M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

本手順の全体的な目的は、腸管粘膜免疫系に位置するM細胞による細菌の取り込みを調べることです。本手順の最初のステップは、麻酔をかけたマウスの腸管パイエル板を露出させ、結紮することです。その後、結紮領域に蛍光標識細菌を注入します。

1時間後、パイレスパッチを切り出します。次に、組織内の細胞を透過処理し、M細胞マーカーであるGP2を染色します。最後に、共焦点顕微鏡を用いてサンプルを観察し、M細胞によってトランスサイトーシスされる細菌を可視化できます。

M細胞による細菌のトランスサイトーシスという分子基盤への知見を提供することに加え、本手法は他の系にも適用可能です。例えば、本プロトコルは、クロミドおよび微生物を用いて、炎症性腸管における細胞透過性を評価する際に活用できます。滅菌済みのガラス spreader を用いて、蛍光細菌をLBアガープレートにストリークし、単一コロニーが観察されるまで37 °Cでインキュベートします。固形アガーから単一コロニーをピックアップし、2 mLの新鮮なLB培地に接種します。

次に、細菌をシェーカーを用いて37 °Cで一晩培養します。スターター培養液が成長したら、500 µLの細菌を4.5 mLのLB培地に転移し、この新しい培養液を37 °Cで3〜4時間、または600 nmにおける光学密度が1に達し、細菌の増殖が対数期に入ったことが確認できるまでインキュベートします。この時点で、培養液を4 °Cで3000 ×g、5分間遠心分離して細菌を回収します。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを5 mLの滅菌PBSで洗浄します。洗浄工程を繰り返した後、細菌を5 mLのPBSに再懸濁します。

マウスをイソフルランで持続麻酔し、滅菌器具を用いて腹部を無菌的に切開します。まず小腸を露出させ、パイエールのパッチ（PI's patches）を確認します。パッチが見つかったら、滅菌済みの縫い糸を用いて、パッチから約5 mm離れた部位で腸管を結紮します。

処置中に血管を損傷しないよう注意してください。腸管を結紮した後、シリンジを用いて、10⁷ CFUの細菌懸濁液50 µLを、腸管の緩い側にある結紮された回腸パッチループ内に注入します。その後、糸を用いて腸管の反対側を結紮します。

マウスの腹部をクリップで閉じ、安楽死させるまで1時間、麻酔状態を維持します。パイエル板を採取するため、パイエル板部位を慎重に切り出します。その後、採取した腸管切片にPBSを数回激しく注入し、PIパッチの頂端側を洗浄して、過剰な粘膜液と細菌を除去します。

PIパッチの洗浄後、24ウェルプレートのウェルに配置し、cyto effectsまたはcyto perm溶液を加えます。サンプルを氷上で1時間インキュベートします。PIパッチの固定後、1 mLのperm washバッファーに5分間浸します。

この洗浄ステップを3回繰り返します。次に、サンプルを1 mLのブロッキングバッファーに入れ、氷上で30分間インキュベートします。ブロッキングステップの後、抗マウスGP2モノクローナル抗体を最終濃度5 µg/mLになるように添加し、M細胞を染色するために、サンプルを4 °Cで一晩インキュベートします。

次に、同様にサンプルを洗浄します。標識抗体を加え、サンプルを氷上の暗所で2時間インキュベートします。染色後、サンプルをPBSで穏やかに洗浄します。

次に、3〜4枚の円形カバーガラスをスライドに置き、piresパッチをPBSで調製した30%グリセロール溶液200 µLに埋め込みます。スライド上のサンプルを、DM IRE 2共焦点レーザー顕微鏡またはDelta Vision Restorationデコンボリューション顕微鏡を用いて観察します。この画像では、緑色でGFP標識されたSalmonella typhimuriumが、頂端細胞膜上の赤色で示されたGP 2に囲まれていることが確認できます。

この回転画像では、サブアピカル（頂端下）細胞質小胞内に細菌が確認できます。このビデオを視聴することで、結紮した py s 腸管 Lu アッセイを用いて、M細胞による細菌のトランスサイトーシスを評価する方法について十分に理解できるはずです。