Name: 植物の転写産物の正確な位置のためのin situハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学ぶ植物組織内のmRNA発現パターンを可視化するin situハイブリダイゼーション法。パラフィン包埋切片を用いて高感度・高特異的に遺伝子発現を細胞レベルで観察し、組織文脈での発現解析を可能にする。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

MTの研究室では、国立科学財団（DBI - 0820610およびIOS - 1022102）と健康のニューヨーク州省（NYSTEM - C024308）からの補助金によってサポートされています。 CMは、教育と科学（200​​7〜0937）と財団ラファエルデルピノ、スペインのスペイン省からポスドクを受けた。

<ol><li>Rensink, W. A., Buell, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+expression+profiling+resources+for+plant+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Plant.+Sci%22%5BJournal%5D)">Microarray expression profiling resources for plant genomics.</a> Trends. Plant. Sci. 10, 603-609 (2005).</li>
<li>Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S. L., Kebrom, T. H., Provart, N., Patel, R., Myers, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nat. Genet. 42, 1060-1067 (2010).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+root+spatiotemporal+map+reveals+dominant+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Brooks, L., Strable, J., Zhang, X., Ohtsu, K., Zhou, R., Sarkar, A., Hargreaves, S., Elshire, R. J., Eudy, D., Pawlowska, T., Ware, D., Janick-Buckner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+shoot+meristem+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microdissection of shoot meristem functional domains.</a> PLoS. Genet. 5, e1000476-e1000476 (2009).</li>
<li>Galbraith, D. W., Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+studies+of+cell+type-specific+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Global studies of cell type-specific gene expression in plants.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).</li>
<li>Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+analysis+of+the+shoot+apical+meristem+of+maize+%28Zea+mays+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant.+J%22%5BJournal%5D)">Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.).</a> Plant. J. 52, 391-404 (2007).</li>
<li>Juarez, M. T., Kui, J. S., Thomas, J., Heller, B. A., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-mediated+repression+of+rolled+leaf1+specifies+maize+leaf+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity.</a> Nature. 428, 84-88 (2004).</li>
<li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399, 144-148 (1999).</li>
<li>Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+meristem+maintenance+is+controlled+by+a+GRAS-gene+mediated+signal+from+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells.</a> Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).</li>
<li>Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+domain+of+PHANTASTICA+determines+leaflet+placement+in+compound+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves.</a> Nature. 424, 438-443 (2003).</li>
<li>Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaboration+of+B+gene+function+to+include+the+identity+of+novel+floral+organs+in+the+lower+eudicot+Aquilegia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia.</a> Plant Cell. 19, 750-766 (2007).</li>
<li>Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+a+compound+inflorescence+in+tomato+and+related+nightshades%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades.</a> PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).</li>
<li>Kidner, C., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+as+a+tool+to+study+the+role+of+microRNAs+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization as a tool to study the role of microRNAs in plant development.</a> Methods. Mol. Biol. 342, 159-179 (2006).</li>
<li>Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+of+KNOTTED1+mRNA+and+protein+reveals+multiple+potential+sites+of+protein+trafficking+in+the+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Double labeling of KNOTTED1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot.</a> 129, 1423-1429 (2002).</li>
<li>Jensen, W. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJensen%2C+WA+%22Botanical+Histochemistry%22">Botanical Histochemistry</a>. , Freeman. San Francisco. 408-408 (1962).</li>
<li>Jackson, D. In situ hybridization in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJackson%2C+D+%22Molecular+Plant+Pathology%3A+A+Practical+Approach%22">Molecular Plant Pathology: A Practical Approach</a>. Bowles, D. J., Gurr, S. J., McPherson, M. , University Press. Oxford. 163-174 (1991).</li>
<li>Chitwood, D. H., Nogueira, F. T., Howell, M. ontgomery, Carrington, T. A., C, J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+via+small+RNA+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern formation via small RNA mobility.</a> Genes. Dev. 23, 549-554 (2009).</li>
<li>Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+procedure+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+mouse+embryos+and+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies.</a> Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).</li>
<li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li>
<li>Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+phyllotaxy+in+maize+by+the+abphyl1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene.</a> Development. , 126-315 (1999).</li>
<li>Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maize+SBP-box+transcription+factor+encoded+by+tasselsheath4+regulates+bract+development+and+the+establishment+of+meristem+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries.</a> Development. 137, 1243-1250 (2010).</li>
<li>Long, J. A., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+apical+embryonic+pattern+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis.</a> Development. 125, 3027-3035 (1998).</li>
<li>Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+small+RNA+accumulation+in+the+maize+shoot+apex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex.</a> PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで概説したin situハイブリダイゼーション法偉大な携帯電話の解像度、高感度および特異性に関心の任意の遺伝子の時空間発現パターンの直接可視化することができます。プロトコルは、遺伝子間の発現レベルの定量的な比較を許可しません。しかし、法の高感度と分解能は、遺伝子発現を解析の大部分の他の方法では不可能な組織8、18、内遺伝子発現の勾配を明らかにすることができます。 プロトコルは、トラブルシューティングが問題にすることができます多くの手順が含まれています。プロトコルの最も重要なステップは、組織の固定とプローブの選択とラベリングです。低DIGの取り込みと不完全浸透し組織とプローブは、バックグラウンドの上に検出することが困難になる可能性のある非常に微弱な信号が得られます。興味の各々の新しい遺伝子の場合、それはdiffeから派生したいくつかの異なるプローブを試してみることをお勧め転写産物の領域を借りる。時折、遺伝子の別の小さな領域を標的とする二、三のプローブが強いと、特定のハイブリダイゼーションシグナルを得るために組み合わせることが必要な場合があります。さらに、そのような温度およびハイブリダイゼーションバッファーの組成などのハイブリダイゼーション条件は、、それぞれの遺伝子またはハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを下げるか上げるために組織を最適化することができます。また、プロテアーゼ処理のステップは、変数であり、異なる植物種のためにまたは非常に低濃度と転写産物を検出するためのプロトコルを適合させるために変更することができます。両方陽性および陰性コントロールプローブの包含は、プロトコルの問題のポイントを識別する助けになるでしょう。 手順は、パラフィン包埋植物の組織切片用が若干変更して最適化されてin situハイブリダイゼーションホールマウントにも使用できます。広く動物研究19で使用されているが、in situハイブリダイゼーション全体のマウントはLになりますこのような胚、根や若い分裂組織20,21として簡単に潜入することができるの植物組織、にimited。プロトコルは、簡単に同時に二つの異なるmRNAを検出したり、蛋白質15,22,23と一緒に成績証明書をローカライズするために変更することができます。最後に、それは、植物におけるsmall RNAの発現パターンの可視化には、このメソッドのアプリケーションを拡張することが可能です。 miRNAの発現パターンは、トウモロコシとシロイヌナズナ8,14の両方でこのプロトコルを使用して決定されている。さらに最近では、in vitro転写されたプローブで 、市販のロックされた核酸（LNA）信号の感度18、24を増加させるオリゴプローブのDIG標識に置き換えられています。

