ラット脳の異なる細胞内コンパートメントにおけるプロテアソーム活性の測定

ラットと恐怖条件付きラットの両方の脳の外側扁桃体から収集された細胞内核およびシナプス画分から始めます。

各細胞内画分には、不要な細胞タンパク質の分解に関与するプロテアソーム複合体の触媒コアである、さまざまな濃度の20Sプロテアソームが含まれています。

ATPと蛍光ペプチド基質を含むアッセイバッファーをサンプルに加え、インキュベートします。

ATPの存在下では、プロテアソームは蛍光ペプチドを切断し、遊離蛍光分子を放出します。

プレートリーダーを使用して、一定の間隔で蛍光強度を測定します。

分子の既知の標準濃度と比較して定量

蛍光強度は、サンプル中のプロテアソーム活性に比例します。

恐怖条件ラットの核画分におけるプロテアソーム活性の増加は記憶関連遺伝子発現の変化を示唆し、シナプス画分における活性の低下は長期記憶維持に必要なシナプスタンパク質発現の変化を示しています。

アッセイをセットアップするには、プレートリーダーを摂氏37度に予熱し、実行中保持します。励起を360ナノメートルに、発光を460ナノメートルに設定します。使用した96ウェルプレートがクリアな場合は、Optics PositionをBottomに設定します。暗い96ウェルプレートを使用する場合は、光学位置を上に設定します。2時間の時間でキネティックランをプログラムし、30分ごとにスキャンします。

キットに付属の20s 10xアッセイバッファーを13.5ミリリットルの超純水で再構成します。100ミリモルのATPを14マイクロリットルを現在の1xバッファーに加えます。これにより、サンプル中のプロテアソーム活性が大幅に向上し、アッセイの信頼性が向上します。キットに付属のAMC標準を100マイクロリットルのDMSOで再構成します。AMC 規格は光に敏感であるため、暗闇または暗い場所で AMC 規格を使用して手順を実行します。

一連の高濃度から低濃度のAMCからAMCの標準曲線を作成します。この曲線は、プレートリーダーのキャリブレーションと均質化されたサンプル中のプロテアソーム活性の分析に使用されます。キットに付属のプロテアソーム基質を65マイクロリットルのDMSOで再構成します。また、基板は光に敏感であるため、暗闇または暗い場所でもこのステップを実行してください。

次に、20 Sアッセイバッファーを使用して、新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブでプロテアソーム基質の1〜20希釈液を作成します。正規化された量の目的のサンプルを96ウェルプレートに加えます。各サンプルを重複して実行します。必要なサンプルの量は、組織の準備によって異なります。一般に、細胞内画分には10〜20マイクログラムで十分です。

超純水でサンプルウェルの容量を80マイクロリットルにします。添加量は、添加されるサンプルの量によって異なります。2つの別々の井戸に、80マイクロリットルの水を単独で加えます。これらはアッセイブランクになります。アッセイブランクを含む各ウェルに10マイクロリットルの20 Sアッセイバッファーを追加します。リピーターまたは自動ピペットを使用して、ウェル全体で一貫したアッセイ量を確保します。

電気を消すか、暗い部屋に入ります。希釈したAMC標準試料100マイクロリットルすべてを新しいウェルに加え、各標準試料に1つのウェルを使用します。暗所で、リピーターまたは自動ピペットを使用して、サンプルおよびアッセイブランクを含むウェルに10マイクロリットルの希釈プロテアソーム基質を追加しますが、AMC標準は加えません。プレートをプレートリーダーに置き、キネティックランを開始します。