Name: ヘキストの分離および特性評価低 CD45負マウス肺間葉系幹細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 55 s
Description: 学ぶマウス肺間葉系幹細胞の分離法。フローサイトメトリーでHoechst低CD45陰性細胞を選別し、コロニー形成アッセイで分化能を評価します。肺疾患研究への応用が期待されます。

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AHA GIA0855953G、NIH 1R01 HL091105 - 01：この作品は、SMMへの補助金によって賄われていた。追加のサポートされていました：DW：NIH RO1DK075013、DDKとKleberg財団、UCCCフローサイトメトリーコア（NIH 5 P30 CA 46934〜15）、UCCCマイクロアレイコア（NCI P30 CA 46934〜14）。

1。肺の分離<ol><li>無菌テクニックを使用して放血が続くイソフルランの過剰摂取によるマウス成体マウス（; 18〜20グラムC57Bl6J年齢8〜10週）を生け贄に捧げる。プロファイルには、菌株間でわずかに異なります。 </li><li>外科的にダイヤフラムを削除する、マウスの各側面に横方向に胸郭を切断することにより胸腔を開く。優しくリン酸の3 - 5mlsを使用して、右心臓の心室を灌流することによって肺から血液をフラッシュには生理食塩水（PBS）を。 </li><li> （HBSS）緩衝生理食塩水ハンクスで満たされたペトリ皿で​​気管と大きな気管支と場所を削除する肺葉を解剖。すべての肺葉の鉗子の次のコレクションは、皿の蓋の上に組織を置くために使用されます。組織は、それらが浮くと移動するほど、それらは湿ったではなく、維持するのに十分な液体で使い捨て外科用メスを用いて小さな部分に刻まれて。 </li><li>マウスの一つの後肢を摘出し、FLOを設定するには、染色のコントロールとして使用するために骨髄を分離ワットメトリーゲート。前述1に記載の骨髄（BM）を染色。 </li></ol> 2。肺組織からの単細胞懸濁液の調製<ol><li> 、滅菌HBSSに溶解したワーシントン2型コラゲナーゼ（猫＃LS004202ワージントンの生化学、レイクウッド、ニュージャージー州）は、予め温めておいた0.2％の5mls：各肺は、0.2グラムの体積比に最適化された組織の重量を用いて消化する。混合物を30分間2,3に対して37℃の水浴中に浸漬される。 </li><li>肺組織のダイジェストが10ミリリットルピペット（約10回の繰り返し）を介して容易に流れるまで、よくサンプルを砕いて粉にする。 37℃でさらに15分間インキュベート° Cは、組織がより均一な単一の細胞懸濁液を消化し、確実に完了する。 </li><li> HBSSによる肺の細胞懸濁液を希釈し、残存組織の断片を分散させるために5ミリリットルピペットでひいて粉にする。 </li><li>未消化の組織片を除去するために70μMセルストレーナーを使用してサスペンションをフィルタリングする。サンプルはmultiplに分けることができます。一つのセルストレーナーの過負荷を防止し、時間を短縮するためにこの時点でeはコニカルチューブ。 </li><li>ペレット1500rpmでと上清をデカントで10分間、細胞懸濁液。 </li><li> 5分間室温でインキュベート、再懸濁し、細胞ペレットを穏やかに室温RBC溶解バッファー（猫＃00-4333-57 eBiosciences、サンディエゴ、CA）を使用。溶解バッファーを不活化し、破片と細胞の凝集物を除去するために40μmのセルストレイナーを使用して細胞懸濁液をフィルタするためにHBSSの等量を追加。 </li><li>各サンプルのピペット10μLが煤けると肺と血球計数器を用いてBM試料の両方の細胞数をカウントする。注：セルの合計量を記録する。 </li><li>ペレット10分間1500rpmで遠心分離による肺細胞の単一の細胞懸濁液。 </li><li>猫＃11965-092）を含む2％ウシ胎児bovi、温めておいたで1 × 10 6細胞/ ml（37℃）DMEM +（ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（Gibco社、カールスバッド、カリフォルニア州はで肺と骨髄細胞の両方を再懸濁しますNE血清（FBS）および10mMのHEPES。 </li><li>ヘキスト33342色素（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ、猫＃B2261）の1mg/mlのストック溶液の準備水のをと1,4を殺菌フィルタ。ヘキスト染料は、-80℃でアリコートとして格納されることがあります</li><li>単一の細胞懸濁液に5μg/mlの最終濃度（1mg/mlの株式の200倍希釈）にHoescht 33342染料を追加。 </li><li> 37正確に90分間° Cの水浴中で穏やかに反転し、インキュベートして細胞を混ぜる。 </li></ol> 3。染色とフローサイトメトリー分析のための肺の細胞懸濁液の調製<ol><li> 90分後にヘキスト染色した肺の細胞を持つすべてのステップは、色素流出を防ぐために、4℃または氷上で実行する必要があります。 4℃で10分間1500rpmで遠心分離によってペレットは、細胞℃、氷冷染色バッファー（PBS 2パーセントFBS）で細胞を再懸濁する。 </li><li> 2％含有するPBSの300 -600μl使用しない以上の7 × 10以上の細胞/チューブの濃度で再懸濁し、細胞FBSと10mMのHEPES。 </li><li> 。肺とBM試料の猫＃559864）氷上で10〜15分間インキュベート中に非染色制御を含む;。十分にCD45抗体を（通常はCD45 - APC（BD Pharmingen社、サンディエゴ、カリフォルニア州の1:200希釈tittered追加実験手順は、分析のゲートを設定すると便利です。 </li><li> 4で、細胞をペレット化する° C、1500 rpmで5分間。チルド染色バッファー（PBS 2パーセントFBS）500μlの上清と再懸細胞をデカントします。 （;猫＃14から956 - 1D Fisherbrand、イリノイ州シャンバーグ）予冷したスナップキャップポリプロピレンチューブに移す。 </li><li>死細胞を除外するために2μg/mlの最終濃度試料にヨウ化プロピジウム（PI、PBSで200μg/mlの株式）を追加します。 PIは、フローサイトメトリー解析の際に正しい蛍光プロファイルを達成するためにヘキスト33342色素と組み合わせて使用​​する必要があります。 </li><li>フローサイトメトリー分析まで、光から保護チューブを氷中に、保管してください。 </li></ol> 4。定義と分離するフローサイトメトリー分析サイドポピュレーション（SP）を検出するためのヘキスト色素流出を使用して肺間葉系幹細胞（肺MSC）人口<ol><li>このアッセイは、以下の機器の要件があります。 </li><ul><li> 488 nmのとUV（350〜355 nm）のレーザー</li><li>青（65分の450）と赤（50分の675）フィルターとUVレーザーのパス上の2検出器。 </li><li> UV赤検出器は、赤の信号のための高感度を持っている必要があります。これは古いセルソーターによる問題である可能性があります。 </li><li> 50から10にサンプルを維持するためにチラーユニット℃に</li></ul><li>レーザーの位置を合わせ、製造業者のプロトコルに従って細胞選別のために設定する。 </li><li>赤（x軸）と青（y軸）リニアスケールを使用してヘキスト信号を収集する。 </li><li>トレーリング側の人口の適切な表示を可能にするために、プロット上の中心の右上にG0/G1ピークを配置する光電子増倍管の電圧を調整します。細胞周期のS期とG2全体の部分は、プロットの右上にオフスケールの可能性があります。青SIG赤の信号が暗いしながら内部は比較的明るいです。典型的なMoFlo XDP（ベックマンコールター、マイアミ、フロリダ州）の電圧は青のための425および赤色650です。 </li><li>死細胞は、PIを用いてゲートです。標準のPIのパス（励起488nmの、放射630nm）を用いることができる。また、PIはplot（SP）UVレーザーで励起し、死細胞集団は、オフスケールは、サイドポピュレーションの右側に位置しています。これは、FITCやPEなどの他の蛍光色素からPI信号を補正する必要がなくなります。オリジナルのグッデルの方法は5-7後者手順を追った。 </li><li>分析中に、比較的低い圧力差を維持し、サイドポピュレーションのタイトな解像度を確保するためのソート。 </li><li> SPは、肺の細胞の主要な集団から離れてサイドアームとして表示されます。この人口は、ヘキストローと呼ばれます。 </li><li>ヘキスト低 / SPは、ヒストグラム2,3（Fを用いてCD45陽性および陰性集団を分離するために分析されigure 1）。 </li><li>ヘキスト低い CD45 NEG肺MSCの人口の選定およびゲーティングに続いて、細胞を96ウェルプレート3にクローンを単離するためにチューブまたは、単一の細胞にいずれかの混合集団としてソートすることで収集されることがあります。 </li><li>プレートは、ソートのストリームのたわみをソートするため、通常はチューブのソートに使用するよりも縦のソートのストリームを作成するために25％に調整されます。 </li><li>左上にテストストリームのパルスを送信し、96ウェルプレートのウェル右下でソートストリームを目指しています。 </li><li>各ウェルに希望のセル数を堆積させるソーターのソフトウェア板のマップを設定します。 </li><li>単一の細胞クローンを単離するために、単一の肺のMSCは培養培地の150μL（α- MEM 20％FBSを添加した）に96ウェルプレートのウェルにソートされます。ソート後培地の追加の100μlのが追加されます。 </li></ol> 5。肺MSCとクローンの単離、培養および特性評価<ol><li> Culturソートは、次の電子との混合肺のMSCの人口と、単一の細胞クローンの拡大は、標準的な培養条件を用いて同じです（37℃、5％CO 2および&gt; 95％湿度）。細胞は16時間以下の分離を付着させています。メディアは、（α- MEM 20％FBSを添加した）、48時間毎に置換されます。ときに細胞がより急速に増殖し、それらが継代されている75から80パーセントの合流点（図2）の間に到達し始める。 </li><li>細胞を温めておいたHBSSでリンスし、0.5％トリプシン/ EDTA（Cellgro、マナサス、バージニア州、猫＃25 - 053 - Cl）とインキュベートする37℃で2分未満のためのC。細胞は、細胞懸濁液の外観を確認するために反転範囲を使用して監視されます。 </li><li>肺MSCは、文化の現在の増殖速度に応じて1:2または1:3の比率で分割されます。 </li><li>伝統的な間葉系脂肪細胞や軟骨細胞、骨芽細胞の系統、と受け入れられる間葉系マーカーの彼らの細胞表面発現に分化するために肺のMSCの能力Isは、それぞれの細胞調製のために評価した。細胞遺伝学的バンド分析も総染色体異常2,3,8-11の不在を確認するために実行されます。 </li></ol> 6。コロニー形成アッセイを使用して肺のMSCの列挙（CFU - F） <ol><li> 1 × 10 6細胞/ mlの最終濃度に完全MesenCult媒体（幹細胞技術、バンクーバー、BC）で細胞を希釈する。 </li><li>メディア10mlの中の6 × 10 4細胞、3 × 10 4細胞、1.5 × 10 4細胞を、0.75 × 10 4細胞の100mmディッシュの最終濃度を達成するために段階希釈を行います。分析は、それぞれの細胞濃度のために重複したり、三連で行われており、小さな表面積に比例してスケールアップすることができる。 </li><li>標準的な条件下で10日間の培養細胞。日に10細胞をPBSで洗浄し、室温で5分間、100％メタノールを使用して固定されています。 </li><li> 0.4パーセントw / vのギムザ染色液で染色によりCFU - Fのコロニーを検出する（シグマケミカル株式会社、セントルイス、MO）脱イオン水で1:20に希釈。空気乾燥して試料を許可し、コロニー当たり25細胞（図3）よりも大きいを含むコロニーの数を定量化する。 </li></ol> 7。 T細胞の増殖とアポトーシスに対する肺のMSCの免疫調節特性の解析<ol><li>ウェルあたり6.25x10 4肺のMSCの細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩2を放置している。 </li><li> CD4 +卵白323〜339ペプチドを認識するT細胞とT細胞受容体（TCR）トランスジェニックマウス、OT - IIの脾臓から細胞、CD8を枯渇させることによって精製されている+、CD19 +、MHC - II +およびCD25 +細胞と国内でのみ有効AutoMACSセルソーター（ミルテニー、オーバーン、カリフォルニア州）。