定量的免疫蛍光法を用いて腫瘍におけるタンパク質発現の不均一性のマッピング

ここでは定量的免疫蛍光法、画像解析、および不均質性の統計的尺度を用いて腫瘍材料の組織切片の分子多様性を定量化する方法を説明します。方法は、臨床バイオマーカーの開発と分析に使用することを目的としています。

次の実験の全体的な目標は、タンパク質発現の不均一性の程度に数値を割り当てるために、ヒトの癌の全組織セクションにわたるバイオマーカー発現を正確に定量化することです。これは、まず、全スライド蛍光スキャナーを使用して、がん組織の免疫蛍光標識切片をスキャンすることによって達成されます。腫瘍内の次の関心領域が評価のために選択されます。

次に、浸潤性腫瘍領域内の目的のタンパク質の発現を、アクア解析自動画像解析システムを使用して定量化します。最終的に、この方法は、組織切片全体で非常に不均一であることが多いがん組織におけるバイオマーカー発現のマッピングに使用できます。これらの手法を従来の方法(カラーおよびメトリック可視化試薬を用いた免疫組織化学などの方法と比較する主な利点は、免疫蛍光がより定量的で感度が高いことです。

これらの分析方法を切片全体と組み合わせることで、免疫蛍光スキャンにより、組織間のバイオマーカー発現の微妙な変動をきめ細かくマッピングすることができます。これらの手順を初めて実演するのは、Histo RXラボのオペレーションディレクターであるMark Gustafson氏です。ミクロトーム後、がん組織生検の切片化、および目的のバイオマーカーの発現のための標本の免疫蛍光染色後、染色切片の最大5枚のスライドをスライドスキャナーのスライドカセットにロードします。

次に、スキャンスコープコンソールのインターフェースを使用します。各スライドについて、サンプルの染色パターンやその他の観察可能な側面に関係なく、スライド上のすべての組織を包含する領域を選択します。次に、スキャンスコープコンソールを使用して、まず、組織の腫瘍領域内で理想的に評価する組織の領域を選択し、最適な表現を提供します。

スキャンスコープコンソールの自動露出機能を使用して、各チャンネルの露光時間と画像の焦点を決定し、スキャンスコープコンソール画像の青いひし形を使用して、組織から離れた追加の領域を選択しますが、カバースリップの下のスライドの領域内にまだ、フラットフィールド補正画像が取得される背景領域を定義します。各フィルターについて、黄色の四角で表される組織領域にフォーカスポイントを追加して、画像キャプチャを最適化します。画像の背景が高い場合や、その他の画像アーティファクトがあると思われる場合は、画像領域を移動して新しい画像を取得する必要があります。

その後、組織をスキャンし、取得したデジタルスライド画像を自動的にAperioスペクトルデータベースにアップロードします。スペクトラムプログラムのサムネイル画像をダブルクリックして、スペクトラムデータベースのデジタルスライドリストから解析用のスライドを選択します。次に、添付のhおよびDアノテーション画像を使用して、蛍光画像上の関心領域にアノテーションを付けます。

個々の円で描かれた複数の関心領域を1つのサンプルで選択できます。注釈が付けられた画像は、スペクトルデータベースに自動的に保存されます。次に、画面上部のメニューバーからAnalyzeを選択し、解析ウィンドウが表示されたら、プルダウンメニューからhisto RX aqua analysisを選択します。

開始する準備ができたら、分析ボタンを押すと、最小化されたコンソールウィンドウがWindowsタスクバーに表示され、Spectrumデータベースからローカルコンピューターへの画像の転送の進行状況が表示されます。データが転送されると、アクア解析が開始され、サンプルの最初の閾値、背景画像信号の上の汎サイトケラチン画像信号のデータクラスタリングに基づく教師なしアクアスコアリングアルゴリズムを使用してアクアスコアが生成されます。これにより、ピクセルを使用して腫瘍マスクを定義し、その後の計算に使用できるようになります。

高発現の汎サイトケラチンピクセルを使用して、腫瘍細胞の細胞質領域または非核領域も定義します。ここで見られるように、腫瘍マスク内にあるDPIチャネルで高信号を持つピクセルは、本質的に核として識別されます。レビュー時に、サンプルまたはイメージングアーティファクトのためにスコアリングに適さなかったフィールドが特定された場合、それらのフィールドはスコアリングから編集され、最終結果は不合格になります。

アクアスコアリングの結果は、組織切片サンプル全体の関心領域にある各512×512ピクセルタイルに関連付けられたスコアの表として表され、保存してその後の統計分析に使用することができます。これらのヘマットトインとエオイン染色写真の顕微鏡写真は、同じ卵巣がんの異なる領域がさまざまな形態を示す方法を示しています。図Bの右上にある高倍率ビューは、細胞質の透明化と腫瘍上部の固体増殖パターンを持つ細胞を強調しています。

しかし、図Cの右下の部分で拡大された組織の下部は、より均質な好酸球性細胞質と乳頭状の成長パターンを持っています。ここでは、化学療法治療の前後の卵巣がんの組織切片におけるER発現の不均一性ヒートマップが、それぞれ上部パネルと下部パネルに示されています。上の図で高発現と低発現の両方の領域を持つセクション全体の可変 ER 発現から、下図の赤で示されている高 ER 発現の均一な分布に変化していることに注意してください。

この変更の数値表現は、左側にシンプソンズ指数の減少で示されています。この図では、卵巣がんの組織切片におけるHERの2つの不均一性ヒートマップが、それぞれ上部パネルと下部パネルに見られるように、治療前と治療後に再度示されています。ここでも、上の図で高い表現と低い表現の両方の領域を持つセクション全体で変数 HER 2 つの発現から、下の図で高い HER 2 つの発現が均等に分布していることに注目してください。

再び、シンプソンズ指数は減少していると見られています。この手順を試行する際には、計算分析によって生成されるデータの品質は染色の品質と同じくらい良く、これは高い技術水準でなければならないことを覚えておくことが重要です。