磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

この手順の全体的な目標は、単一タンパク質のタンパク質分解性切断に対する機械的負荷の影響を、高度に並行して費用対効果の高い方法で研究することです。このデモンストレーションでは、最初のステップでマトリックスメタロプロテイナーゼ1によるコラーゲンの切断を調べ、フローセルのガラスカバースリップにコラーゲントリマーを取り付け、続いてマイクロメートルサイズの磁気ビーズを個々のコラーゲン分子に取り付けます。2番目のステップは、フローセルを磁気ピンセット装置に取り付け、カバースリップ面から非特異的に付着したビードが除去されたことを確認することです。

次に、プロテアーゼをフローセルに添加します。最後のステップは、ビーズの剥離をリアルタイムで監視することにより、タンパク質分解速度を決定することです。さまざまなプロテアーゼ濃度と力でビーズの剥離速度を測定することにより、微量の基質とプロテアーゼを使用して標準的な動物学的速度論的パラメータを導き出すことができます。

さらに、この技術は、タンパク質分解の速度や、切断に伴う基質タンパク質の構造変化に対する機械的な力の影響に関する独自の情報を提供します。光学Tトレースや原子間力顕微鏡などの他の方法と比較したこの技術の主な利点は、この技術が高スループットで費用対効果が高いことです。この方法は、単一タンパク質のタンパク質分解性切断に対する効果的な力についての洞察を提供することができますが、この装置と技術は、タンパク質の折り畳みと確認に対する力の影響を含む、幅広い生物物理学的問題に適用できます。

超音波処理を使用してカバースリップを洗浄することにより、フローセルの準備を開始します。カバースリップを、エーターに収まる小さなガラス容器に収納できます。容器にイソプロパノールを入れ、イソプロパノールをバスエーターで20分間超音波処理し、大量の脱イオン水でカバースリップをすすぎます。

容器に水を入れ、20分間超音波処理します。超音波処理乾燥後、カバーは濾過されたほこりのない空気の流れで滑ります。カバースリップを点検し、汚れのないものだけを使用してください。

カバースリップを数秒間静かに炎で覆い、カバーを通過させて残っているほこりや湿気を取り除きます。ブンゼンバーナーで発生するガス炎をすり抜け、過剰な熱によるカバーの反りに注意してください。このステップにより、残留表面汚染物質が除去されます。

次に、両面スコッチテープを使用して、2枚のカバースリップを一緒に取り付けます。まず、テープを縦約3cm、幅0.3cmにカットし、22×40mmのカバースリップにテープを貼り付け、中央に1.6cmの溝を残します。ピペットチップを使用してカバースリップをそっと押し下げ、テープが適切に接着されていることを確認します。

磁気ピンセット装置は、このラボによって直径1ミリメートルのピンホールを備えたアルミニウムLブラケットを使用して構築され、ピンセットの高さを調整するために垂直Zトランスレータに取り付けられました。ピンホールの両側のブラケットに2つの永久希土類磁石が取り付けられ、磁場勾配を作り出しました。この手順には、マグネティックトラップの適切なキャリブレーションが不可欠です。

成功を確実にするために、このセクションで概説したように、2つの異なる方法を使用します。磁気トラップを較正するには 較正のために、書かれたプロトコルに記載されているように、ビオチンとdoxygenを入れた5プライム末端と3プライム末端で標識されたラムダファージから以前に調製したDNAを使用します。DNAをフローセルに付着させるには、まずフローセルに抗D酸素と抗体溶液を充填し、抗体をガラス表面に15分間接着させます。

次に、DNAの非特異的な付着を防ぐために、フローセルにBSA溶液を添加してフローセルの表面を食べました。この測定ステップとそれに続くすべてのステップでは、フローセルに追加される試薬の量は少なくとも2倍である必要があることに注意してください。フローセルの容量(このデモンストレーションでは75マイクロリットル)は、フローセルを室温で45分間インキュベートします。

このステップを繰り返した後、官能基化ラムダDNAの50ピコモルを添加し、カバースリップに15分間付着させ、1つのXPBSで余分なDNAを洗い流します。最後に、ストレプトアビジン被覆超常磁性ビーズを添加し、固定化されたDNAに15分間付着させます。このデモでは、2.8μmのビーズを使用しています。

余分なビーズを1つのXPBSで洗い流します。次に、永久磁石をサンプル表面から遠く離れた位置に移動して、磁気ピンセットのキャリブレーションを行います。次に、準備したフローセルを顕微鏡に入れます。

永久磁石をフローセルの上の所定の位置に移動します。Lambda DNA修飾ビーズの焦点面は、両方のガラス表面から離れているビーズに焦点を合わせて選択します。正しい焦点面は、目的のビーズの中心が明るい面です。

