）を用いたELISA次のミクログリアの活性化によって評価されるように、高純度と免疫機能細胞培養で回転振盪結果を経由してミクログリアを分離する。...

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

小脳外顆粒層は、脳の発達で最大のトランジット増幅のサイトです。ここでは、胚の14日目のニワトリ胚からex vivoでエレクトロポレーションおよび小脳スライスの文化を使用して、増殖のピーク時にこの層に遺伝子改変をターゲットにするプロトコルを提示します。...

チック小脳スライスと顆粒細胞前駆体の空間的にターゲットを絞ったエレクトロポレーションの ex vivo培養

マウス小脳・髄鞘形成と中枢神経系検査のメカニズムを調査するため適切な免疫組織化学的染色ミエリン鞘からスライス培養切片を準備する方法をご紹介します。...

準備や髄脊髄小脳スライス培養の免疫染色

インビトロ実験を行い、可能な限り十分な生体内の状態を反映することは容易な作業ではありません。一次細胞培養物の使用は、生物全体の細胞生物学を理解するための重要なステップです。提供されたプロトコルは、正常に成長し、胚性マウス小脳ニューロンを培養する方法を概説します。...

胚性マウス小脳から単離されたニューロンの一次培養

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。...

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

ここでは、マウスCNSからの複数のグリア細胞集団のin...

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

異なる小脳領域は、異なる行動出力に役割を果たすのに関与してきましたが、根本的な分子メカニズムは不明のままです。本研究では、RNAを単離し、遺伝子発現の違いを検査することによって分子の違いを探るために、半球の小脳皮質、前部および後部の小脳部、および深い小脳核を再現的かつ迅速に解剖する方法を説明する。...

分子解析のための小脳局所解剖

ここでは、費用対効果が高く、効率的で実行可能な一次小脳顆粒細胞前駆体(GCP)の遺伝子操作のための再現性のある インビトロ...

顆粒細胞前駆体における原発性シリウム依存シグナル伝達経路を研究するための効率的で費用対効果の高いエレクトロポレーション法

学ぶマイクロダイセクションと蛍光活性化細胞分選を用いて、新生マウスの発育中小脳からネスチン発現前駆細胞を単離する方法。生細胞培養が可能で、小脳発生の研究に有用です。

マイクロダイセクションによる開発小脳とは異なる細胞集団の単離

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