定量的免疫蛍光法を用いて腫瘍におけるタンパク質発現の不均一性のマッピング

本実験の全体的な目的は、ヒトがん組織切片全体のバイオマーカー発現を正確に定量化し、タンパク質発現の不均一性の程度に数値的な値を割り当てることです。これは、まず、ホールスライド蛍光スキャナーを用いて免疫蛍光染色されたがん組織切片をスキャンし、次に、腫瘍内の評価対象となる関心領域（ROI）を選択することで達成されます。

その後、aqua分析自動画像解析システムを用いて、浸潤腫瘍領域内における標的タンパク質の発現量を定量します。最終的に、この手法は、組織切片全体で非常に不均一になりがちな癌組織におけるバイオマーカー発現のマッピングに使用できます。色調および計量視覚化試薬を用いた免疫組織化学などの従来法と比較してこれらの技術を用いる主な利点は、免疫蛍光法の方がより定量性が高く、感度も優れている点にあります。

これらの分析手法を組織切片全体の免疫蛍光スキャンと組み合わせることで、組織全体におけるバイオマーカー発現のわずかな変動を詳細にマッピングすることが可能になります。本手順の実演は、Histo RXラボのオペレーション・ダイレクターであるMark Gustafsonが行います。がん組織生検サンプルのマイクロトームによる切片作成および目的のバイオマーカー発現の免疫蛍光染色を行った後、染色済み切片を最大5枚までスライドスキャナーのスライドカセットにセットします。

次に、ScanScopeコンソールのインターフェースを使用して、染色パターンやサンプルのその他の観察可能な側面に拘わらず、各スライド上のすべての組織を包含する領域を選択します。続いて、ScanScopeコンソールを用いて、最適な代表領域を提示できるよう、なるべく組織の腫瘍領域内で評価する組織領域を選択します。

次に、スキャンスコープコンソールの自動露出機能を使用して、各チャンネルの露出時間と画像のフォーカスを決定します。スキャンスコープコンソールの画像上の青いダイヤモンドを使用して、組織から離れた、しかしカバーグラス下のスライド領域内にある別の領域を選択し、フラットフィールド補正画像の取得に使用する背景領域を定義します。各フィルターについて、画像キャプチャを最適化するため、黄色の正方形で示されるフォーカスポイントを組織領域に追加します。背景が高すぎる場合や、その他の画像アーティファクトが見られる場合は、画像領域を移動して新しい画像を再取得してください。

次に組織をスキャンし、取得したデジタルスライド画像をAperio spectrumデータベースに自動的にアップロードします。spectrumプログラムのサムネイル画像をダブルクリックし、spectrumデータベース内のデジタルスライドリストから解析用のスライドを選択します。次に、付属のH&E染色注釈付き画像を用いて、蛍光画像上の関心領域に注釈を付けます。

個別の円で囲まれた複数の関心領域を、単一のサンプル上で選択することができます。アノテーションを付与した画像は、スペクトルデータベースに自動的に保存されます。次に、画面上部のメニューバーから「Analyze」を選択し、解析ウィンドウが表示されたら、プルダウンメニューから「histo RX aqua analysis」を選択してください。

準備ができたら、「analyze」ボタンを押してください。Windowsタスクバーに最小化されたコンソールウィンドウが表示され、Spectrumデータベースからローカルコンピュータへの画像の転送状況が示されます。データの転送が完了すると、aqua analysisが起動し、サンプルの一次閾値（背景画像信号を超えるパンサイトケラチン画像信号）のデータクラスタリングに基づいた教師なしaquaスコアリングアルゴリズムを用いて、aquaスコアを算出します。これにより、ピクセルを使用して腫瘍マスクを定義でき、以降の計算に使用することが可能になります。

高発現のパンサイトケラチンピクセルを使用して、腫瘍細胞の細胞質または非核領域を定義します。ここで示されているように、腫瘍マスク内にあり、DPIチャンネルで高いシグナルを持つピクセルは、核であると特定されます。確認の結果、サンプルまたはイメージングのアーティファクトによりスコアリングに適さない視野が特定された場合、それらの視野はスコアリングから除外され、最終結果は「不合格（fail）」となります。

aquaスコアリングの結果は、組織切片サンプル全体の関心領域内にある各512×512ピクセルのタイルに関連付けられたスコアの表として表され、保存してその後の統計解析に使用することができます。これらのヘマトキシリン・エオジン染色光顕微鏡写真は、同一の卵巣癌の異なる領域が、いかに多様な形態を示すかを実証しています。図Bの右上の高倍率像では、腫瘍の上部における細胞質の淡明化と充実性増殖パターンを示す細胞が強調されています。

しかしながら、図Cの右下部分で拡大されている組織の下部は、より均一な好酸性細胞質と乳頭状増殖パターンを示しています。ここでは、化学療法治療前後の卵巣がん組織切片におけるER発現の不均一性ヒートマップを、それぞれ上段と下段のパネルに示しています。上図では切片全体にわたって高発現領域と低発現領域が混在しER発現にばらつきがありますが、下図では赤色で示される高いER発現が均一に分布しているという変化に注目してください。

この変化を数値的に表したものが、左側のSimpson指数の減少として示されています。この図では、卵巣癌の組織切片におけるHER2の不均一性ヒートマップが、上段と下段にそれぞれ治療前と治療後で再度示されています。上段の図では、切片全体でHER2の発現が不均一であり、高発現領域と低発現領域の両方が見られますが、下段の図では高発現のHER2が均一に分布しているという変化に改めて注目してください。

ここでも、Simpson指数が減少していることがわかります。この手順を行う際は、計算解析によって得られるデータの質は染色の質に依存するため、染色を高い技術的水準で実施することが重要であることに留意してください。