Name: シトクロムを使用してミトコンドリア呼吸機能の可視化 Cオキシダーゼ/コハク酸脱水素酵素（COX / SDH）二重標識組織化学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぶCOX/SDH二重標識組織化学法によるミトコンドリア呼吸酵素欠損の可視化。新鮮凍結組織切片を用いてミトコンドリア機能障害を直接観察し、神経変性疾患や老化研究への応用が可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この作品は、老化の国立研究所（AG04418）、国立薬物乱用研究所、健康、カロリンスカ研究所大学院のパートナーシッププログラムの国立研究所、カロリンスカ研究所、スウェーデン研究評議会、スウェーデンの頭脳パワー、およびスウェーデンの脳の財団によってサポートされていました。多くの、それぞれ図1と2、創造的サポートのためのマティアスカーレンと博士ジュゼッペCoppotelliのおかげで、技術支援のためのPernoldカリン、と博士。バリーJ.ホッファー、非常に有益な助言と議論するためのラースオルソン、そしてニルス-ゴランラーション。

1。 cryosectioningのための組織の準備<ol><li>利用可能な倫理的な許可証に基づき、頸椎脱臼または断頭のいずれかの方法で動物を生け贄に捧げる。 </li><li>迅速に関心の組織（ 例えば 、脳）を収集し、迅速に（組織の最適な形態を得るために液体窒素で冷やしイソペンタンまたはプロパンで凍結が必要になる場合があります）ドライアイスで凍結。セクションに-80℃アルミホイルで店の組織は、° Cまでの準備。 </li><li> cryosectioningの準備のために凍結組織を埋め込みます。 </li><li> -21で14μmの凍結切片を収集° C（温度を調整する必要があります± 1〜2 ° C）。使用する準備ができるまで-20℃で封入することなく加熱ブロック、および店舗のスライドを使用してスライド上のセクションを解凍します。 </li></ol> 2。 COXの組織化学<ol><li>スライドは、1時間室温で乾燥することができます。湿った濾紙を持つスライド染色室でスライドを入れ、ストリップに切断。 consistenを取得するには各実験におけるtの結果、それは時間の遅延を最小限に抑えるため、実験ごとに10個のスライドの最大値を処理することをお勧めします。 </li><li>化学フード1X DAB、0.1 M PBSのpH = 7.0で100μM シトクロム cの下準備。すぐに渦。 </li><li> （2μgのml -1のまたは約4 IU ml -1の ）カタラーゼ、ウシ2μgのを追加。カタラーゼのすべての穀物を分割してボルテックスでよく混和する。 </li><li> 150適用 - インキュベーション培地200μLを各スライドに、すべてのセクションの上に均等に分散するためにピペットチップを使用してください。 </li><li> 37℃で40分間スライドをインキュベート℃に</li><li>スライド上の過剰な溶液を除去。洗浄は、0.1 M PBSのpH = 7.0の4倍、10分ごとに時間を、スライド。 </li><li>湿紙のストリップをスライド染色室にスライドを返します。 </li></ol> 3。 SDHの組織化学<ol><li> 1.5mMのNBT、130mMのコハク酸ナトリウム、0.2mMのPMS、および0.1MのPBSのpH = 7.0の1.0 mMのアジ化ナトリウムは、化学物質のボンネットの下準備。遮蔽するために十分注意してください光からPMS。すぐに渦。 </li><li>各スライドにインキュベーション培地の150〜200μLを適用し、すべてのセクションの上に均等に分散するためにピペットチップを使用してください。 </li><li> 37℃で40分間スライドをインキュベート℃に</li><li>スライド上の過剰な溶液を除去。洗浄は、0.1 M PBSのpH = 7.0の4倍、10分ごとに時間を、スライド。 </li><li>エタノールの下記の濃度で2分間スライドを脱水：70％、70％、95％、95％、99.5％。その後は、追加の99.5％の段階で10分の時間を要します。 </li><li> 10分間、キシレンのスライドを置きます。 Entellanとカバースリップをマウントします。スライドは、換気の良い場所で一晩、または少なくとも1〜2時間乾燥することができます。 </li></ol> 4。ミトコンドリア機能障害の定量<ol><li>ミトコンドリア機能障害の量は、細胞ブルー染色の量で示されます。これらの金額を半定量するために、スライドはコード化し、明視野顕微鏡下で可視化されるべきである。半定量は、ブラインドで実行する必要がありますスケールを使用して基礎は、0 - 4（0、青なし染色、4、唯一青色の染色）から、例えば。各被験者/動物の平均値を計算するために与えられた件名（subject）/動物からいくつかのセクションで半定量化のこの種類を実行するのが最善です。 </li><li>統計は、マン - ホイットニーまたはKruskal - Wallisのような非パラメトリックテストを、使用して実行する必要があります。 </li></ol> 5。適切な特異性のコントロール<ol><li> COX活性のための特異性のコントロールについては、"COXの組織化学"の手順を繰り返し、および2.5 mMのアジ化ナトリウム、ターミナルの呼吸鎖阻害剤を加える。 </li><li> SDH活性のための特異性のコントロールについては、コハク酸ナトリウムの除去し、50mMマロン酸、SDHの競合阻害剤を加えて"SDHの組織化学"の手順を繰り返します。 </li><li>洗い、エタノール系列でセクションを脱水してから、などの手順3.4で説明したスライドにマウントし、カバースリップ - 3.6。 </li></ol> 6。