植物の転写産物の正確な位置のためのin situハイブリダイゼーション

次の実験の全体的な目標は、細胞レベルでのmRNA発現パターンを高い感度と特異性で視覚化することです。これは、最初に一連の溶液を通じてフォーマルで固定されたパラフィン包埋組織切片を採取し、ワックス透過を組織に除去し、バックグラウンドシグナルを生成することができる組織内の正に帯電したマイナーグループをブロックすることによって達成されます。続いて、目的の遺伝子に特異的なDIG標識RNAプローブを組織切片に浸潤させ、スライドを一晩でハイブリダイズします。

次に、スライドをRNAで処理します。A:非特異的に結合したプローブを切片から除去し、抗DIG抗体とインキュベートします。これにより、カラーメトリクス化学反応によるハイブリダイズプローブの可視化が可能になります。

その結果、目的の遺伝子が発現している組織内の細胞において、特に光学顕微鏡で検出可能な濃い青色のシグナルが示されました。R-T-P-C-R、マイクロレイ、次世代シーケンシングアプローチなど、他の発現解析におけるこの手法の主な利点は、ここに示すIハイブリダイゼーションプロトコルが、その組織状況における目的の遺伝子の発現パターンを明らかにすることです。これらの方法には、視覚的なデモンストレーションによって最もよく学習される多くの手順が含まれています。

組織を切片にして埋め込む方法と、Al Hybridization proプロトコールの鍵となるステップのうち、自分では習得するのが難しいものを紹介します。パラアルデヒド固定組織を埋め込む方法は、分析する組織の種類によって異なります。ここで最も重要な点は、サンプルが後で切片化するために正しい向きになっていることを確認することです。

埋め込みの方法の1つは、プラスチックの型とリングを使用することです。この手順を開始するには、摂氏60度の温めプレートで型を温め、次に溶融したパラフィンを型に注ぎます。次に、温めた鉗子を使用して組織サンプルを各型に移し、希望の位置に向けます。

型をプレートからベンチに慎重に移動し、白いリングを型の上に置きます。molとwaxを追加します。切断する前に、ワックスを冷まして徐々に硬化させます。

ブロックを室温まで温めてから、各ブロックを台形にトリミングし、サンプルの周囲に約1mmのワックスを残します。トリミングされたブロックをミクロトームに置き、2つの平行な面のうち長い方が底になるようにします。ブロックを慎重にブレードまで前方に持ってきて、ブロックの表面がブレードセクションと平行であることを確認します。

厚さは8〜10ミクロンです。ワックスリボンをアルミホイルなどの焦げ付き防止面に位置合わせし、解剖スコープで目的のセクションを選択します。次に、prob bon plusスライドに鉛筆で印を付けます。

マーカーにペンは、INI 2 ハイブリダイゼーション プロトコル中に消去されるため、使用しないでください。1ミリリットルのきれいなミリQの水を各スライドに分配します。室温で水面に関心のある部分を慎重に浮かべます。

光沢のある面が水に面していることを確認してください。スライドをゆっくりとスライドウォーマーに移します。摂氏35度から37度に設定します。

一般的に使用される摂氏42度とは対照的に、この温度範囲は、セクションの下に気泡が形成されるのを防ぎます。5分後、リボンがスライドに下ろされるように、慎重に、しかし1回の滑らかな動きで水を注ぎます。スライドを少なくとも数時間または摂氏37度で一晩乾燥させて、組織が接着して組織切片を準備します。

in situハイブリダイゼーションの場合、それらは最初にdepaされ、depaファイナライゼーションのために再水和されます。スライドを2回のヒストクリア溶液交換でそれぞれ10分間インキュベートします。組織切片を再水和するには、スライドを一連の減少濃度のエタノールにそれぞれ30秒間通します。

このビデオには示されていないプロテアーゼ処理中に、0.1モルのトライアスロンアミン溶液を含むガラス皿を準備し、これをヒュームフード内の攪拌板にセットします。金属製のスライドラックを溶液に入れる直前に、トライアスロンのアミン、バッファー、階段の吹き抜けに1.25ミリリットルの無水酢酸を加えます。また、クランプシステムやスライドラックを保持するためのスタンドを設置します。

Starrの速度を落とします クランプスライドラックをスタンドに取り付け、ラックを溶液に下げて、攪拌棒より上に持ち上げます。PBSですすぎ、エタノールシリーズで再度脱水した後、10分間ゆっくりと攪拌を続けます。組織切片はハイブリダイゼーションの準備ができています。

スライドをきれいな面に置き、空気を5〜10分間完全に乾かします。変性プローブを80マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーに添加することにより、プローブハイブリダイゼーションバッファー混合物を調製します。各スライドについて、ピペッティングプラスでよく混ぜ、泡を作らないようにします。

プローブハイブリダイゼーションバッファーをピペットで移します。スライドの右端に混ぜます。カバースリップをスライド上に徐々に下げ、ハイブリダイゼーション溶液が気泡のないすべてのセクションをカバーしていることを確認します。

