内皮細胞の膜電位を測定することの意義は何ですか？

膜電位を測定することで内皮細胞の機能状態とシグナル伝達経路を理解するのに役立ちます。

カルシウム感受性染料はどのように機能しますか？

染料はカルシウムイオンに結合し、カルシウム濃度が高くなると蛍光強度が増加し、細胞内カルシウムレベルの定量化を可能にします。

膜電位の変化は何を意味しますか？

膜電位の変化は、イオンチャネルの活性化やシグナル伝達経路の関与など、細胞活動の変化を示す可能性があります。

この方法は他の細胞タイプにも適用できますか？

はい、この方法論は他の細胞タイプの膜電位とカルシウムシグナリングを研究するために適応できます。

薬理学的因子はこの研究でどのような役割を果たしますか？

薬理学的因子はシグナル伝達経路を操作し、カルシウムレベルと膜電位への影響を評価するために使用されます。

この技術は生きた細胞イメージングに適していますか？

はい、この技術は生きた細胞イメージングのために設計されており、細胞のダイナミクスをリアルタイムで観察できます。

マウス細動脈内皮におけるカルシウム動態と膜電位変化の解析

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

0 views • 2:38 min • April 28th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウスの脳から採取した細動脈内皮チューブを、連続的なバッファーフローのあるチャンバー内に固定します。

チャンバーを記録セットアップに配置します。

カルシウム感受性蛍光色素を導入します。細胞に色素を取り込むためにインキュベートします。

洗浄して、内部化されていない染料を取り除きます。

内皮細胞に電極を挿入し、静止膜電位を記録します。

細胞内カルシウムの色素への結合を促進するために、浴の温度を生理学的温度まで上げます。

色素を励起し、蛍光を測定して、ベースラインの細胞カルシウムレベルを定量します。

内皮細胞上の特定のGタンパク質共役受容体に結合する薬剤を導入し、シグナル伝達カスケードを開始します。

このカスケードは、小胞体から細胞質にカルシウムイオンを放出し、カルシウム色素の結合と蛍光を強化します。

細胞質カルシウムレベルの上昇もカリウムチャネルを活性化し、カリウムイオンの流出を促進し、膜電位を低下させます。

データを記録します。

蛍光の増加と膜電位の低下は、機能的な内皮管を示しています。

内皮膜電位を測定するには、4倍の対物レンズを通して見ながら、マイクロマニピュレーターを使用して、動脈内皮管の細胞のすぐ上に鋭い電極の先端を慎重に配置します。徐々に倍率を400倍に上げ、必要に応じて電極先端の位置を変更します。マイクロマニピュレーターを使用して、鋭利な電極の先端を内皮管の細胞の1つにそっと挿入し、電位計を使用してVMの記録を開始します。

内皮安静時 VM がマイナス 30 ミリボルトからマイナス 40 ミリボルトまで安定したら、実験目的ごとに目的の薬剤を適用します。原形質膜または目的の細胞小器官の蛍光トラッカーを内皮チューブに摂氏37度で15〜30分間ロードします。新鮮な超融合生理的塩溶液で細胞を洗浄し、それぞれの色素の励起波長で顕微鏡下で生細胞を画像化します。