代表的な結果： テント"&gt; COX / SDH二重標識組織化学的アッセイの全体的なスキームを図2に示されています。野生型と年不相応に老けているmtDNAの突然変異誘発のマウスからの脳切片における適切なCOX / SDH二重標識組織化学の代表的な例が図に示されている（3）野生型マウス（図3、左パネル）の暗褐色の染色は、通常のCOXの活性を示した。青色染色によって示される呼吸鎖の欠陥を持つ細胞は、12週齢のミトコンドリアDNAの突然変異誘発のマウスでは明らかに、これらの欠陥は、となった46週間（図3、中央と右のパネル）に歳のmtDNAミューテータマウスとして普及。 不十分なCOXラベリングのために野生型マウスの脳切片における不適切なCOX / SDH二重標識の例を図4に示されています。不十分なインキュベーションのCOX活性のデモンストレーションのための時間、またはインキュベーション中にスライドを封入により、分子状酸素の利用を減らすことは、DAB反応するの低下沈着をもたらしたしたがって、イオン積、とは、SDHのインキュベーション中に、青色のホルマザンの最終製品の形成を可能にした。 COXとSDH活性はまた（図5、左と中央）別々に調べることができますが、系列ラベリングには、COXの不足で細胞の同定に有用であり、SDHのインキュベーション（図3中の青い沈殿が形成されるため、中心をと右）。 COXおよびSDH活動のための特異性のコントロールも（図5、右）に行うことができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig1.jpg"> 図1。ミトコンドリア呼吸複合体IV。ミトコンドリア呼吸鎖は、内膜内に位置し、5つの複合体を含んでいます。呼吸鎖の目的は、複雑なIからIVにして、ATPを生産する複合V（ATPアーゼ）で使用されている内側の膜を横切るプロトン勾配を作るそうすることで電子を輸送することです。赤い六角形represeNTのサブユニットはミトコンドリアDNAによってコードさ。白い六角形は、核DNA（複合体IIが完全に核ゲノムからエンコードされていることに注意）でエンコードされたサブユニットを表しています。従って、ミトコンドリアゲノムの変異は、呼吸鎖複合体のサブユニットの変異に起因する呼吸鎖の機能障害を引き起こす可能性があります。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig2.jpg"> 図2。COX / SDH二重標識組織化学アッセイのフローチャート 。興味の器官を分析、急速にドライアイス上で組織を凍結し、そして、それらを保存する - 80℃をクリオスタット切片を収集し備え置かなければならない - 20 ° Cまでの使用を。 1時間室温で空気乾燥のセクションを許可する。 、COXの組織化学のためのインキュベーション培地を準備したスライドに適用し、37℃で40分間インキュベート℃を10分各洗浄用PBS 4倍のセクションを洗ってください。 SDHの組織化学のために培養培地を調製、SLIに適用DESは、再度37℃で40分間インキュベートPBSでもう一度セクションを洗浄、エタノール系列で脱水し、マウントしてスライドをカバースリップ。 COX / SDH二重標識のセクションでは、1〜2時間以内に明視野顕微鏡下で表示する準備ができました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig3.jpg"> 図3。COX / SDH二重標識の代表例 。野生型と年不相応に老けているmtDNAの突然変異誘発のマウスの脳切片を順次COXおよびSDH活動のために標識した。 （スケールバー：200μmの）通常のCOX活性は、（ダークブラウン色で示される）野生型マウス（左）から海馬に示す通りであった。 COXの欠陥は、（青い色で示される）のmtDNAミューテータマウス（中央と右）から海馬において明らかにされた。 mtDNAの突然変異誘発マウスの年齢の46週までにCOX活性のさらなる減少は、呼吸鎖の機能障害の広範な悪化を示唆し、そこにあった。観測された水戸mtDNAの突然変異誘発マウス12のchondrial機能障害は、ミトコンドリアDNAの点突然変異だけでなく、リニア失5の増加したレベルの高レベルによって引き起こされる。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig4.jpg"> 図4。不適切なCOX / SDH二重標識の例 。野生型マウスの脳切片を順次COXおよびSDH活動のために標識した。 （スケールバー：200μmの）不適切なインキュベーション時間（10〜25分）COX活性のデモンストレーションのためには、40分間のインキュベーション時間（左と中央）と比較して、茶色のDABの反応生成物の削減堆積をもたらした。 SDHのインキュベーション中に、青色のホルマザンの最終製品を形成するために許可されて短縮されたインキュベーション時間は、誤解を招くCOXの欠陥を持つ細胞の存在を示唆している。 COXのインキュベーション中にスライドを封入することも、DAB反応するの不正確な形成と沈着をもたらしたイオン製品（右）。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig5.jpg"> 図5。私ndividual COXおよびSDHのラベリングと特異性の制御 。野生型マウスの脳切片を別々にCOXとSDH活動のために標識した、（左と中央）がそれぞれ、ダークブラウン色とブルー色で示されます。 COXおよびSDHの活動が個々にラベルを付けることができますが、系列ラベリングは、ミトコンドリア機能障害を有する細胞を見つけるのに有利であることが証明されている。野生型マウスから脳内COXおよびSDH活動のための特異性の制御の例は、ラベルの有無を（右）を示した。 （スケールバー：200μmの）

