ヘキストの分離および特性評価^低 CD45^負マウス肺間葉系幹細胞

このビデオは、宿主の低CD 45陰性肺間葉系幹細胞の単離のためのプロトコルを示しています。組織共鳴間葉系幹細胞(MSC)は、組織の修復または再生、線維化、炎症、血管新生の重要な調節因子です。まず、犠牲にされたマウスから肺を解剖します。

肺組織を消化して、単一細胞懸濁液を得る。細胞をデマダイとCD 45で染色し、フローサイトメトリーで選別して、宿主の低CD45陰性肺MSCを取得します。次に、肺MSCを培養中で拡大し、MSC分化能力を評価するためにコロニー形成アッセイを実施します。

その後、組織の恒常性および疾患におけるMSCの役割を調べるために、さらなる研究を実施することができます。ここで示す方法は、マウスまたはヒトの肺間葉系幹細胞を単離するために使用でき、肺線維症、肺高血圧症、COPDなどの肺疾患のこの研究に適用できます。一般的に、この方法に不慣れな方は、組織調製に利用できるさまざまな方法や、フローサイトメーターのセットアップ、適切なコントロール、分析のために苦労するでしょう。

この方法を視覚的に示せることは、細胞の最適な生存率を得るために肺組織を細かく刻んで消化するための適切な技術を説明することが難しいため、非常に重要です。また、フローサイトメトリー装置のセットアップと解析は、デモンストレーションを通じて最もよく伝えられます。このプロトコルは、犠牲にされた成体マウスから間葉系幹細胞を採取するために使用される肺を切除することから始めます。

鋭利な小さなハサミを使用して、マウスの両側で胸郭を横方向に切ります。胸腔を開き、横隔膜を取り外します。20.5ゲージの針が付いた10ミリリットルの注射器を右心室に挿入し、プランジャーを静かに押し下げて3〜5ミリリットルのPBSを灌流し、肺から血液を洗い流します。

次に、ハサミを使って気管と大きな気管支を切り取り、捨てます。次に鉗子を使用します。小さな白い肺葉を拾い上げ、ハンクの緩衝生理食塩水またはHBSSで満たされたペトリ皿に入れます。

次に、心臓を切除し、肺葉を分離します。研究に参加したすべてのマウスについて、このプロセスを繰り返します。肺葉を皿の蓋に移します。

組織が乾燥するのを防ぐのに十分な量のHBSSで組織を湿らせます。次に、使い捨てメスを使用して肺たぶをミンチにして骨髄を採取し、フローサイトメトリーの維持制御を使用します。鋭利なハサミを使って、足首と大腿骨の上部を切ります。

手足を新しいシャーレに入れます。次に、膝を切り取り、大腿骨の直線部分と、脛骨と腓骨を含む2番目の部分を残します。鉗子を使用して、筋肉を引き抜いて脛骨、腓骨、大腿骨を露出させます。

次に、26.5ゲージの針が付いた5ミリリットルの注射器を取り、針を骨髄の開口部に挿入します。脛骨の一方の端で、もう一方の端を15ミリリットルのHBSSで満たされた50ミリリットルの円錐形チューブに向け、プランジャーを押してHBSSを分配し、骨髄をチューブに洗い流すようにして骨を保持します。このプロセスを腓骨と大腿骨で繰り返します。

ホスト3 3 3 4 2ダイで骨髄を、サプリメントを添加した高グルコースDMEMで最終濃度5マイクログラム/ミリリットルで染色します。次に、単離された組織から肺組織の単一細胞懸濁液が生成されます。prewarm.0.2%Worthingtonを含むチューブに各肺を入れます。.