500フレームで80ヘルツが大きいというビーズの動きを動画で撮影します。磁石をサンプル表面に近づけ、各位置でのビーズの動きをビデオで記録します。5 ミリメートルを超える距離の場合は、1 ミリメートルから 5 ミリメートルの距離で 1 ミリメートル刻みで移動します。

距離が 1 ミリメートル未満の場合は 0.5 ミリメートル刻みで移動し、0.25 ミリメートル刻みで移動 データセットごとに、2D ガウス近似を使用してビーズの中心を追跡します。書かれた手順で説明されているように、ブラウン変動を介して力を計算します。パワースペクトルLianフィットによる力の計算を確認して、力の精度を確認します。

ロールオフ周波数を見つけるために、加えられた力とロールオフ周波数の関係は、コラーゲンペプチドがフロー細胞に付着する前のテキストで見つけることができ、コラーゲンペプチドとMMP Oneタンパク質を発現および精製します。まず、抗マイク抗体溶液をフローセルに添加し、室温で20分間インキュベートして、抗マイクをフローセルの表面に付着させ、フローセルを食べてタンパク質の非特異的な付着を防ぐため、1ミリグラム/ミリリットルでタンパク質の非特異的な付着を防ぎます。BSA 150ピコモルコラーゲンペプチドを添加し、M ttagを介して抗体に45分間付着させます。

PBSバッファーを使用して余分なコラーゲンを洗い流してから、2.8μmのビーズをフローセルに加えます。それらは、強力な磁石を使用して連鎖球菌分裂およびコーティングされたビーズ溶液から分離し、PBSに再懸濁する必要があります。このプロセスを3回繰り返す必要があります。

このステップは、2.8μmのビーズを表面に固定化コラーゲンペプチドに結合させるために不可欠です。次に、連鎖球菌分裂ストレプトアビジン被覆超常磁性ビーズを添加し、コラーゲン分子に45分間付着させます。フローセルをコラーゲンペプチドと磁気ビーズで組み立てたら、磁気トラップ内のフローセルを画像化します。

低い力の下では、ビーズの亜集団は時々弱くなり、非特異的な方法で表面に付着します。適度な力を加えることで、これらのビーズが確実に解放されます。活性化酵素をフローセルに加えます。

この場合、MMP Oneは、3.5ミリモルのA PMAを添加して事前に活性化し、摂氏37度で3時間インキュベートしました。フローセルが磁気ピンセット装置に再導入されるとすぐに、いくつかの視野にまたがるビデオを録画し、通常は数百個のビーズが取り付けられます。この測定値は、時間がゼロに等しいことに対応します。

すべてのビーズが剥離するか、それ以上のタンパク質分解が識別できなくなるまで、一定の時点でいくつかの視野を記録する同じプロセスを繰り返します。磁気ピンセットは、1マイクロメートルと2.8マイクロメートルのビーズ用に校正されました。観察されたブラウン揺らぎの大きさと、強制タンパク質分解実験におけるさまざまな磁石位置でのロールオフ周波数の計算の両方を使用して、残りのビーズの正規化数を時間の関数としてプロットして、タンパク質分解速度を見つけることができます。

そして、このプロセスは、さまざまな酵素濃度と力に対して繰り返すことができます。タンパク質分解速度は、加えられる力に依存します。タンパク質分解の速度は、1ピコニュートン、6.2ピコニュートン、および13ピコニュートンで決定されました。

15分を超えるビーズの割合は、異なる実験で0.25でほぼ一定に保たれています。私たちの場合、このアッセイにより、加えられた力の関数としてのMMP Oneの触媒効率を測定することができました。データを解析した結果、コラーゲンの三重らせんはタンパク質分解の前に局所的にほどく必要があることがわかりました。

このテクニックを習得すると、正しく行えば5〜6時間で実行できます。データの統計的有意性を良好に得るためには、ビューの燃料ごとに少なくとも30〜50個のビーズが必要であることを覚えておくことが重要です。A PMAは非常に危険である可能性があるため、この実験を行うときは、手袋、白衣、フェイスマスクなどの予防措置を常に使用する必要があることを忘れないでください。

このビデオを見れば、磁気ピンセットを使用して単一タンパク質のタンパク質分解性切断に対する力の影響を測定する方法について十分に理解できるはずです。磁気ピンセットは、1分子の生物物理学実験を理解するための優れたツールです。この技術は、他のプロテアーゼと基質の組み合わせに拡張できます。

さらに、同様の手法を使用して、タンパク質の構造ダイナミクスを理解するだけでなく、RNAやDNAに結合または修飾する他のタンパク質を理解することもできます。