<ol><li>Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mitochondrial+DNA+mutations+in+mammalian+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).</li>
<li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+NY+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).</li>
<li>Harman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biologic+clock%3A+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Geriatr.+Soc%22%5BJournal%5D)">The biologic clock: the mitochondria.</a> J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).</li>
<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genetics+-+a+paradigm+for+aging+and+degenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genetics - a paradigm for aging and degenerative diseases.</a> Science. 256, 628-632 (1992).</li>
<li>Trifunovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+ageing+in+mice+expressing+defective+mitochondrial+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase.</a> Nature. 429, 417-423 (2004).</li>
<li>Ameur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+of+mouse+mitochondrial+DNA%3A+mutational+patterns+and+their+origins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins.</a> PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).</li>
<li>Safdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+rescues+progeroid+aging+and+induces+systemic+mitochondrial+rejuvenation+in+mtDNA+mutator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).</li>
<li>DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial myopathies.</a> Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).</li>
<li>Old, S. L., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+microphotometric+assay+of+succinate+dehydrogenase+and+cytochrome+c+oxidase+activities+for+use+on+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle.</a> Histochem. J. 21, 545-555 (1989).</li>
<li>Chaturvedi, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+PGC-1alpha+function+in+muscle+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington's disease.</a> Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).</li>
<li>Edgar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+point+mutations+with+major+effects+on+protein-coding+genes+are+the+driving+force+behind+premature+aging+in+mtDNA+mutator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Metab%22%5BJournal%5D)">Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice.</a> Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).</li>
<li>Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+brain+lactate+is+a+hallmark+of+aging+and+caused+by+a+shift+in+the+lactate+dehydrogenase+A%2FB+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).</li>
<li>Crugnola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+in+muscle+from+patients+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis.</a> Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).</li>
<li>Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+pathology+in+cytochrome+c+oxidase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency.</a> Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).</li>
<li>DiMauro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+encephalomyopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Clin%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial encephalomyopathies.</a> Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).</li>
<li>Bonilla, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+morphological+approaches+to+the+study+of+mitochondrial+encephalomyopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Pathol%22%5BJournal%5D)">New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies.</a> Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).</li>
<li>Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+DNA+mutations+in+human+aging%3A+implications+for+the+central+nervous+system+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle.</a> Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).</li>
<li>Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+enzyme+activity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+implications+for+the+role+of+mitochondria+in+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death.</a> Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).</li>
<li>Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+rates+and+activities+of+respiratory+chain+complexes+correlate+linearly+with+heteroplasmy+of+deleted+mtDNA+without+threshold+and+independently+of+deletion+size%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).</li>
<li>Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcription+factor+A+is+necessary+for+mtDNA+maintenance+and+embryogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice.</a> Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).</li>
<li>Ekstrand, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+parkinsonism+in+mice+with+respiratory-chain-deficient+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).</li>
<li>Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondroplet+ultrastructural+demonstration+of+cytochrome+oxidase+activity+with+a+polymerizing+osmiophilic+reagent%2C+diaminobenzidine+%28DAB%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB).</a> J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).</li>
<li>Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , Saunders. (1973).</li>
<li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+oxidase+deficient+cells+accumulate+in+the+hippocampus+and+choroid+plexus+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age.</a> Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).</li>
<li>Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+histochemical+determination+of+succinic+dehydrogenase+activity+in+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres.</a> Histochem. J. 20, 230-243 (1988).</li>
<li>Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+tRNA%28Leu%28UUR%29%29+mutation+in+mitochondrial+encephalomyopathy%2C+lactic+acidosis%2C+and+strokelike+episodes+%28MELAS%29%3A+genetic%2C+biochemical%2C+and+morphological+correlations+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle.</a> Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).</li>
<li>Petruzzella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+high+levels+of+mutant+mtDNAs+co-localize+with+cytochrome+c+oxidase-negative+ragged-red+fibers+in+patients+harboring+a+point+mutation+at+nt+3243%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243.</a> Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).</li>
<li>Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+encephalomyopathies+in+childhood.+I.+Biochemical+and+morphologic+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations.</a> J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).</li>
<li>Haas, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in-depth+evaluation+of+suspected+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Metab%22%5BJournal%5D)">The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease.</a> Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