<table border="1"><tbody><tr><th>製品</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>解説</th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4オンス</td><td>フィッシャー</td><td> 23-244-256 </td><td>トルエンベースの8310から4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td>フィッシャー</td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td>組織パスParaplastプラス</td><td>フィッシャー</td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N +ナイロンメンブレンハイボンド- N + </td><td> GEヘルスケア</td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNaseのOUT、40 U /μL </td><td>インビトロジェン</td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNaseフリーのDNase、1 U /μlの</td><td>プロメガ</td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> DIGラベルされたコントロールRNA </td><td>ロッシュ</td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNAラベリングミックス</td><td>ロッシュ</td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNAポリメラーゼ1,000 U </td><td>ロッシュ</td><td> 10810274001 </td><tD&gt; </td></tr><tr><td> T3 RNAポリメラーゼ1,000 U </td><td>ロッシュ</td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ1,000 U </td><td>ロッシュ</td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td>のRNase </td><td>ロッシュ</td><td> 109142 </td><td>グリセロール50パーセントトリス100mMのpH8.0で溶解する</td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 1 096 176 </td><td> ° C TBSバッファーで70までの耐熱</td></tr><tr><td>羊150 Uから抗ジゴキシゲニン- AP、Fabフラグメント</td><td>ロッシュ</td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIPストック溶液</td><td>ロッシュ</td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td>ミニクイックスピンRNAカラム</td><td>ロッシュ</td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> E.からtRNAの大腸菌 </td><td>ロッシュ</td><td> 109541 </td><td></td></tr><tr><td>トリトン® X - 100 </td><td>シグマ</td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tween - 20を</td><td>シグマ</td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td>脱イオン化ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> 放線griseusタイプXIVからのプロテアーゼ</td><td>シグマ</td><td> P5147 </td><td> 37 MilliQ水とプレダイジェストで希釈して4時間° C </td></tr><tr><td>トリエタノールアミン</td><td>シグマ</td><td> 90279 </td><td>水で希釈し、HClでpH8.0にもたらす</td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>シグマ</td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> ロイコノストック属からデキストラン硫酸のナトリウム塩。 </td><td>シグマ</td><td> D8906 - 5G </td><td>デキストラン硫酸℃で溶解するために80にまで加熱する必要があります。 </td></tr><tr><td>デンハルト溶液の50倍の濃縮</td><td>シグマ</td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清からアルブミン - ≥98％ </td><td>シグマ</td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td>エオシンY二ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td> E4382 </td><td>飽和するまで96〜100％エタノールに溶解する</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール絶対200プルーフ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェノール/クロロホルム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベース型</td><td>電子Microsocpy科学</td><td> 62352〜15 </td><td></td></tr><tr><td>埋め込みリング</td><td>フィッシャー</td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td>キャップと20ミリリットル使い捨てシンチレーションバイアル、 </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td>プローブオンプラススラ​​イド</td><td>フィッシャー</td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス24x50ミリメートル</td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td>ワットマン濾紙3ミリメートル</td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td>三ガラス皿一STAInlessスチールスライドラック</td><td>電子Microsocpy科学</td><td> 71420〜25 </td><td>二つのガラスはhistoclear治療のために必要なくぼみと最後のものは、無水酢酸の治療のために使用されています</td></tr><tr><td> 18清潔なプラス​​チック容器</td><td>電子Microsocpy科学</td><td> 71402 </td><td></td></tr><tr><td>密閉式蓋つきの2つまたは3つの大型フラットプラスチックの箱</td><td></td><td></td><td>ハイブリダイゼーションおよび抗体の手順では必要</td></tr><tr><td>ファインブラシ</td><td></td><td></td><td>ワックスリボンを渡すのに役立ちます</td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td></td><td></td><td>ライカ</td></tr><tr><td>セルフクリーニングドライ真空システム</td><td>ウェルチ</td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td>ウォーマーをスライドさせ</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加熱ブロック</td><td></td><td></td><td> 60 ° Cおよび85 ° Cで必要</td></tr><tr><td> 58〜60時インキュベーター° C </td><td>フィッシャー</td><td></td><td>溶融Paraplastと手順について</td></tr><tr><td> 55 ° Cと37 ° Cのオーブンまたは水浴</td><td>フィッシャー</td><td></td><td>温度の間にクイックチェンジによる2を必要とする</td></tr><tr><td>遠心（4 ° C - 20 ° C） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドラフト</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