タイプ2コラゲナーゼ 滅菌HBSSで調製し、チューブを摂氏37度の水浴に浸し、30分間インキュベートします。インキュベーション後、10 mmリットルのピペットを使用して、消化物がピペットを容易に流れるまでサンプルを三分割します。約10回の繰り返しで、さらに摂氏37度で15分間インキュベートし、組織消化を完了させます。

消化が完了したら、細胞懸濁液をHBSSで希釈し、5ミリリットルのピペットを使用して再度トライし、残留組織片を分散させます。次に、未消化の組織片を除去するために、懸濁液を70マイクロモルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に注ぎます。一度に少しずつ懸濁液を添加して、サンプルがセルストレーナーを流れるようにします。

未消化の組織片が細胞懸濁液の流れを完全に遮断する場合。新しいセルストレーナーを通して新しいチューブに注ぎます。細胞懸濁液を450 RCFで10分間ペレット

スピンデカントに続いて上清を調製し、細胞ペレットを室温で穏やかに再懸濁します。赤血球溶解バッファーを室温で5分間インキュベートします。次に、等量のHBSSを添加して、溶解バッファーを不活性化します。

細胞懸濁液を40マイクロモルの細胞ストレーナーに注ぎ、破片や細胞凝集体を取り除き、流れを新しい50ミリリットルの円錐管に集めます。次に、ヘモサイトメーターを使用して、肺サンプルと骨髄サンプルの両方の細胞数を決定します。細胞懸濁液の濃度と総量を記録します。

次に、450 RCFで10分間遠心分離することにより、単一肺細胞懸濁液をペレット化します。細胞を維持するために、肺細胞と骨髄細胞の両方を一度に再懸濁します。1ミリリットルあたり10〜6細胞をプレウォームで補充した高グルコースDMEM。

DNAを染色するために、HOAXED 3 3 3 4 2色素を最終濃度5マイクログラム/リットルまで添加します。次に、穏やかに反転させて細胞を混合し、摂氏37度の水浴で正確に90分間インキュベートします。その後、スピン後、摂氏4度で450Gで10分間遠心分離します。

抗CD45およびヨウ化プロピジウムによる肺および骨髄組織の染色を進め、フローサイトメトリーによる分析の準備をします。細胞を染色したら、フローサイトメトリー分析が行われるまで、チューブを光から保護した氷上に保管します。フローサイトメトリーの準備として、装置のレーザーの位置が整列し、細胞ソーティング用にセットアップされていることを確認します。

使用する機器は、青色488ナノメートル、赤色635ナノメートル、UV 350〜355ナノメートルのレーザーを搭載し、UVレーザー経路上に青色45以上の65フィルターと赤色6、75以上の50フィルターを備えた2つの検出器を装備する必要があります。さらに、UV赤色検出器は赤色信号に対して高い感度を持つ必要があり、装置にはサンプルを摂氏10度に維持するためのチラーユニットが装備されている必要があります。装置ソフトウェアでは、線形前方散乱光と側方散乱光、装置に適したダブレット識別プロットを表示するようにヒストグラムプロットを設定します。

対数信号を使用したPIのヒストグラムプロット、線形信号を使用した赤と青の海岸線、および対数信号を使用したCD 45 A PCのヒストグラムプロット。装置の準備ができたら、染色した骨髄サンプルを装置のローディングポートに入れます。このサンプルは、染色および装置のセットアップコントロールとして使用されます。

イベントの収集を開始し、前方散乱線形信号の内側を調整します。細胞集団を明確に視覚化するには、細胞はプロットの前方散乱の中心下付近にx軸として存在する必要があります。核染色PIは膜IMP透過性であるため、生細胞からは除外されます。

PI ヒストグラムの PI 陽性死細胞に歩行領域を描画します。装置ソフトウェアに死細胞の色を付けるように指示します。このゲートでは赤。

色で排出された死細胞をナビゲーターとして使用して、宿主G、ゼロG、1の母集団を特定すると便利です。PI染色はUVレーザーによっても励起され、死細胞の大部分はスケールから外れている必要があります。赤対青のデマ蛍光プロットの右側では、骨髄のGゼロG1集団は、赤対青のデマプロットのイベントの密集したクラスターと見なす必要があります。

検出器の電圧を調整して、プロットの中央の右上に G ゼロ G 1 クラスターを配置します。S期の一部および細胞周期のG2全体は、スケールから外れている可能性があります。赤と青のデマプロットの右上には、GゼロGクラスターの左側からプロットの左下隅まで、低位の母集団ホストが並んでいます。

次に、FSC と SSC のセル クラスターの周囲にゲートを描画します。ダブレットプロットで同定された一重項母集団とPIヒストグラムの生細胞をプロットします。次に、これらのゲートされた母集団のみを表示するようにデマプロットを割り当てます。

