シトクロムを使用してミトコンドリア呼吸機能の可視化 Cオキシダーゼ/コハク酸脱水素酵素（COX / SDH）二重標識組織化学

この手順の全体的な目標は、新鮮な凍結組織切片におけるミトコンドリア呼吸酵素欠損を直接視覚化できるようにすることです。これは、最初に目的の臓器からクライオスタット切片を収集することによって達成されます。手順の 2 番目のステップは、Cox Histo ケミストリーを実行し、続いて SDH Histo ケミストリーを実行することです。

最後に、組織切片を脱水し、取り付け、カバーを滑り込ませます。最終的には、結果は細胞の青色染色の量を通じてミトコンドリアの機能障害の量を示すことができます。Hi.Today、Cox SCH二重標識HISTOCHEMICAL技術についてお話しします。

この方法は、ミトコンドリア疾患の研究にも応用できるだけでなく、老化や加齢に伴う障害についての洞察も提供することができます。倫理的許可に従って犠牲にされた動物から脳を取り除いた後、ドライアイスで急速に凍結します。凍結ティッシュはマイナス80°Cに保ち、切片の準備ができるまでアルミホイルで包むことができます。

クライオセクショニング用の組織を調製するには、脳をクライオスタットチャックに置き、包埋化合物で囲みます。チャックをクライオスタットにすばやく配置し、マイナス21°Cで14ミクロンの切片を収集します。加熱ブロックを使用してスライドに切片を解凍し、スライドを室温で1時間乾燥させます。

スライドを濡れた紙片でスライド染色チャンバーに入れます。このアッセイでは反応時間が重要であるため、化学フードの下で実験ごとに最大10枚のスライドを処理することをお勧めします。インキュベーション、PBSおよびボルテックス中のdabおよびシトクロムCを含む培地を調製する。

2マイクログラムのウシCDEを培地にすばやく加え、ボルテックスしてよく混合します。ボンネットの下でまだ働いているCDEのすべての粒子を分解するには、ピペットチップを使用して各スライドに150〜200マイクロリットルのインキュベーション培地を塗布し、すべてのセクションに均等に広げます。スライドを摂氏37度で40分間インキュベートします。

40分後、インキュベーション培地をスライドから取り出します。スライドをPBSで4回、毎回10分間洗います。スライドを洗浄した後、化学フードの下で作業する濡れた紙片でスライド染色チャンバーに戻します。

PBSでNBT溶液を調製し、PMSを光の渦から保護するように注意しながら、溶液はピペットチップを使用して各スライドに150〜200マイクロリットルのNBT溶液をすばやく適用し、すべてのセクションに均等に広がります。40分後にスライドを摂氏37度で40分間インキュベートし、スライドから余分な溶液を取り除きます。スライドをPBSで4回、毎回10分間洗います。

次の連続濃度のエタノールでスライドをそれぞれ2分間脱水します。70%70%95%95%および99.5%最後に、さらに99.5%ステップで10分間待ちます。スライドをキシレンに10分間置き、LANで取り付け、カバースリップを貼り付けます。

スライドを一晩または換気の良い場所で少なくとも1〜2時間乾かします。野生型と早期老化からの脳セクション。山。DNA MutatorマウスをCOXおよびSDH活性について逐次標識しました。

暗褐色の染色によって示される正常なCox活性は、野生型マウスの海馬に見られます。青色染色で示されたコックス欠損は、12週および46週のMTDNA変異マウスの海馬で明らかになりました。M-T-D-N-A変異体マウスでは、46週齢までにCox活性がさらに減少し、呼吸連鎖機能障害の広範な悪化が示唆されました。

インキュベーション時間が10分と25分と不十分だったため、ブラウンダブ反応生成物の沈着が減少しました。インキュベーション時間が短縮されたため、SDHインキュベーション中に青色のForan最終生成物が形成され、COX欠損カバーが滑り落ちる細胞の存在を誤解を招く可能性があります。COXインキュベーション中のスライドも、DAB反応生成物の形成と沈着を不正確にする結果となりました。

CoxおよびSDH活性は、ここに示すように個別に標識することができますが、逐次標識は、ミトコンドリア機能障害のある細胞の特定に有利であることが証明されています。野生型マウスの脳内のCOXおよびSDH活性の特異性制御の例は、ネガティブラベリングを示しています。したがって、Cox SCHの二重標識の化学物質を扱うことは、化学プロトコルが非常に危険であり、適切な実験服や化学物質のフードの下でのマスクの着用、インキュベーション培地の廃棄などの予防措置は、このアッセイを実行するたびに行う必要があることを忘れないでください。