複合COX / SDH組織化学的方法では、ミトコンドリア機能障害を有する細胞の可視化を可能にします。この手法は、初期の研究、1968年にさかのぼると、多くはそれの患者14,19,26,27のミトコンドリア病を識別するための&quot;ゴールドスタンダード&quot;を考慮して、人気を保っています。それは今頻繁にmtDNA変異主導老化や老化関連疾患12,13,18,20,21,24を調査するために使用されます。 COX / SDH二重標識法は、しばしば特定のミトコンドリアDNAの変異を同定し、さらにそのようなoximetric測定や分光光度酵素の解析28,29のようなミトコンドリアの呼吸酵素を、調査する他の技術と並行して使用されています。 その長年の使用にもかかわらず、方法を改善するための重要な詳細、シンプルな特異性のコントロール、そして進歩はまだ発表されていない。組織の取扱いに関しては、このtechniqと新鮮凍結組織を使用することが重要です。UEは、COXはホルマリン固定後も存続しますが、ため、SDHはしません。こ...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td> AGAガスAB </td><td>ブロックの形</td><td></td></tr><tr><td>イソペンタン（2 - メチルブタン） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 277258 CAS：78-78-4 </td><td></td></tr><tr><td> Cyrostat埋め込みソリューション</td><td>サクラファインテック</td><td>組織テック4583 </td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td> Microm </td><td> MicromモデルHM 500M </td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>スーパーフロストプラス メンツェルグレイザー J1800AMWZ </td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス ホウケイ酸ガラス</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 16004-098 </td><td> 24 × 50ミリメートル</td></tr><tr><td>ろ紙</td><td>テルフィルターAB </td><td>品質：1350 記事番号：242 001 </td><td> 430 × 430ミリメートル</td></tr><tr><td> 3,3&#39; - ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td>シグマ液体基質システム、D7304 </td><td></td></tr><tr><td> シトクロム c（タイプIII、ウマ心臓から） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C2506 CAS：9007-43-6 </td><td></td></tr><tr><td> （肝臓から）カタラーゼ、ウシ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C9322 CAS：9001-05-2 </td><td></td></tr><tr><td>ニトロブルーテトラゾリウム（NBT） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> N6876 CAS：298-83-9 </td><td></td></tr><tr><td>コハク酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S2378 CAS：6106-21-4 </td><td></td></tr><tr><td>フェナジンメトサルフェート（PMS） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P9625 CAS：299-11-6 </td><td> PMSは、光に敏感です。光の盾。 </td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S8032 CAS：26628-22-8 </td><td></td></tr><tR&gt; <td>キシレン</td><td> VWRインターナショナル</td><td> EM - XX0060 - 4 </td><td></td></tr><tr><td> Entellan </td><td> VWRインターナショナル</td><td> 100503-870 </td><td></td></tr><tr><td>マロン酸エステル （マロン酸） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M1296 CAS：141-82-2 </td><td></td></tr></table>

