3光子蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ脳の深部組織イメージング

麻酔をかけたゼブラフィッシュを口に挿入したペトリ皿を置き、口にチューブを挿入して、酸素を含んだ水を3光子顕微鏡の低倍率対物レンズの下に送ります。

ゼブラフィッシュの脳には、イメージング中の深部組織の視覚化のために蛍光標識タンパク質を発現する遺伝子組み換えニューロンが含まれています。

LED 光源を使用して皿を照らし、画像の鮮明さのために視覚化パラメータを調整します。

ゼブラフィッシュが見えるまで対物レンズを下げ、頭を視野の中央に置きます。

低倍率レンズを高解像度対物レンズに交換し、3光子イメージングを行います。

物理的に接触せずに頭が見えるまで対物レンズを慎重に下げ、軸の値をゼロに設定します。

LED光源をオフにし、暗いカーテンを閉めて、バックグラウンドノイズを最小限に抑えます。

イメージングパラメータを設定し、3光子イメージングを実行すると、波長が長いほど深部組織の3光子励起が可能になります。

励起されると、ニューロンの蛍光色素が蛍光を発し、さまざまな深さのニューロンをリアルタイムで視覚化できます。

イメージングには、低倍率の対物レンズを3光子顕微鏡に配置します。次に、魚とチューブの入ったシャーレを顕微鏡下に置き、LED光源を使用してシャーレを照らします。画像取得ソフトウェアから、カメラモードを開きます。[ライブ] をクリックします。画面右側のチャンネルAを選択し、ヒストグラムの設定を調整して画像をはっきりと見ることができます。

モーターコントローラーのモーター設定をベースに設定した後、魚が見えるまで対物レンズを下げます。魚の頭の中心を視野の中心に置きます。次に、目標を魚の頭から遠ざけます。低倍率対物レンズを高開口数対物レンズに交換して、3光子イメージングを行います。次に、魚の頭に近づけます。すべてのモーターの軸値をゼロに設定します。

対物レンズが頭に物理的に接触しないように、対物レンズをゆっくりと下げます。CCDカメラソフトウェアで、頭のてっぺんが見えると対物レンズの動きを止めます。そして、x、y、z の位置をゼロに設定します。LED 光源をオフにし、システムの周囲の暗いカーテンを閉じます。次に、イメージング取得ソフトウェアを3光子イメージングの多光子GGモードに設定し、対物レンズの下のパワーを1ミリワット未満に設定します。

画像取得ソフトウェアの[ライブ]ボタンをクリックします。PMTチャンネルを開き、必要に応じてPMTゲインとバックグラウンドレベルを調整します。対物レンズをゆっくりと上に移動し、大きな血管と窓ガラスの表面からのTHGチャネルを監視することにより、頭の表面を見つけます。