植物の転写産物の正確な位置のためのin situハイブリダイゼーション

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

過去十年間のゲノム研究の進歩に伴い、植物の生物学は、遺伝子発現の大規模な定量的な分析を提示する多くの研究を見ている。マイクロアレイや次世代シーケンシングのアプローチは、発達、生理、ストレス応答のプロセスを調査エピジェネティクスとsmall RNAの経路を分析、及び1-3大規模な遺伝子調節ネットワークを構築するために使用されている。これらの技術は大規模な遺伝子セットの同時分析を容易にする一方で、彼らは一般的に遺伝子発現の変化の非常に限られた時空間解像度を提供しています。この制限は、部分的に4-7をソートlasermicrodissectionまたは蛍光活性化細胞と一緒にどちらかのプロファイリングメソッドを使用して克服することができます。しかし、完全に遺伝子の生物学的役割を理解するために、細胞の解像度での表現のその時空間パターンの知識が不可欠です。特に、開発や環境へのSTIの影響を研究するときmuliと変異体は、遺伝子の発現パターンの詳細な分析が不可欠になることができます。特定の細胞型における発現の損失または利得に関連付けられているときに例えば、キー調節遺伝子の発現レベルの微妙な量的な違いは、劇的な表現型につながることができます。 いくつかの方法は、日常的に遺伝子発現パターンの詳細な検査のために使用されています。一つは、トランスジェニックレポーターラインの分析を通じてです。このような分析は、しかし、複数の遺伝子を解析または変換に負えない所で作業する際に時間がかかるになることができます。また、導入遺伝子の発現パターンは内因性遺伝子のことを模倣することを保証するための独立した検証は、通常は必要です。 in situハイブリダイゼーション免疫組織化学的蛋白質の局在またはmRNAは、細胞や組織内の遺伝子発現の直接可視化するための比較的高速な代替案を提示。後者は、それが容易にuをすることができる明確な利点を持っています興味のある任意の遺伝子上のsed。situハイブリダイゼーションでは、目的の遺伝子のin vitro転写により得られたプローブを標識したアンチセンスRNAとのハイブリッド形成による細胞内で標的mRNAの検出を可能にする。 ここでは、非常に感度と特異的であり、植物における遺伝子発現の in situ局在のためのプロトコルの概要を示します。それは、パラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋切片、組織学の優れた保全を与え、そして免疫検出し、アルカリフォスファターゼ比色反応により可視化DIGラベルされたプローブでの使用に最適化されています。このプロトコルは、正常な植物種の広い範囲から採取した組織の数に適用されている、とmRNAと同様の低分子RNA 8月14日の表現を分析するために使用することができます。