抗原提示細胞（APC）は、積極的にMHC - II +細胞12をソートすることによって分離されています。 </li><li> APCは、4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBS / 5％BSA/2mM EDTAで3回洗浄し、0.5μg/mlまたは5μg/ mでロードされますリットルOVA323ペプチド。 </li><li>シミュレートされた、APC逮捕成長を96ウェルプレートでの肺のMSCに追加されます。 </li><li> 95％以上の純粋なCD4 + 1 × 10 5細胞は5μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE、シグマ、セントルイス、MO）で標識されているPBSで、暗所で5分間インキュベートし、PBS - 5％BSAで洗浄し、その後に追加DMEM 5％FBS培地でAPCと肺のMSC細胞。その後、細胞を96時間インキュベートする。 </li><li> CD4（APC - Cy7）; CD8（ViolBlue）、T -細胞は、抗抗CD40（Cy5）で染色されるVbeta 5（PE）と国内でのみ有効MacsQuant 7チャンネルのフローサイトメーター（ミルテニー、Aurburn、CA）とを用いてアッセイFloJo解析ソフトウェア（Treestar、オレゴン州アッシュランド）。増殖は背景に比べて、T細胞はCFSEで標識し、APC（図4）にさらされていないCFSEの蛍光強度の平均の減少として測定されます。 T -細胞はトリパンブルー排除で評価この時間と生存率にカウントされます。 </li></ol> 8。代表的な結果： 図1フローサイトメトリー分析および肺のMSCの定義 。肺組織ダイジェストの単一の細胞懸濁液は、Hoechst 33342で染色し、違いを検出するフローサイトメトリーによって分析されています。前方散乱光（FSC）と側方散乱（SSC）とB。ヘキスト青色と赤色蛍光。サイドポピュレーション（SP）の存在は、ゲートに表示されます。ヘキスト低い SPは、次にCを分離するために分析されます。肺のMSCのCD45 陰性人口。肺SPの負の比率に正のCD45は、一般的に70:30 / 60:40です。 <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2肺MSCの単離と文化 。細胞選別により、肺のMSCのコレクションに続いて、細胞は、α- MEM supplemを使用して30ミリメートル皿にプレートされています20％FBSを取得済み。。新しくソートされた細胞は、小さな丸いと明るく表示されます。B。間葉系の表現型を有する約2〜3週間のコロニー後に明らかになると増殖がより明らかです。 <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。コロニー形成、線維芽細胞アッセイによるMSCの列挙。拡大肺MSCは、A.は、10日後。CFU - Fアッセイ用に記述されているプロトコルごとに播種し、ギムザ染色コロニーは明らかですしている。B.のコロニーが大きくなるとで構成される数百個の細胞。C.細胞が間葉系の表現型を表示します。 ＆B、スケールバー= 0.5センチメートル、Cのスケールバー= 0.14センチメートル。 <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。CFSEベースのT細胞増殖アッセイ 。肺のMSCとantigeの存在の有無にN提示細胞（APC）+ / -オボアルブミン（OVA）CD40 ポジティブエフェクターT細胞は、（赤い丸）の増殖を示すCFSEの強度の減少を示しています。 T -細胞膜のCFSEの蛍光強度はすべての細胞分裂の例で化学量論的に減少する。すべての分裂と。肺MSC、APC + /の存在下で- OVA、CD40 正のエフェクターT細胞の増殖（赤い円）が不足していることを示すCFSEの強度には有意な変化を示さない。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は当初、居住者の肺のMSCの特定の集団を単離するためにBM造血細胞を識別するために使用される手法を適応している。分離の再現性に起因するこれらの細胞は、その後もMSCとして特徴づけられた。その起源は、成体マウスの肺における居住者（のような派生BMとは対照的に）と2を文書化表現型と分子プロファイルとして定義されています。