カバーを軽くたたいて、泡が形成される場所を指で軽く切り取り、すべての組織切片から泡を取り除きます。カバーの切り取りを引っ張ると、セクションが損傷しますので、引っ張らないでください。スライドを、UE水で湿らせ、大部分がパラムで覆われたワットマンペーパーが入った湿度チャンバーに入れます。

ボックスをしっかりと密封し、スライドを所望のハイブリダイゼーション温度、通常は摂氏50〜55度で16〜20時間インキュベートします。ハイブリダイゼーションプロトコルの完了時に、スライドからカバースリップを慎重に取り外します。スライドを直立させるとカバースリップが脱落することがありますが、そうでない場合は、カバースリップを引き抜かないでください。

代わりに、カバースリップを取り外した後、スライドを0.2倍のSSCの温かいものに1〜2分間浸してカバースリップを洗い流し、スライドをラックに置き、55°Cで0.2倍のSSCで数回洗浄します。RNA処理後、スライドをラックから平らなプラスチックの箱の底に移し、最小限の量のブロッキング溶液で覆います。ゆっくりと振るプラットフォームでスライドを室温で45分間ブロックします。

次に、最小限の量の抗体溶液を各スライドに直接塗布します。スライドを暗所で室温で2〜3時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、スライドを清潔なフラットボックスに移し、室温の振とうプラットフォーム上で最小限の洗浄バッファーでスライドを4回洗浄します。

TBSで1回、TNバッファーオファーで2回スライドをすすぎ、新たに調製した染色溶液をスライドに適用します。まず、染色液を小さなプラスチック製の計量皿に注ぎます。次に、2つのスライドをセクションが向かい合うように挟み込みます。

サンドイッチを溶液に浸し、毛細管現象で溶液を引き抜きます。スライドをキムワイプで水気を切ります。スライドに染色液を充填します。

繰り返しになりますが、気泡を避けるために溶液が流れ込むときにスライドを軽くたたいたり、スライドをプラスチックの箱に入れたり、室温を暗闇に保管したりする必要がある場合があります。ここでは、さまざまなプローブとシロイヌナズナ組織で得られた代表的な結果を示します。紫色のシグナルは、目的の遺伝子の発現パターンを細胞分解能で直接可視化します。

パネルAは、栄養シュート頂点におけるシュートメリ1転写産物の局在を示しています。分裂組織の不確定な部分に紫青色の信号が存在し、周囲の葉に信号がないことに注意してください。パネルB 2Dはシロイヌナズナ魚雷期の胚の切片で、Bは少数の胚性幹細胞におけるコバタ3の発現を示している。

Cは表皮層でのT ML oneの発現を示し、DはランダムなネガティブコントロールRNAでプローブした切片でのシグナルの欠如を示しています。これらの次の画像は、迷路組織上のさまざまなプローブで得られた結果を示しています。パネルEは、発生中の迷路胚におけるSTMヒューマログ結び目の1つの局在を示しています。

特に栄養シュート頂点を通る胚のメスの茎と根の縦方向の部分における強い信号は、パネルFの軸底葉表面にARF 3 Aが発現し、A T ML one homolog OCL fourが表皮に特異的に発現することを示しています。予想されるパネル G.As では、パネルHのネガティブコントロールプローブについてハイブリダイゼーションシグナルは観察されませんでした。in situハイブリダイゼーションプローブは、DNAの処理後およびその後のin vitro転写反応の精製後、標準的なARAZゲルでチェックされます 炭酸塩加水分解後、プローブ1のような長さが250塩基対を超えるプローブに使用する準備ができたら、炭酸塩加水分解により、より小さなプローブフラグメントの範囲が得られます。

この図は、100ナノグラム/マイクロリットルのコントロールプローブの10からマイナス10、マイナス10、マイナス5の範囲の希釈液によるプローブの色とメートル法の適格性評価の結果を示しており、新たに標識されたDIG標識プローブを抗DIG抗体とアッセイでインキュベートした転写膜上に新たに標識したDIG標識プローブを3つ検出します。この分析は、プローブ2が1マイクロリットル当たり100ナノグラム、プローブ3がマイクロリットル当たり10ナノグラム、プローブ4がマイクロリットル当たり1ナノグラムの推定濃度を示唆しており、プローブ4が良好なineaからハイブリダイゼーションシグナルをもたらさない可能性を示している。最後に、Maceの栄養シュート頂点を通るこれらの縦断面は、非特異的なバックグラウンド信号とよく機能するプローブパネルとの比較を提供します。

Aは非特異的バックグラウンドシグナルを示し、パネルBは外側の細胞層のOC 5プローブの特異的in situ 2ハイブリダイゼーションシグナルを示しています。これを見た後、お気に入りの10代の若者たちの正確な圧力時間的発現パターンを決定できるように、initハイブリダイゼーションプロトコルの多くのトリッキーなステップを実行する方法についてよく理解できるはずです。