M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション
December 17th, 2011
パイエル板を覆う特殊な濾胞関連上皮におけるM細胞は腸管関連リンパ系組織における粘膜免疫監視に重要な役割を果たす。ここでは、M細胞による細菌のトランスサイトーシスのために評価方法を説明 in vivoで。このメソッドは、免疫系におけるM細胞の機能を理解する方法を提供する。
この手順の全体的な目標は、腸粘膜免疫系内にあるM細胞による細菌の取り込みを調べることです。この手順の最初のステップは、麻酔をかけたマウスの腸の薪パッチを露出させて結紮することです。次に、蛍光細菌をライゲーション領域に注入します。
1時間後、火葬場が切除されます。次に、組織内の細胞を浸透させ、M細胞マーカーであるGP 2について染色します。最後に、サンプルを共焦点顕微鏡で観察し、M細胞によるトランスサイトーシス中の細菌を可視化することができます。
m細胞による細菌トランスサイトーシスの分子基盤への洞察を提供することに加えて、却下を他のシステムに適用することができます。例えば、このプロトコルは、細胞透過性を補助するために使用でき、クロルおよび微生物を使用してフレーム化された腸で滅菌ガラススプレッダーを使用してLBオーガープレート上の蛍光細菌をストリークし、単一のコロニーが見えるまでプレートを摂氏37度でインキュベートします。固体オーガーから1つのコロニーを選び、2ミリリットルの新鮮なLB培地に接種します。
次に、シェイカーでバクテリアを摂氏37度で一晩培養します。スターター培養物が増殖したら、500マイクロリットルの細菌を4.5ミリリットルのLB培地に移し、この新しい培養物を摂氏37度で3〜4時間、または600ナノメートルの光学密度が細菌の増殖が対数期にあることを示す1に達するまでインキュベートします。この時点で、培養物をGの3000倍で摂氏4度で5分間遠心分離し、遠心分離後の細菌を回収し、スナットを廃棄してペレットを5ミリリットルの滅菌PBSで洗浄した後、5ミリリットルのPBSで細菌を懸濁します。
マウスを連続的なアイソフッ素麻酔下に置いた後、滅菌ツールを使用してマウスの腹部を無菌的に開きます。まず、小腸を露出させ、PIのパッチを見つけます。PIのパッチが見つかったら、滅菌ミシン糸を使用して、パッチの片側に約5ミリメートルの腸を結紮します。
施術中に血管が切断されないように注意してください。腸が結紮されたら、注射器を使用して、腸の緩い側の結紮されたパイアパッチループに、約10〜7CFUの50マイクロリットルの細菌懸濁液を注入します。次に、糸を使用して腸の反対側を結紮します。
マウスの腹部をクリップで閉じ、マウスを1時間麻酔下に置いてから安楽死させます。パイアパッチを収穫するには、パイアパッチを慎重に切除します。次に、採取した腸の部分を通してPBSを数回激しく洗い流して、PIのパッチの頂端側を洗い、余分な粘膜液と細菌を取り除きます。
PIのパッチを洗浄したら、24ウェルプレートのウェルに入れ、細胞効果または細胞パーマ液を添加します。サンプルを氷上で1時間インキュベートします。P'Sパッチが固定されたら、1ミリリットルのパーマウォッシュバッファーに5分間浸します。
この洗浄手順を3回繰り返します。次に、サンプルを1ミリリットルのブロッキングバッファーに入れ、氷上で30分間インキュベートします。ブロッキングステップに続いて、抗マウスGP 2モノクローナル抗体を最終濃度5マイクログラム/ミリリットルまで添加し、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートしてM細胞を染色します。
次に、前回と同様にサンプルを洗浄します。標識抗体用の二次床を追加し、サンプルを氷上で暗所で2時間インキュベートします。サンプルが染色されたら、サンプルをPBSでやさしく洗浄します。
次に、スライド上に円形のカバーガラスを3〜4枚置き、PBSの30%グリセロール溶液の200マイクロリットルにpiresパッチを埋め込みます。スライド上で、DM IRE 2共焦点レーザー顕微鏡またはDelta視力修復デコンボリューション顕微鏡を使用してサンプルを観察します。この画像では、緑色のGFP標識であるサルモネラチフス菌が、頂端の原形質膜上に赤で示されたGP2に囲まれていることがわかります。
この回転した画像では、頂端下の細胞質小胞内に細菌が見えます。このビデオを見れば、ライゲーションされたpys intestinal Lu asayを使用してM細胞による細菌トランスサイトーシスを評価する方法についてよく理解できるはずです。
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概要
この研究は、腸粘膜免疫系におけるM細胞、特に細菌トランスサイトーシスにおけるそれらの役割に焦点を当てています。記述された方法は、生体内でのM細胞機能の評価を可能にし、粘膜免疫監視の理解に貢献します。
主要な研究要素
科学の分野
- 免疫学
- 微生物学
- 神経科学
背景
- M細胞はペーイェル斑の専門化された上皮細胞です。
- それらは腸の免疫応答において重要な役割を果たします。
- その機能を理解することで、腸の健康と疾患に関する洞察が得られます。
- 細菌トランスサイトーシスは免疫監視の重要なプロセスです。
研究の目的
- 生体内でのM細胞による細菌の取り込みを評価すること。
- M細胞機能の研究方法を開発すること。
- 粘膜免疫監視メカニズムの理解を深めること。
使用された方法
- 麻酔したマウスの腸ペーイェル斑を結紮すること。
- 結紮した領域に蛍光細菌を注入すること。
- 1時間後にペーイェル斑を切除すること。
- 組織サンプルをM細胞マーカーGP2で染色し、コンフォカル顕微鏡で観察すること。
主な結果
- M細胞による細菌トランスサイトーシスの成功的な可視化。
- 評価方法の実現可能性の証明。
- M細胞の免疫機能に関する洞察の提供。
- 腸関連リンパ組織の理解への貢献。
結論
- この方法により、M細胞機能の詳細な研究が可能になります。
- M細胞の理解は腸の健康戦略に情報を提供します。
- さらなる研究により、免疫療法への影響を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of bacterial transcytosis by M cells in Peyer’s patches addresses a critical gap in understanding mucosal immune surveillance and host-microbe interactions. This assay enables mechanistic de-risking of antigen uptake pathways, supporting predictive confidence in early immunology and microbiome-targeted discovery. The method’s ability to distinguish bacterial species transcytosed by M cells informs target validation and portfolio triage for mucosal immunomodulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of M cell-mediated antigen uptake mechanisms in a physiologically relevant system.