繰り返しこの特徴集団を単離する能力は、組織の恒常性と疾患の間に肺のMSCの生物学的重要性と役割のさらなる研究が可能になります。マウスとヒトの両方の肺組織のin vivoでのこの集団の最近の定義は、傷害と疾病の間に肺の修復を促進する内因性細胞の救出に向けられた治療戦略の開発を容易にします。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>リン酸緩衝食塩水（PBS） </td><td>シグマ</td><td> P - 5368 </td><td></td></tr><tr><td>ハンクスは、塩溶液（HBSS）をバッファ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0.2パーセントワーシントン2型コラゲナーゼ</td><td>ワージントンの生化学</td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td>赤血球の溶解バッファー</td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェンギブコ</td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td>ヘキスト33342色素</td><td>シグマ</td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45 - APC </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>シグマ</td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> - MEM </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0.5パーセントトリプシン/ EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25から053 - Clを</td><td></td
></tr><tr><td>完全なMesenCultミディアム</td><td>セル技術を幹</td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0.4パーセントw / vのギムザ染色液</td><td>シグマ</td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> 4％パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td> 15710 </td><td> 16％paraformeldehydeは、PBSを用いて、4％に希釈され</td
></tr><tr><td>カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE） </td><td>シグマ</td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

ヘキストの分離および特性評価低 cd45負マウス肺間葉系幹細胞

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

組織の居住者間葉系幹細胞（MSC）は、組織の修復や再生、線維症、炎症、血管新生と腫瘍形成の重要な調節因子である。これらの研究は、居住者の肺のMSCは、このような肺線維症（PF）と動脈性高血圧症（PAH）などの疾患時の肺組織の恒常性、損傷および修復の間に役割を果たすことを示唆して一緒になって。ここでは、居住者の肺のMSCの人口を定義するために技術を説明します。この人口の定義は、in vivoでのマーカーのセットを定義を使って肺組織では、フローサイトメトリーおよび特定の細胞型と機能の研究により、十分に特徴付けられた幹細胞集団の繰り返し分離を容易にします。

この記事では、マウスの常駐肺間葉系幹細胞（肺MSC）、それらの拡大、特性評価および免疫調節特性の分析の分離を示しています。

ヘキストの分離および特性評価低 CD45負マウス肺間葉系幹細胞

組織常駐性間葉系幹細胞（MSC）は、組織の修復または再生、線維化、炎症、血管新生、および腫瘍の重要な調節因子であり...

