Name: 磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぼう、磁気ピンセットを用いて単分子レベルでタンパク質分解を測定する方法。コラーゲンとマトリックスメタロプロテイナーゼを用いた高スループットなアッセイにより、力が酵素活性に与える影響を解析できます。

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この作品は、科学的インタフェース（ARD）、NIHのディレクターの新イノベーター賞プログラムを通じて国立衛生研究所（NIH）1-DP2-OD007078（ARD）、ウィリアム·ボウズ·ジュニアスタンフォード大学フェローシップ（ASAでバローズウェルカムキャリア賞によってサポートされていました）と、スタンフォード大学心臓血管研究所ヤンガー博士号を取得する前のフェローシップ（JC）。著者らは、顕微鏡検査機器を貸し出し用にジェームズSpudichに感謝します。

1。フローセルの準備<ol><li>カバーガラス（＃1.5、22x22 mmと22x40ミリメートル、VWR）は超音波を使用して掃除されています。 <ol><li>カバースリップを保持する（ステップ2を参照）超音波に嵌合可能な小さなガラスの容器にカバースリップを追加します。 </li><li>イソプロパノールで容器を満たし、20分間超音波浴で超音波洗浄します。 </li><li>イソプロパノールを破棄してBarnstedミリQ装置または類似のデバイスによって生成された脱イオン水のおびただしい量でカバースリップをすすいでください。水で容器を満たし、20分間超音波洗浄します。 </li><li>超音波処理した後、濾過し、埃のない空気の流れにカバースリップを乾燥させます。 （すなわち、汚れ）きれいに見える唯一のカバースリップを使用しています。 </li><li>静かに炎が数秒間カバースリップは、残っているほこりや湿気からそれらをきれいにする：過剰な熱のためにカバースリップをワープしないように注意しながら、ブンゼンバーナーで生成ガスの炎を介してカバースリップを渡します。このステップでは、残留表面を削除します汚染物質。 </li></ol></li><li>両面スコッチテープを使用して、2つのカバースリップを添付してください。テープカット〜長さ3センチ、幅0.3センチメートル。真ん中の1.6 cmのチャネルを残して22x40 mmのカバースリップ上のテープを取り付けます。穏やかにテープが正しく付いていることを確認するためにカバースリップを下に押すようにピペットチップを使用しています。 </li></ol> 2。磁気ピンセットのセットアップとキャリブレーション<ol><li>磁気ピンセットは、以前に10,12説明したように永久的な希土類磁石を使用してセットアップした。アルミL型ブラケットは1 mm径のピンホールを使って構築および垂直方向のz変換（Thorlabs）ピンセットの高さを調節するために装着した。 2つの永久希土類磁石は、磁気トラップ（ 図1）を作成するためのピンホールの両側にブラケットに取り付けた。 </li><li> DNAの調製：その5 'および3'末端標識したラムダファージからのDNAをビオチンとジゴキシゲニン（IDT DNA、サンディエゴ、CA）の端部が眼のキャリブレーションをするために使用されたneticピンセット。 <ol><li> 60〜40 nMのビオチンコンジュゲートオリゴヌクレオチドと熱の2μL℃で10分間で4 nMでλ-DNA50μLを混合します。 1時間かけて室温でゆっくりとクール。 </li><li>製造元の仕様に従って、DNAリガーゼを追加し、3時間室温でライゲーション。 </li><li> 45分間室温で400nmのジゴキシゲニン共役オリゴヌクレオチドとインキュベート2μLを追加します。 </li><li> 10mMのATPの1.5μLを追加し、3時間λ-DNAをジゴキシゲニン共役オリゴヌクレオチドのライゲーションを続行します。 </li><li> 100 kDaのスピンフィルタ（マイクロコンUltraCellはYM-100）を使用して、過剰なオリゴヌクレオチドおよびDNAリガーゼを削除します。 TEバッファーで1000倍のバッファー交換の合計は、過剰なオリゴヌクレオチドを​​除去するために十分である。注：DNAの剪断につながるので、スピン速度&gt; 500xGを使用しないことが重要です。 </li><li>そのDNA I確保するために0.7％アガロースゲル上で電気泳動によるDNAのサンプルを調べるsは変性またはせん断はありません。 </li><li> DNAの濃度を測定します。使用可能なサンプル量が非常に小さい可能性があるため、光度計紫外 - 可視分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）の使用が推奨されます。 </li></ol></li><li>セクション1で説明したようにフローセルを準備します。 </li><li>フローセルへのDNAの結合のための、抗ジゴキシゲニン抗体（ヒツジIgG、1μgの添加-1;バイオロシュ、マンハイム、ドイツ）を追加し、それが15分間ガラス表面に付着することができます。 </li><li> 1X PBSで2ミリグラムmL -1の BSA、0.1％Tween-20を追加することにより、DNAの非特異的付着を防止するために、フローセルの表面を不動態化。 45分間室温でインキュベートします。 </li><li>手順2.5を繰り返します。 </li><li> fuctionalizedλ-DNAの50 pmを追加し、15分間カバースリップにアタッチすることができます。 </li><li> 1X PBSで過剰なDNAを洗い流す。 </li><li> = 20μgのmL -1のは 2.8μmのビーズを、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（1μmのビーズ=2μgのmL -1の追加</li><li> 1X PBSで過剰なビーズを洗い流す。 </li><li>磁気ピンセットのキャリブレーション<ol><li>遠く離れて試料表面から（&gt; 15 mm）である位置に永久磁石を移動します。 </li><li>顕微鏡で準備されたフローセルを配置します。 </li><li>フローセル上の位置に永久磁石を移動します。 </li><li>離れてガラス面の両方からビーズに焦点を当ててλ-DNAの官能ビーズの焦点面を選択します。正しい焦点面は、所望のビーズが明るい中心を持っているものである。 </li><li> 500フレームの場合、80 Hz以上ではビーズの動きのビデオを取る。 </li><li>近い試料表面に磁石を移動します。 5ミリメートルを超えた距離については、1ミリメートル単位で移動します。 1〜5ミリメ​​ートルの間の距離については、0.5ミリメートル単位で移動します。 1ミリメートル未満の距離で、0.25ミリメートル単位で移動します。 </li><li>それぞれの新しい磁石の位置にステップ2.11.5と2.11.6を繰り返します。 </li><li>各データの2Dガウスフィットを用いてビーズの中心を追跡し、設定します。 </li><li>を使用してブラウンの変動を介して力を計算します。 </li></ol><img alt="式1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="式1"> K B Tはボルツマンの熱エネルギーである、Lは λ-DNAの長さであり、&lt;x 2&gt;重心位置の分散である。 <ol start="10"><li>ロールオフ周波数を見つけるために、パワースペクトルローレンツフィットを介して力の計算をチェックすることによって、力の精度を確認してください。応用力の関係でロールオフ周波数に関連しています。 </li></ol><img alt="式2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="式2"> ƒ0がロールオフ周波数である、ビーズの半径であり、μは流体の粘度は12です。 </li></ol> 3。フローセルにコラーゲンペプチドアタッチメント私たちの方法論を適用するための具体的な例を提供するために、我々は三量体コラーゲンモデルペプチドのタンパク質分解の特徴を我々の研究室における最近の研究について説明します。我々は、この一般的なアプローチが広く、他のタンパク質およびポリヌクレオチドに適用することができることを期待しています。 <ol><li>コラーゲンモデルペプチド三重らせん形成を強制するために5倍のmycタグ、（GPP）10、続いて精製するためのN末端​​6X Hisタグ、フォームコラーゲンα1残基772から786（GPQGIAGQRGVVGL）、MMPを構成されてい1認識部位、foldonシーケンス（GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL）、およびビオチン-マレイミドでラベルを容易にするために、C末端KKCK。 