M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

パイエル板を覆う特殊な濾胞関連上皮におけるM細胞は腸管関連リンパ系組織における粘膜免疫監視に重要な役割を果たす。ここでは、M細胞による細菌のトランスサイトーシスのために評価方法を説明

この手順の全体的な目標は、腸粘膜免疫系内にあるM細胞による細菌の取り込みを調べることです。この手順の最初のステップは、麻酔をかけたマウスの腸の薪パッチを露出させて結紮することです。次に、蛍光細菌をライゲーション領域に注入します。

1時間後、火葬場が切除されます。次に、組織内の細胞を浸透させ、M細胞マーカーであるGP 2について染色します。最後に、サンプルを共焦点顕微鏡で観察し、M細胞によるトランスサイトーシス中の細菌を可視化することができます。

m細胞による細菌トランスサイトーシスの分子基盤への洞察を提供することに加えて、却下を他のシステムに適用することができます。例えば、このプロトコルは、細胞透過性を補助するために使用でき、クロルおよび微生物を使用してフレーム化された腸で滅菌ガラススプレッダーを使用してLBオーガープレート上の蛍光細菌をストリークし、単一のコロニーが見えるまでプレートを摂氏37度でインキュベートします。固体オーガーから1つのコロニーを選び、2ミリリットルの新鮮なLB培地に接種します。

次に、シェイカーでバクテリアを摂氏37度で一晩培養します。スターター培養物が増殖したら、500マイクロリットルの細菌を4.5ミリリットルのLB培地に移し、この新しい培養物を摂氏37度で3〜4時間、または600ナノメートルの光学密度が細菌の増殖が対数期にあることを示す1に達するまでインキュベートします。この時点で、培養物をGの3000倍で摂氏4度で5分間遠心分離し、遠心分離後の細菌を回収し、スナットを廃棄してペレットを5ミリリットルの滅菌PBSで洗浄した後、5ミリリットルのPBSで細菌を懸濁します。

マウスを連続的なアイソフッ素麻酔下に置いた後、滅菌ツールを使用してマウスの腹部を無菌的に開きます。まず、小腸を露出させ、PIのパッチを見つけます。PIのパッチが見つかったら、滅菌ミシン糸を使用して、パッチの片側に約5ミリメートルの腸を結紮します。

施術中に血管が切断されないように注意してください。腸が結紮されたら、注射器を使用して、腸の緩い側の結紮されたパイアパッチループに、約10〜7CFUの50マイクロリットルの細菌懸濁液を注入します。次に、糸を使用して腸の反対側を結紮します。

マウスの腹部をクリップで閉じ、マウスを1時間麻酔下に置いてから安楽死させます。パイアパッチを収穫するには、パイアパッチを慎重に切除します。次に、採取した腸の部分を通してPBSを数回激しく洗い流して、PIのパッチの頂端側を洗い、余分な粘膜液と細菌を取り除きます。

PIのパッチを洗浄したら、24ウェルプレートのウェルに入れ、細胞効果または細胞パーマ液を添加します。サンプルを氷上で1時間インキュベートします。P'Sパッチが固定されたら、1ミリリットルのパーマウォッシュバッファーに5分間浸します。

この洗浄手順を3回繰り返します。次に、サンプルを1ミリリットルのブロッキングバッファーに入れ、氷上で30分間インキュベートします。ブロッキングステップに続いて、抗マウスGP 2モノクローナル抗体を最終濃度5マイクログラム/ミリリットルまで添加し、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートしてM細胞を染色します。

次に、前回と同様にサンプルを洗浄します。標識抗体用の二次床を追加し、サンプルを氷上で暗所で2時間インキュベートします。サンプルが染色されたら、サンプルをPBSでやさしく洗浄します。

次に、スライド上に円形のカバーガラスを3〜4枚置き、PBSの30%グリセロール溶液の200マイクロリットルにpiresパッチを埋め込みます。スライド上で、DM IRE 2共焦点レーザー顕微鏡またはDelta視力修復デコンボリューション顕微鏡を使用してサンプルを観察します。この画像では、緑色のGFP標識であるサルモネラチフス菌が、頂端の原形質膜上に赤で示されたGP2に囲まれていることがわかります。

この回転した画像では、頂端下の細胞質小胞内に細菌が見えます。このビデオを見れば、ライゲーションされたpys intestinal Lu asayを使用してM細胞による細菌トランスサイトーシスを評価する方法についてよく理解できるはずです。