このビデオでは、ホストのCD45陰性肺間葉系幹細胞を単離するためのプロトコルを実演します。組織常在性間葉系幹細胞（MSC）は、組織の修復や再生、線維化、炎症、および血管新生において重要な調節因子です。まず、犠牲にしたマウスから肺を摘出します。肺組織を消化して単一細胞懸濁液を得ます。細胞をhoax dyeおよびCD 45で染色し、フローサイトメトリーにより分取して、ホスト由来のCD 45陰性肺MSCを取得します。その後、肺MSCを培養して増殖させ、コロニー形成アッセイを行い、MSCの分化能を評価します。その後、組織の恒常性維持および疾患におけるMSCの役割を調べるために、さらなる研究を行うことができます。本手法は、マウスまたはヒトの肺間葉系幹細胞の単離に使用でき、肺線維症、肺高血圧症、COPDなどの肺疾患の研究に適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、組織調製法の多様性に加え、フローサイトメーターのセットアップ、適切なコントロールの選定、および解析において困難を伴う可能性があります。肺組織を細切し、細胞の生存率を最適にするための適切な消化技法を言葉だけで説明することは困難であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。また、フローサイトメトリー装置のセットアップと解析についても、デモンストレーションを通じて伝えるのが最適です。まず、犠牲にした成マウスから、間葉系幹細胞の採取に使用する肺を取り出すことから本プロトコルを開始してください。小さめの鋭い鋏を用いて、マウスの肋骨を両側から横方向に切断します。胸腔を開き、横隔膜を除去します。20.5ゲージの針を装着した10 milliliterのシリンジを右心室に挿入し、プランジャーをゆっくりと押し下げて3～5 millilitersのPBSで灌流させ、肺から血液を洗い流します。次に、ハサミを使用して気管と主気管支を切り取り、廃棄します。続いて、ピンセットで小さく白い肺葉を摘出し、Hanks平衡塩類溶液（HBSS）を満たしたシャーレに入れます。次に、心臓を取り除き、肺葉を分離します。この工程を、研究に用いるすべてのマウスに対して繰り返します。分離した肺葉をディッシュの蓋に移します。組織が乾燥しないように、十分な量のHBSSで湿らせます。次に、使い捨てメスを使用して肺葉を細かく刻み、フローサイトメトリーの維持コントロールとして使用する骨髄を採取します。鋭い鋏を用いて、足首と大腿骨の上端を切断します。肢を新しいペトリ皿に移します。次に、膝の部分を切断し、大腿骨の直線的な一部と、脛骨および腓骨を含む別の部分に分けます。ピンセットを用いて筋肉を取り除き、脛骨、腓骨、および大腿骨を露出させます。次に、26.5ゲージの針を装着した5 mLシリンジを用意し、針を骨髄の開口部に挿入します。脛骨の一端を持ち、もう一端を15 mLのHBSSを満たした50 mLコニカルチューブに向け、プランジャーを押してHBSSを注入し、骨髄をチューブ内に洗い出します。腓骨と大腿骨についても同様の手順を繰り返します。補充剤添加高グルコースDMEMを用い、最終濃度5 µg/mLのhost 3 3 3 4 2 dyeで骨髄を染色します。次に、単離した肺組織から単一細胞懸濁液を作製します。各肺を、あらかじめ温めた0.2% Worthingtonを含むチューブに入れます。滅菌済みのHBSSでType two collagenaseを調製し、チューブを37°Cのウォーターバスに浸して30分間インキュベートします。インキュベーション後、10 mLピペットを用いて、消化物がピペット内をスムーズに流れるようになるまでサンプルをトリチュレーションします。これを約10回繰り返し、組織の消化を完了させるため、37°Cでさらに15分間インキュベートします。消化が完了したら、細胞懸濁液をHBSSで希釈し、5 mLピペットを用いて、残っている組織片を分散させるために再度トリトン処理（または撹拌）を行います。次に、未消化の組織片を除去するため、懸濁液を70 µmのセルストレーナーを通して50 mLコニカルチューブに回収します。サンプルがセルストレーナーを通過するように、懸濁液を少しずつ加えてください。未消化の組織片によって細胞懸濁液の流れが完全に遮断された場合は、新しいセルストレーナーを用いて新しいチューブにろ過してください。その後、細胞懸濁液を450 RCFで10分間遠心し、ペレット化します。遠心後、上清を除去し、室温の赤血球溶血バッファーで細胞ペレットを穏やかに再懸濁させ、室温で5分間インキュベートします。