シトクロムを使用してミトコンドリア呼吸機能の可視化 cオキシダーゼ/コハク酸脱水素酵素（cox / sdh）二重標識組織化学

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

ミトコンドリアDNA（mtDNA）の欠陥は、病気の重要な原因であり、変化の1,2の高齢化や老化に関連する根底にある。老化のミトコンドリア説は、老化プロセス3で、生体エネルギーの恒常性と細胞機能を変化させることができるミトコンドリアDNA変異、の役割を示唆している。豊富な証拠は、この理論の1,4、mtDNAの突然変異誘発マウス5にする例のサポートでコンパイルされているが、高齢化のmtDNAの損傷の正確な役割は、6,7完全には理解されていない。 呼吸酵素の活性を観察することによりミトコンドリアの機能障害を調査するための簡単​​なアプローチです。複雑なIV、またはシトクロム c オキシダーゼ （COX）は、ミトコンドリアの機能に不可欠です。 COXの触媒サブユニットはミトコンドリアDNAによってエンコードされ、複合体の構築（図1）のために必須であるされています。従って、適切な合成と機能は、主にミトコンドリアDNAの完全性2に基づいています。他の呼吸器複合体を調査することもできますが、複合体IVとIIは、組織化学的検査8,9に最も適しています。増加はミトコンドリアの生合成10-12を示すかもしれませんが、複雑なII、またはコハク酸脱水素酵素（SDH）は、完全に核DNA（図1）によってエンコードされ、その活性は、通常、障害のあるミトコンドリアDNAの影響を受けません。障害ミトコンドリア病で観察されるミトコンドリア、老化、そして加齢に伴う病気は、しばしば低いか不在のCOX活性2,12-14と細胞の存在につながる。 COXおよびSDHの活動を個別に調査することができますが、連続した二重標識法15,16は、ミトコンドリア機能障害12,17-21で細胞を見つけるのに有利で ​​あることが証明されている。 アッセイの最適な憲法の多くは、基質濃度、電子受容体/供与体、中間の電子キャリア、pHの影響、及び反応のtとして、決定されているIME 9,22,23。 3,3&#39; -ジアミノベンジジン（DAB）は、効果的かつ信頼性の高い電子供与体22です。機能COXを持つ細胞では、茶色のインダミンポリマー生成物は、ミトコンドリアのクリステに局在し、細胞22を飽和します。機能不全にCOXとそれらの細胞は、青色ホルマザンの最終製品9,24に、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）、電子受容体の減少により、SDH活性の可視化を可能にする、DABの製品で飽和されることはありません。 シトクロム cとコハク酸ナトリウムの基板は、制御および変異型/疾患組織から9までの内因性レベルを標準化するために追加されます。カタラーゼペルオキシダーゼ活性9,22から可能な限り汚染反応を避けるための予防措置として追加されます。フェナジンメトサルフェート（PMS）、中間電子伝達体は、最終の反応生成物9,25の形成を高めるために、呼吸鎖阻害剤、アジ化ナトリウムと組み合わせて使用されます。これは、通知にもかかわらずationは、この上品な簡単なアッセイの結果に影響を及ぼすいくつかの重要な詳細は、特異性のコントロールやテクニックの進歩に加えて、まだ提示されていない。