市販<em&gt;その場で</emここで説明する&gt;ハイブリダイゼーションプロトコールは、高感度と特異性を持つ細胞レベルでのmRNAと小さなRNAの発現の直接局在することができます。手順はパラフィン包埋植物の組織切片用に最適化され、植物や組織の広い範囲に適用可能である、と10日以内に完了することができます。

過去10年間のゲノミクス研究の進展に伴い、植物生物学においては、遺伝子のの大規模な定量的解析を提示する数多くの研究が行われてきました。

本実験の全体的な目的は、細胞レベルでのmRNA発現パターンを高感度かつ高特異的に可視化することである。これは、まずホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織切片を一連の溶液に通して、ワックスを除去し、組織を透過させ、バックグラウンド信号の原因となる組織内の正電荷を持つマイナーグループをブロックすることによって達成される。その後、標的遺伝子に特異的なDIG標識RNAプローブを組織切片に浸透させ、スライドを overnight でハイブリダイゼーションさせる。次に、スライドをRNAで処理します。切片から非特異的に結合したプローブを除去した後、抗DIG抗体とともにインキュベートします。これにより、比色化学反応によってハイブリダイズしたプローブを可視化することが可能になります。結果として、標的遺伝子が発現している組織内の細胞においてのみ、光学顕微鏡で検出可能な濃い青色のシグナルが認められます。RT-PCR、マイクロアレイ、または次世代シーケンシングなどの他の発現解析手法と比較した本手法の主な利点は、ここで示したin situハイブリダイゼーションプロトコルにより、標的遺伝子の発現パターンを組織学的コンテキストの中で明らかにできることです。これらの手法には、視覚的なデモンストレーションを通じて習得するのが最適なステップが多く含まれています。組織の切片作成と包埋方法、および独学での習得が困難なAIハイブリダイゼーションプロトコルの重要なステップについて解説します。パラアルデヒド固定組織の包埋方法は、解析する組織の種類によって異なります。ここでの最も重要な点は、後の切片作成に向けてサンプルを正しく方向付けすることです。埋込の一つの方法は、プラスチック製型とリングを使用することです。この手順を開始するには、まず60 °Cのウォーミングプレートで型を温め、そこに溶融パラフィンを注ぎます。次に、温めたピンセットを使用して組織試料を各型に移し、目的の方向に配向させます。プレートから型を慎重にベンチへ移動させ、型の上の白いリングを配置します。さらに型とワックスを追加します。切片作成の前に、ワックスを徐々に冷却して硬化させます。ブロックを室温まで温め、サンプルの周囲に約1mmのワックスを残して、各ブロックを台形にトリミングします。トリミングしたブロックを、2つの平行な面の長い方が下になるようにミクロトームにセットします。ブロックを慎重に刃先に近づけ、ブロックの表面が刃の断面と平行であることを確認します。厚さを8〜10 µmにします。ワックスリボンをアルミホイルなどの非粘着性の表面に並べ、解剖顕微鏡下で目的の領域を選択します。次に、Prob Bon Plusスライドに鉛筆で印を付けます。INI 2ハイブリダイゼーションプロトコルの過程で消去されるため、マーカーにペンを使用しないでください。各スライドに1 mLのクリーンなmilli Q水を分注します。室温で、目的の切片を水面に慎重に浮かべてください。光沢のある面が水を向くようにしてください。スライドをゆっくりとスライドウォーマーに移します。温度を35〜37°Cに設定してください。一般的に使用される 42 °C ではなくこの温度範囲を用いることで、切片の下に気泡が形成されるのを防ぎます。5分後、リボン状の組織がスライドグラス上にゆっくりと降りるように、注意しながら一度のスムーズな動作で水を注ぎ出します。組織切片を準備するため、組織が密着するように、スライドグラスを 37 °C で少なくとも数時間、または一晩乾燥させます。in situ ハイブリダイゼーションを行うため、まず脱パラフィンおよび親水化処理を行い、脱パラフィン工程を完了させます。スライドを組織透明化剤で10分ずつ2回洗浄します。組織切片を親水化させるため、濃度の低いエタノール系列にスライドをそれぞれ30秒ずつ浸します。本ビデオでは示していませんが、プロテアーゼ処理を行う際、0.1 molar triathlon amine溶液を入れたガラス皿を用意し、ドラフト内のスターラーの上に設置します。金属製スライドラックを溶液に入れる直前に、triathlon amine、緩衝液、および撹拌液に1.25 millilitersの無水酢酸を加えます。あわせて、スライドラックを固定するためのクランプシステムとスタンドを設置します。Starrクランプの速度を下げ、スライドラックをスタンドに固定し、スターバーより高い位置を維持したままラックを溶液に浸します。PBSで洗浄し、再度エタノール系列で脱水した後、さらに10分間ゆっくりと攪拌し続けます。これで組織切片のハイブリダイゼーション準備が完了です。スライドを清潔な表面に置き、5〜10分間完全に風乾させます。変性させたプローブを80 µLのハイブリダイゼーションバッファーに加えて、プローブハイブリダイゼーションバッファー混合液を調製します。各スライドについて、ピペッティングで十分に混ぜ合わせますが、気泡が入らないように注意してください。