マウス仔脳皮質からのオリゴデンドロサイト前駆細胞の単離と培養

マウスの子犬皮質を取ります。

組織の細胞外マトリックスを消化するタンパク質分解酵素を追加します。次に、組織を機械的に解離させ、細胞を緩めます。

グリア培地とDNaseを添加して、汚染されたDNAを分解します。

組織を機械的に解離して、ニューロンとグリア細胞を放出します。

未消化の組織が落ち着いたら、細胞を含む培地を回収し、遠心分離します。上清を取り除きます。

細胞をグリア培地に再浮遊させ、細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされたフラスコにプレートします。

インキュベート。アストロサイトは、他の細胞よりもコーティングされた表面に強く付着します。グリア培地はグリア細胞の生存のみを促進します。

メディアを交換して、破片を取り除きます。

振とうしながらインキュベートして、上にあるオリゴデンドロサイト前駆細胞、OPC、およびミクログリアを剥離します。

細胞を含む培地を培養プレートに移します。

リア接着の違いを促進するために、振とうしながらインキュベートします。

非接着性OPC上清をポリ-D-リジンでコーティングされたマルチウェルプレートに移します。OPCの遵守のためにインキュベートします。

メディアをOPCメディアに交換して、OPCの成長を可能にします。

0.53ミリモルEDTAを含む0.05%トリプシン1ミリリットルを、組織を含む各チューブに加えます。混合物を10ミリリットルのピペットで約20回粉砕します。次に、細胞懸濁液を空の50ミリリットルの円錐形チューブに移します。

溶液を摂氏37度および5%二酸化炭素で15分間インキュベートし、8分後にライセートを穏やかに攪拌します。インキュベーション後、5ミリリットルのMGMと200マイクロリットルのDNase-Iを各チューブに加え、最終濃度を50マイクログラム/ミリリットルにします。各ライセートを10ミリリットルのピペットで10回粉砕します。

次に、細胞懸濁液を室温で3分間放置して、解離していない組織がチューブの底に沈殿できるようにします。細胞懸濁液を新しい50ミリリットルの円錐形チューブに移し、解離していない組織を残します。遠心分離後、細胞ペレットを5ミリリットルのMGMに再懸濁し、20回粉砕します。

細胞懸濁液をコーティングされたT-25フラスコにプレートし、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。オリゴデンドロサイト前駆細胞単離を行うには、細胞を15時間振とうします。次に、フラスコから上清を取り出し、滅菌ペトリ皿にプレートします。

上清を摂氏37度および5%二酸化炭素で30分間インキュベートし、15分後に旋回して残りのミクログリアを除去します。非接着性細胞上清を除去します。細胞をカウントし、ポリ-D-リジンでコーティングされた表面に所望の濃度でプレートします。

細胞を少なくとも1時間インキュベーターに戻します。次に、培地の95%を穏やかに吸引し、温かいOPC培地をゆっくりと加え、OPCの破壊を最小限に抑えるためにウェルの壁にピペッティングします。