マウス蝸牛の特定の周波数領域におけるリボンシナプスの評価

非特異的相互作用を防ぐ透過処理剤とブロッキング剤を含む前処理されたマウス蝸牛ターンを含むチューブから始めます。

各ターンは異なる音の周波数を検出し、音を電気信号に変換する有毛細胞を含んでいます。これらの信号は、リボンシナプスの神経伝達物質を介して聴覚神経に伝達されます。

溶液を取り除き、リボンシナプスで毛髪や神経細胞のタンパク質と相互作用する一次抗体を加えて洗浄します。

一次抗体に結合する赤色および緑色の蛍光色素でタグ付けされた二次抗体とインキュベートします。

して結合していない二次抗体を除去します。

色素を含む封入剤を敷入したスライドガラスに試料を置き、核を青く染色します。

カバーガラスを取り付けます。乾燥させてから、共焦点顕微鏡を使用して、さまざまな深さで各セグメントを画像化します。

リボンシナプスは、赤と緑の涙点が密接に配置されたように見えます。

各ターンでこれらの機能的な涙点を数えて、音の周波数に対する応答を相関させます。

解剖後、各蝸牛を個別の2.5ミリリットル遠心分離管に入れます。0.1%Triton X-100中のPBS中の10%ヤギ血清で非特異的結合をローテーターの室温で1時間ブロックします。

インキュベーションの最後に、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、解剖顕微鏡下で溶液を除去します。PBS中の5%ヤギ血清および0.1%Triton X-100で希釈した目的の一次抗体と、ローテーター上で摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌朝、組織サンプルを洗浄ごとに冷たい0.1モルPBSで5分間3回すすぎ、残留一次抗体を除去します。次に、5%ヤギ血清のPBSおよび0.1%Triton X-100で希釈した適切な二次抗体で、光から保護したローテーター上で室温で2〜3時間標識します。

インキュベーションの最後に、示されているようにサンプルを0.1モルPBSで3回洗浄し、標本を0.1モルPBSを含む個々の35ミリメートルプレートに移します。DAPIを添加した封入剤をスライドに一滴垂らし、標本をPBSから封入培地に移します。カバーガラスの片方の端を各スライドに置き、離してカバーガラスをそっと落とします。次に、スライドボックス内でスライドを摂氏4度で一晩乾燥させます。

標本を画像化するには、適切なレーザーと 63 倍の高解像度油浸レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用します。各蝸牛ターンから 8 マイクロメートルの共焦点 Z スタックを取得します。シナプス句点数の場合、zスタックを0.3マイクロメートルのステップサイズで設定して、すべてのシナプス涙点を画像化できるようにし、涙点を含む画像をスタックにマージしてz軸投影を取得します。

結合した画像を適切な画像処理ソフトウェアプログラムにインポートします。特定の周波数領域における各zスタックのシナプス総数をDAPI陽性の内有毛細胞の数で割って、各細胞のシナプス点数を計算します。それぞれの特定の周波数領域で、9〜11個の内有毛細胞を含む異なる顕微鏡野の3つの画像ですべてのシナプス点を平均化します。

細胞骨格構造とシナプスの局在をよりよく視覚化するには、ブラシツールを使用して、個々の内部有毛細胞のシナプス構造と分布を視覚的に評価します。シナプス前リボンとシナプス後受容体パッチの並置を調べるには、長方形のマーキーツールを使用してリボンの周りのボクセル空間を抽出し、画像カットを使用して個々のリボンを分離します。次に、[画像]と[画像サイズ]をクリックして、ペアのシナプスと孤立したリボンを識別するために使用できるこれらのミニチュア投影のサムネイル配列を取得します。