シトクロムcオキシダーゼ/ナトリウム脱水素酵素（COX / SDH）二重標識法では、新鮮凍結組織切片におけるミトコンドリアの呼吸酵素の欠乏の直接可視化することができます。これは簡単な組織化学的手法であり、ミトコンドリア病、老化、および老化関連疾患を検討する上で有用です。

シトクロムを使用してミトコンドリア呼吸機能の可視化 Cオキシダーゼ/コハク酸脱水素酵素（COX / SDH）二重標識組織化学

ミトコンドリアDNA（mtDNA）の欠損は重要な疾患の原因であり、老化および老化に伴う変化の根底にあると考えられています 1,2。ミトコンドリア説によれば...

この手順の全般的な目的は、新鮮凍結組織切片におけるミトコンドリア呼吸酵素欠損を直接的に視覚化することです。まず、目的の臓器からクライオスタット切片を採取します。次に、Cox組織化学染色を行い、続いてSDH組織化学染色を実施します。最後に、組織切片を脱水し、封入してカバーガラスを掛けます。最終的に、細胞の青色染色の程度によって、ミトコンドリア機能不全の量を示すことができます。こんにちは。今日は、Cox-SDH二重標識組織化学的手法について解説します。また、この手法はミトコンドリア疾患の研究に適用できるだけでなく、老化および加齢に伴う疾患への知見を得るためにも利用可能です。倫理的許可に従って安楽死させた動物から脳を取り出し、ドライアイスで迅速に凍結させます。凍結組織はアルミホイルで包み、切片を作成するまで-80°Cで保存してください。脳をクライオスタットのチャックに載せ、埋没剤で囲むことで、組織を凍結切片作成に向けて準備します。速やかにチャックをクライオスタットに入れ、-21°Cで14 µmの切片を回収します。ヒーティングブロックを用いてスライド上で切片を融解させ、その後、室温で1時間、スライドを乾燥させます。スライドを濡れた紙片を入れたスライド染色チャンバーに設置します。このアッセイでは反応時間が重要であるため、ケミカルフード内で1回につき最大10枚までのスライドを処理することを推奨します。PBSにdabおよびシトクロムCを含むインキュベーション用培地を調製し、ボルテックスで混合します。2 µgのウシCDEを速やかに培地に加え、ボルテックスミキサーでよく混合します。CDEの粒子を完全に分散させるため、引き続きクリーンベンチ内で、各スライドに150〜200 µLのインキュベーション培地を加え、ピペットチップを用いて全領域に均一に広げます。スライドを37 °Cで40分間インキュベートします。40分後、スライドからインキュベーション培地を除去します。PBSで10分間ずつ4回洗浄します。洗浄後、化学薬品用フード内で、濡らしたペーパーストリップを入れたスライド染色チャンバーにスライドを戻します。PMSを遮光しながら、PBSでNBT溶液を調製します。溶液を素早くボルテックスし、ピペットチップを用いて各スライドに150から200 µLのNBT溶液を加え、すべての切片に均一に広げます。スライドを37 °Cで40分間インキュベートし、40分後、スライドから余分な溶液を取り除きます。PBSで1回10分間、計4回の洗浄を行います。以下の濃度のエタノールに順次浸し、それぞれ2分間脱水する。70%、70%、95%、95%、および99.5%。最後に、さらに99.5%のエタノールで10分間処理する。スライドをキシレンに10分間浸し、LANで封入してカバーガラスをかける。スライドを、換気の良

