マイクロダイセクションによる開発小脳とは異なる細胞集団の単離

この手順の全体的な目標は、発生中の小脳から特定の細胞集団を分離することです。これは、まず蛍光タンパク質を保有する新生児マウスから小脳を採取することによって達成されます。手順の2番目のステップは、ビブラートを使用して生きた組織切片を取得することです。

3番目のステップは、蛍光解剖顕微鏡で小脳の外部胚細胞層をマイクロダイセクションすることです。最後のステップは、組織を単一の細胞懸濁液に解離し、蛍光活性化細胞ソーティングによって細胞を収集することです。最終的に、結果は、特定の細胞集団を小脳から分離できることを示すことができます。

レーザー捕捉、マイクロ解剖などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、細胞が生きており、培養できることです。さらなる実験のために この手順では、オートクレーブを使用して手術器具を滅菌します。新鮮な、または再加熱された37%の低融点のアロスを摂氏37度の水浴で使用する準備ができています。

パパヤンベースの細胞解離に必要な溶液を作成します。新鮮なNBB 27培地を準備します。その後、ろ過、滅菌、インキュベーターで保存します。

ファックスバッファーを準備し、ポリデリシンカバースリップを準備します。最初にオートクレーブカバーを塗るには、滅菌水1ミリリットルあたり100マイクログラムのポリデリシンが入っています。次に、カバースリップを摂氏37度で2時間、または室温で一晩インキュベートします。

その後、カバースリップを使用する前に、カバースリップを蒸留水で洗浄し、続いてNBB 27メディアで洗浄します。それらを完全に乾かします。これは開始までに少なくとも1時間かかります。

最初に解剖エリアを準備します。70%エタノールできれいに拭きます。次に、吸収パッドで覆います。

次に、滅菌ポーチからツールを取り出し、使用できるように配置します。第三に、氷冷した滅菌DPBSを皿に1%ペンストリップで入れ、氷の上に置きます。蛍光マーカーを発現するP 4の子犬の脳を解剖します。

次に、それをDPBSの準備済み皿に移します。鉗子を使用して、小脳を脳の他の部分から慎重に分離します。これらの小脳は、マーカーの数学1、GFPを発現し、EGLがGFPを発現し、分子層がCFPに陽性であるCFPにネストします。

次に、2cmの立方体の埋め込み型にアグロ溶液を充填します。摂氏37度より暖かくないことを確認してください。穴の開いたスプーンで小脳を拾い上げ、ティッシュを優しく軽くたたいて乾かします。

次に、鉗子を使用して、型にセットします。針を使用して、小脳を垂直方向にします。1回約4つを型に装填します。

かみそりの刃を使用して、型をすばやく固めるように型を氷の上に置きます。ブロックをトリムして、切片作成時間を短縮します。次に、小脳が垂直になるようにブロックをプレートに接着します。

1%ペントストラップ付きの氷冷DPBSを充填トレイにロードし、トレイの下に氷を置いて冷たく保ちます。次に、バイブレーターでブロックをセクション化します。600ミクロンの切片をカットして収集します。

穴あきスプーンを使用して製氷トレイから取り出し、氷の上のA-D-P-B-S充填皿に移します。蛍光解剖顕微鏡下。できるだけ早くスライスを調べてください。

EGLを小脳部分の残りの部分から慎重に分離します。細い鉗子を使用して、CFP陽性分子層とGFP陽性EGLの間を解剖します。マイクロダイセクション中は、隣接する領域からの汚染を避けるために非常に保守的であること。

GFP陽性EGL組織を氷上の新しいDPBS充填皿に移します。分子層組織を含めると、ネスティングを発現するバーグマングリアで培養物が汚染されるため、避けてください。次に、単離されたEGL組織を囲むアグロスを除去します。

EGLは、シングルセル懸濁液のpaanベースのプロトコルを使用して解離できるようになりました。これが完了したら、ファックス バッファ内のセルをサスペンドします。ファックスを使用してCFPセルの収集を進めます。

高速サイトメーターとCFPフィルターを使用してそれらを選別し、氷のように冷たいファックスバッファーに引き込みます。Pの4つの小脳あたり約100, 000 NPSを取得する必要があります。次に、プールした細胞を300Gで5分間遠心分離します。

細胞をすぐに利用して培養します。それらを温めたNBB 27メディアで吊るします。次に、ポリDリジンコーティングされたカバースリップにそれらをロードします。

細胞ベラスライスは、CFPマウスのP 4 math one GFP nestから調製しました。小脳EGLは主にGMPを発現するGFPを含んでおり、グリアを発現するCFPに富む分子層から容易に分離することができました 事実分析は、EGLの細胞の85%以上が従来のGNPであることを示しました。 NEPは、マイクロダイセクションによってEGLの深部から分離され、その後に事実が続きました。

これらの細胞は、EGLの4日間の培養における細胞の約5%を占めていました。事実は、NPSを分離し、ベータチューブリン発現ニューロンを生じさせた。これは、系統制限されたニューロン前駆細胞の特徴です。

この手順を試みるときは、迅速に作業し、組織をできるだけ氷の上に保つことを忘れないでください。