プローブハイブリダイゼーションバッファーをピペットで分注します。スライドの右端で混ぜ合わせます。カバーガラスを徐々にスライドに載せ、ハイブリダイゼーション溶液が気泡なくすべての切片を覆うようにします。気泡ができている部分のカバー snippet を指で軽く叩き、すべての組織切片から気泡を取り除きます。カバー snippet を剥がすと切片を損傷させるため、剥がさないでください。スライドを、UE water で湿らせた watman paper を敷き、その大部分を param で覆った湿度チャンバーに入れます。ボックスをしっかりと密閉し、通常は50〜55 °Cで16〜20時間、目的のハイブリダイゼーション温度でスライドをインキュベートします。ハイブリダイゼーションプロトコルが完了したら、スライドからカバーガラスを慎重に取り除きます。スライドを垂直に立てるとカバーガラスが自然に脱落することがありますが、脱落しない場合は、切片を損傷させるためカバーガラスを無理に剥がさないでください。代わりに、カバーガラスを取り外した後、温めた0.2倍SSCにスライドを1〜2分間浸してカバーガラスを洗い流し、スライドをラックに入れ、55 °Cの0.2倍SSCで数回洗浄します。RNase処理後、スライドをラックから平らなプラスチック製ボックスの底に移動させ、最小限の量のブロッキング溶液で覆います。緩やかに揺れるシェーカー上で、室温にて45分間スライドをブロッキングします。次に、少量の抗体溶液を各スライドに直接滴下します。スライドを室温、暗所で2〜3時間インキュベートします。インキュベーション完了後、スライドを清潔なフラットボックスに移し、室温のシェイキングプラットフォーム上で、少量の洗浄バッファーを用いて4回洗浄します。スライドをTBSで1回、TN緩衝液で2回すすぎ、調製したばかりの染色液を適用します。まず、染色液を小さなプラスチック製の秤量皿に注ぎます。次に、切片同士が向かい合うようにして2枚のスライドを重ね合わせます。サンドイッチを溶液に浸し、毛細管現象によって溶液が吸い上げられるようにします。キムワイプの上でスライドの余分な液を切ります。スライドに染色液を満たします。同様に、溶液が注入される際に気泡が生じるのを防ぐため、スライドを軽く叩く必要がある場合があります。スライドをプラスチック製のボックスに入れ、室温・暗所で保存してください。異なるプローブおよびarabidopsis組織を用いて得られた代表的な結果をここに示します。紫色のシグナルにより、標的遺伝子の発現パターンを細胞解像度で直接的に可視化できます。パネルAは、栄養成長期の茎頂におけるshoot Meli one転写物の局在を示しています。メリステムの不定領域に紫青色のシグナルが存在し、周囲の葉にはシグナルが認められないことに注目してください。パネルB〜Dはシロイヌナズナの魚雷型胚の切片であり、Bは少数の胚茎細胞におけるcovata threeの発現を示しています。Cは表皮層におけるT ML oneの発現を示しており、DはランダムなネガティブコントロールRNAでプローブ処理した切片におけるシグナルの欠如を示しています。続く画像は、トウモロコシ組織を用いて異なるプローブで得られた結果を示しています。パネルEは、発達中のトウモロコシ胚におけるSTM Humalog knotted oneの局在を示しています。胚性茎および根の縦断面において、栄養シュート頂端に特異的に強いシグナルが認められることに注目してください。パネルFでは、ARF3Aが軸方向の下葉表面で発現しており、パネルGでは、ATML1ホモログであるOCL4が表皮に特異的に発現しています。予想通り、パネルHのネガティブコントロールプローブではハイブリダイゼーションシグナルは観察されませんでした。プローブのインビトロ転写における各チェックポイントの予想結果をここに示します。インビトロ転写後、DNA処理およびそれに続く転写反応液の精製後、標準的な agarose ゲルを用いてインサイチュハイブリダイゼーションプローブを確認します。プローブ1のような250 base pairs を超える長さのプローブにおいて、炭酸塩加水分解を行った後、使用可能な状態になると、炭酸塩加水分解によりさまざまなサイズのより短いプローブ断片が生成されます。この図は、ドットブロット解析によるプローブのカラーおよび定量的評価の結果を示しています。100 ng/µLのコントロールプローブと、新たに標識した3種類のDIG標識プローブを10⁻¹から10⁻⁵まで希釈し、転写膜上にスポットして、抗DIG抗体およびアッセイでインキュベートしました。解析の結果、推定濃度はプローブ2が100 ng/µL、プローブ3が10 ng/µL、プローブ4が1 ng/µLであり、プローブ4では良好なin situハイブリダイゼーション信号が得られる可能性が低いことが示唆されました。最後に、Maceから得られた栄養シュート頂部の縦断面を用いて、非特異的なバックグラウンド信号と、良好に機能しているプローブパネルとの比較を行っています。Aは非特異的なバックグラウンドシグナルを示していますが、パネルBは外細胞層におけるOC fiveプローブの特異的なin situ 2ハイブリダイゼーションシグナルを示しています。これをご覧いただくことで、お好みの遺伝子の正確な時空間的発現パターンを決定するために、in situハイブリダイゼーションプロトコルの多くの困難なステップをどのように実行すべきかについて、十分な理解を得られるはずです。