visualization-mitochondrial-respiratory-function-using-cytochrome-c

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

共焦点走査顕微鏡は、生きた動物における灌流心臓または骨格筋​​におけるミトコンドリアの単一のイベントを画像化するために適用される。スーパーオキシドが点滅し、膜電位の変動などの単一ミトコンドリアのプロセスのリアルタイム監視は、生理学的に関連するコンテキストでかつ病理学的摂動の間、ミトコンドリア機能の評価が可能。...

シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージングインビボ

私たちは、収集する方法のプロトコル全体ミトコンドリアのプロセス電子クライオ断層像を提示する。技術はネイティブ生体膜に大きな膜タンパク質複合体の構造、機能、および組織への詳細な洞察を提供しています。...

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。...

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。...

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

我々は、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2およびワサビペキシダーゼ染色を含む相関光および体積電子顕微鏡を用いて遺伝子改変後の全細胞におけるミトコンドリアおよび小和性網膜の分布を研究するためのプロトコルを提示し、同じセクション内の標的遺伝子の有無にかかわらず細胞のシリアル断面、および電子顕微鏡によるシリアルイメージング。...

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

新鮮な腫瘍ホモジナートにおけるミトコンドリア酸化リン酸化と電子移動能を評価する実用的なプロトコルと分析手法を開発しました。このプロトコルは、がんの開始、進行、および治療応答に寄与する様々なミトコンドリア機能を調査するために容易に適応することができる。...

切除された固形腫瘍均質物のミトコンドリア機能の分析的決定

蛍光センサーと組み合わせた高解像度の呼吸法は、ミトコンドリアの酸素消費量と活性酸素種(ROS)の生成を決定します。本プロトコールは、透過処理された坐骨神経におけるミトコンドリア呼吸数およびROS産生を評価する技術を記載する。...

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

このプロトコールは、部分的にセグメント化された機能的CoQプールの存在を研究するために、Na+の存在または非存在下でのミトコンドリア複合体活性CI+ CIIIおよびCII +...

Na+ に対するミトコンドリア内膜感受性が部分的にセグメント化された機能的CoQプールを明らかにする

ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。...

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

このプロトコルは刺激された放出枯渇(STED)の顕微鏡検査を使用してミトコンドリアの微細構造の視覚化および分析のための培養されたSH-SY5Yのセルそして第一次ラットの海馬ニューロンの伝播、微分および汚損のためのワークフローを示す。...

生細胞STEDイメージングを用いた神経細胞モデルにおけるミトコンドリア内膜の微細構造の可視化

ここでは、ヒトまたはマウスの筋肉から採取した新鮮な透過性骨格筋線維におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化を測定するための包括的な方法について説明します。この方法により、ミトコンドリア呼吸のリアルタイム定量化と、既存のミトコンドリアネットワークと膜の完全性を維持しながら、燃料の好みと代謝の柔軟性の評価が可能になります。...

高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

学ぶCOX/SDH二重標識組織化学法によるミトコンドリア呼吸酵素欠損の可視化。新鮮凍結組織切片を用いてミトコンドリア機能障害を直接観察し、神経変性疾患や老化研究への応用が可能です。

シトクロムを使用してミトコンドリア呼吸機能の可視化 Cオキシダーゼ/コハク酸脱水素酵素（COX / SDH）二重標識組織化学

さらに動画を探す