その後、等量のHBSSを加えて溶血バッファーを不活性化します。細胞懸濁液を40 µmのセルストレーナーに注ぎ、デブリや細胞凝集塊を除去し、ろ液を新しい50 mLコニカルチューブに回収します。次に、血球計数器を用いて、肺および骨髄の両サンプルの細胞数を算出します。細胞懸濁液の濃度と総量を記録してください。次に、単一肺細胞懸濁液を450 RCFで10分間遠心分離してペレット化します。細胞を維持するため、肺細胞と骨髄細胞の両方を、あらかじめ温めておいたサプリメント添加高グルコースDMEMで一度に10^6 cells/mLの濃度で再懸濁します。DNAを染色するために、HOAXED 3 3 3 4 2 染料を最終濃度 5 µg/L になるように加えます。次に、細胞を緩やかに転倒混和し、37 °C のウォーターバスで正確に 90 分間インキュベートします。その後、4 °C で 450 ×g により 10 分間遠心分離します。フローサイトメトリー分析の準備として、肺および骨髄組織を抗CD 45およびプロピジウムヨードで染色します。細胞の染色後、フローサイトメトリー分析を行うまで、チューブを遮光して氷上に保存してください。機器のレーザーアライメントを確認し、セルソーティングの設定を行うことで、フローサイトメトリーの準備を整えます。使用する装置は、488 nmの青色レーザー、635 nmの赤色レーザー、および350〜355 nmのUVレーザーを備えている必要があります。また、UVレーザー経路には2つの検出器があり、青色用には45/65フィルター、赤色用には675/50フィルターが装着されていなければなりません。さらに、UV赤色検出器は赤色信号に対して高感度である必要があり、サンプルを10 °Cに維持するためのチラーユニットが装置に備わっている必要があります。装置のソフトウェアでは、線形前方散乱（forward scatter）対側方散乱（side scatter）を表示するヒストグラムプロットと、その装置に適したダブレット識別プロットを設定してください。対数シグナルを用いたPIのヒストグラムプロット、線形シグナルを用いた赤色対青色の相関図、および対数シグナルを用いたCD 45 A PCのヒストグラムプロットです。装置の準備が整ったら、染色済みの骨髄サンプルを装置のローディングポートに設置します。このサンプルは、染色および装置セットアップのコントロールとして使用されます。イベントの収集を開始し、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）の線形信号を調整します。細胞集団を明確に視覚化するためには、前方散乱光をx軸としたプロットにおいて、細胞がおおよそ中央下に位置するように設定してください。核染料であるPIは細胞膜を透過しないため、生存細胞からは排除されます。PIヒストグラムにおいて、PI陽性の死細胞にゲートを設定します。機器のソフトウェアを用いて、このゲート内の死細胞を赤色に色付けするように設定してください。死細胞を色分けして表示し、それをナビゲーターとして利用することで、宿主のG0/G1集団を特定するのに役立ちます。PI染色はUVレーザーによっても励起されるため、死細胞の大部分はスケール外に表示されるはずです。赤色対青色の蛍光プロットの右側において、骨髄のG0/G1集団は、イベントが密集したクラスターとして確認できるはずです。検出器の電圧を調整し、プロットの中央右上方にG0/G1クラスターが位置するようにします。細胞周期のS期の大部分およびG2期全体がスケール外になる場合があります。赤色対青色のHoechstプロットの右上では、サイドポピュレーション（SP）が、G0/G1クラスターの左側からプロットの左下隅に向かって伸びているのが確認できます。次に、FSC対SSCのプロットにおいて細胞クラスターを囲むゲートを作成します。ダブレットプロットで特定したシングレット集団と、PIヒストグラムにおける生存細胞をプロットします。その後、これらのゲートされた集団のみが表示されるようにhoaxプロットを割り当ててください。ホストプロットをゲーティングした後、サイドポピュレーションの周囲に領域を描画します。この領域を、ライトスキャッターのシングルレットおよび生細胞ゲートとともに、CD 45 A PCヒストグラムのゲートとして割り当てます。システムのセットアップが完了したら、ローディングポートからサンプルを取り出し、肺サンプルをローディングポートに配置します。このサンプルについて、装置の設定を再度調整する必要はありません。赤色対青色の擬似プロット（hoax plot）でイベントの収集を開始します。