- Supports functional target validation for molecules modulating mucosal immune responses.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the role of Gp2 and bacterial ligands in transcytosis.
- Provides predictive confidence for advancing immunomodulatory or microbiome-based candidates.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated ex vivo platform for quantifying bacterial uptake by M cells using fluorescence and confocal microscopy.
- Enables reproducible measurement of transcytosis events across bacterial strains and experimental conditions.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators affecting M cell function or permeability.
- Facilitates reliable evaluation of candidate compounds targeting mucosal immune pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying host-microbe interactions in the gut mucosa.
- Provides translational continuity from discovery to preclinical validation of mucosal immune targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions for immunotherapeutic and vaccine candidates targeting gut immunity.
- Supports identification of translational biomarkers linked to M cell-mediated antigen uptake.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing of antigen uptake, supporting lead identification, and informing preclinical validation of mucosal immune modulators.
- Discovery Biology: Quantifies M cell-mediated transcytosis to clarify antigen uptake pathways and de-risk biological mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for comparing bacterial uptake across strains and interventions.
- Analytics: Delivers confocal imaging and fluorescence-based measurements to support statistical comparison of experimental groups.
- Translational Research: Bridges early discovery findings to preclinical models of gut immunity and host-microbe interaction.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse bacterial species and candidate modulators in mucosal immunology workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mucosal immune target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes bacterial uptake quantification and supports reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for immunomodulatory and microbiome-targeted programs, enhancing capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates targeting gut immune pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques and confocal microscopy.
- Demands access to fluorescence labeling reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and staining protocols.
- Adaptation may be needed for different bacterial species or model systems.
- Throughput is limited by surgical and imaging workflow constraints.