ホストプロットをゲート化した後、サイドポピュレーションの周囲に領域を描画します。この領域を CD 45 A PC ヒストグラムのゲートとして、光散乱一重項ゲートと生細胞ゲートと共に割り当てます。システムがセットアップされたので、ローディングポートからサンプルを取り出し、肺サンプルをローディングポートに置きます。

このサンプルでは、装置の設定を再度調整する必要はありません。赤と青のデマプロットでイベントの収集を開始します。肺サンプルのGゼロG1クラスターは、通常、x軸方向に細長く表示され、キーボードのチルダ記号に似ています。

サイドポピュレーションの歩行デマは、骨髄サンプルに設定された位置と同様の位置にある必要があります。これらのわずかな上下の調整は、サイド母集団の厳密な解像度を確保するために必要になる場合があります。選別中は、サンプルフローバルブが開きすぎないようにすることで、圧力差を低く保

次に、MSCを分離するために、96ウェルコレクションプレートをソートチャンバーに置き、CD 45 A PCヒストグラムにソートゲートを設定して、正の母集団と陰性の集団を分離します。最後に、細胞を混合集団としてチューブに集めるか、または単一細胞としてクローンを96ウェルプレートに単離し、細胞選別による肺MSCの収集に続いて、細胞を20%FBSを補充したMEMを使用して30ミリメートル皿に播種します。まず、選別された細胞は、約2〜3週間後に小さく、丸く、明るく見えます。

間葉系表現型のコロニーが明らかになり、各細胞調製物で増殖がより明らかになります。肺 MSC が骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞の従来の間葉系系に分化する能力と、受け入れられた間葉系マーカーのそれらの細胞表面発現を評価します。細胞遺伝学的バンニング解析を行い、肉眼的染色体異常がないことを確認します。

フローサイトメトリーによる単離および単一細胞クローンの作製に続いて、MSC細胞および分化能を特徴付けるためにコロニー形成アッセイを実施します。まず、細胞を1ミリリットルあたり4個の細胞のうち10の3倍に希釈した状態から始めます。100ミリ皿に不完全培養培地を、1皿あたり10ミリリットルの培地で2倍、6倍10個、4個のうち3倍、10個分の10を1.5倍に4個、10個皿に10倍を3倍に

次に、10日間の培養後にプレートをインキュベーターに入れ、培地を注ぎ、細胞をPBSですすいでください。次に、室温で5分間100%メタノールを加えて固定します。5分後、メタノールを注ぎます。

次に、コロニー形成を検出するために、イオン化水で1〜20に希釈した重量で0.4%の重量gzaを添加し、イオン化水を10〜15分間インキュベートします。次に、汚れを注ぎ落とし、イオン化された水ですすいでください。サンプルを自然乾燥させ、倒立顕微鏡または可視化を使用して、コロニーあたり25個を超える細胞を含むコロニーの数を定量

コロニーは大きく、ここに示すように数百の細胞で構成され、間葉系の表現型を示します。このビデオに示すようにMSCを単離し、成長をシミュレートした96ウェルプレートに播種しました。次に、停止したCFSE標識抗原提示細胞を肺MSCに添加しました。

次いで、単離されたMSCの増殖は、この図に示すようにT細胞のみでCFSEと標識したバックグラウンドと比較したCFSEの平均蛍光強度の減少として測定され、肺SCの非存在下および抗原提示細胞の存在下では、PCプラスマイナスOアルブミンCD40陽性の有効T細胞は、CFSE強度の低下を示し、 これは、赤丸で囲まれた増殖を示しています。T細胞膜のCFSE蛍光強度は、肺M-S-C-A-P-CプラスマイナスOVA CD 40陽性の影響を受けたT細胞の存在下で、細胞分裂ごとにすなわち半分ずつ、計量経済学的に減少し、CFSE強度に有意な変化は示さず、これは増殖の欠如を示している。この技術は、肺幹細胞生物学の分野の研究者が、肺動脈性肺高血圧症や肺線維症などの肺疾患における間葉系幹細胞の役割を探求する道を開きました。

一度習得すると、この手順に続いて約5時間でこのテクニックを行うことができます。推定される肺間葉系幹細胞が適切な多系統分化を示すかどうか、骨脂肪および軟骨に対する可能性など、追加の疑問に答えるために、分化アッセイのような他の方法を実施することができる。