肺サンプルのG zero G oneクラスターは、通常、x軸方向に長く伸び、キーボードのチルダ記号（~）に似た形状になります。サイドポピュレーション（SP）ゲートの下限は、骨髄サンプルの設定と同様の位置にする必要があります。SPの高解像度な分離を確実にするため、上下にわずかな調整が必要になる場合があります。ソーティング中は、サンプルフローバルブを開けすぎないようにし、圧力差を低く維持してください。MSCを単離するために、ソートチャンバーに96ウェル回収プレートを設置し、CD 45 A PCヒストグラム上でソートゲートを設定して、陽性集団と陰性集団を分離します。最後に、混合集団としてチューブに回収するか、クローンを単離するために96ウェルプレートにシングルセルとして回収します。セルソーティングによる肺MSCの回収後、細胞を20% FBSを添加したA MEMを用いて30 mmディッシュに播種します。まず、ソートされた細胞は約2〜3週間後に小さく、丸く、明るい外観となります。間葉系表現型を持つコロニーが顕在化し、各細胞調製物において増殖がより明確になります。肺由来MSCが、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞という伝統的な間葉系系譜に分化する能力、および公認の間葉系マーカーの細胞表面発現を評価します。細胞遺伝学的バンディング解析を行い、粗大な染色体異常がないことを確認します。フローサイトメトリーによる分離およびシングルセルクローンの調製後、MSC細胞の特性および分化能を評価するためにコロニー形成アッセイを行います。まず、細胞を1 mLあたり3×10⁴個に希釈します。100 mmディッシュ内の不完全CUL培地を用い、1枚あたり2×10⁴、6×10⁴、3×10⁴、1.5×10⁴、0.75×10⁴個の細胞となるよう、10 mLの培地で3連（triplicate）の段階希釈を行います。その後、10日間の培養後にプレートをインキュベーターから取り出し、培地を捨てて細胞をPBSで洗浄します。次に、室温で100%methanolを5分間加えて固定します。5分後、methanolを捨てます。次にコロニー形成を検出するため、イオン水で20倍に希釈した0.4% (w/v) gzaを添加し、10〜15分間インキュベートします。その後、染色液を捨て、イオン水で洗浄します。サンプルを風乾させ、倒立顕微鏡または可視化装置を用いて、1コロニーあたり25細胞以上を含むコロニー数を定量します。コロニーはここに示すように大きく、数百個の細胞で構成されており、間葉系表現型を示しています。MSCは本ビデオに示した方法で単離し、96ウェルプレートに播種して増殖させました。その後、停止させたCFSE標識抗原提示細胞を肺MSCに添加しました。次に、単離したMSCの増殖能を、背景（この図に示されるCFSE標識T細胞のみの状態）と比較したCFSEの平均蛍光強度の減少として測定しました。肺SCが存在せず、抗原提示細胞が存在する条件下（APC ± OVA CD40陽性エフェクターT細胞）では、CFSE強度の低下が見られ、これは増殖を示しています（赤丸で囲まれた部分）。T細胞膜のCFSE蛍光強度は、細胞分裂のたびに幾何級数的に減少します（すなわち、分裂ごとに半分になります）。一方、肺MSCが存在する条件下（MSC + APC ± OVA CD40陽性エフェクターT細胞）では、CFSE強度に有意な変化が見られず、これは増殖が抑制されたことを示しています。この手法により、肺幹細胞生物学分野の研究者が、肺動脈性肺高血圧症や肺線維症などの肺疾患における間葉系幹細胞の役割を探索する道が開かれました。この手法を習得すれば、本手順に従って約5時間で完了できます。想定される肺間葉系幹細胞が、骨、脂肪、軟骨への分化能を含む適切な多系統分化能を示すかどうかなど、さらなる疑問を解消するために、分化アッセイなどの他の手法を実施することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

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学ぶマウス肺間葉系幹細胞の分離法。フローサイトメトリーでHoechst低CD45陰性細胞を選別し、コロニー形成アッセイで分化能を評価します。肺疾患研究への応用が期待されます。

ヘキストの分離および特性評価^低 CD45^負マウス肺間葉系幹細胞

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