in-situ-hybridization-for-precise-localization-transcripts

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、修正されたDIGを説明...

非放射性その場で</emノルウェースプルースと植物種の範囲に適用>ハイブリダイゼーションプロトコール

このプロトコルが正常に定量的な脊椎動物種間で複数の組織の種類のレベルとmRNA発現の空間パターンを検出するために使用されています。メソッドは、低濃度の転写物を検出すると同時にスライドの何百もの処理を可能にすることができます。我々は、例として、鳥類の胚の脳形成の発現プロファイリングを使用して、このプロトコルを提示します。...

放射性その場で</em組織における多様な遺伝子発現パターンを検出するための>ハイブリダイゼーション

ここでは、ホールマウント蛍光を記述...

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

ゼブラフィッシュは、小さな熱帯魚は、脊椎動物の発生と疾患の間に遺伝子機能を研究するための人気のあるモデルとなっている。標的遺伝子の時間的および空間的な表現は次式で求めることができる...

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

ここではin situハイブリダイゼーションの単純な蛍光（FISH）昆虫や植物組織中のウイルスや細菌の局在のための方法を説明します。このプロトコルは、全体のマウントおよび顕微鏡用切片におけるmRNAの可視化のために拡張することができます。...

蛍光<em&gt;その場での</emウイルスと植物及び昆虫組織における共生細菌の局在化のための&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

RNA in situハイブリダイゼーション(ISH)は、細胞や組織内のRNAの可視化を可能にします。ここでは、RNAscope...

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

このプロトコルは、抵抗力のある植物組織に有用な単純なハイブリッドカット組織切片法を説明しています。良質な組織切片は、解剖学的研究や、in...

ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法

記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ...

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA...

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

このビデオでは、in situハイブリダイゼーション2色全体のマウント、2つの異なる遺伝子の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚で可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当​​初、Davidウィルキンソン、ドミンゴスエンリケ、フィルインガムとデビッドイシュ-...

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

学ぶ植物組織内のmRNA発現パターンを可視化するin situハイブリダイゼーション法。パラフィン包埋切片を用いて高感度・高特異的に遺伝子発現を細胞レベルで観察し、組織文脈での発現解析を可能にする。

植物の転写産物の正確な位置のためのin situハイブリダイゼーション

さらに動画を探す