Foldonは、T4ファージのタンパク質fibritinから派生し、Nのいずれかで融合させたときにコラーゲンモデルトリマーを安定化させる-またはC末端13,14。 </li><li>以前は4,15説明したようにコラーゲンペプチドおよびMMP-1蛋白質を発現させ、精製した。&lt;/ LI&gt; </li><li>抗-mycフローセルの表面にアタッチできるように室温で20分間フローセルとインキュベートする（15μgのmL -1）を抗-mycを追加します。 </li><li>ステップ2.5で説明したのと同じ方法で、5 mgのmL -1の BSAを用いたタンパク質の非特異的付着を防ぐために、フローセルを不動態化する。 </li><li> 150 PMのコラーゲンペプチドを追加し、45分間mycタグを介して抗体に添付することができます。 </li><li> PBS緩衝液を用いて過剰なコラーゲンを洗い流す。 </li><li>ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（1μmのビーズ=2μgのmL -1の 2.8μmのビーズ= 20μgのmL -1）を追加し、それらを45分間コラーゲン分子にアタッチすることができます。 1μmのビーズをPBSで所望の濃度に希釈する必要があります。 3μmのビーズをPBSでresolubilized強力な磁石を使用して、溶液から分離する必要があります。このプロセスを3回繰り返す必要があります。我々は、このステップは、GEにとって不可欠であることに気づいたT 3μmのビーズは、表面固定化コラーゲンペプチドに結合する。 </li></ol> 4。力のタンパク質分解アッセイ<ol><li>一度フローセルは、低〜1 pNの力の下で磁気トラップ内のイメージフローセルは、コラーゲンペプチド、磁気ビーズで組み立てられています。我々の経験では、ビーズの集団は、しばしば弱く、非特定の方法で表面に付着されています。ささやかな力のアプリケーションは、これらのビーズは解放であることを保証します。 </li><li>フローセルに活性化酵素を追加します。このケースではMMP-1は3.5 mMのAPMA（4 - aminophenylmercuricアセテート）を追加することによって、事前に活性化され、3時間37℃でインキュベートした。活性化は、SDS-PAGEを用いて検証した。 </li><li>フローセルは、磁気ピンセット装置に再導入されているとすぐに、通常は数百添付のビーズをもたらして、ビューのいくつかのフィールドにまたがるビデオを記録します。これは 、t = 0になります。 </li><li> tを返すときにビュー（のいくつかのフィールドを記録するのと同じプロセスを繰り返します。、定期的な時点で）ビューの同じフィールドをoすべてのビーズは切り離すまでまたはそれ以上のタンパク質分解は、識別可能ではありません。 </li><li>キネティック·データ解析<ol><li>異なる時点でのビューの様々な分野でビーズをカウントし、それらを平均。 t = 0でのビーズの数によって各時点でビーズの平均数を割ることによってビーズの数を正規化します。ビーズの絶対数は、実験に実験とは異なりますので、これは、我々は別の実験からタンパク質分解の速度を比較することができるようになります。 </li><li>時間の関数としての比をプロットします。このケースでは、指数関数的減衰に加えて定数にそれを装着。 </li></ol><img alt="式3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="式3"> f（t）は （またはコラーゲン分子がunproteolyzed）を添付したビーズの比であるここで、tは時間であり、コラーゲンのテザーによって結合ビーズの割合で、bは減衰率は一定であり、c非特異的に接続されているビーズの割合です。 <ol start="3"><li>同じ実験はMMP-1によるコラーゲンのタンパク質分解に力の効果を明らかにする力とMMP-1濃度を変化させることで繰り返されます。 </li></ol></li></ol> 5。代表的な結果上記のプロトコルは、酵素のタンパク質分解に力の効果を研究するための磁気ピンセット（ 図1）の新たな使用方法について説明します。我々は、観測されたブラウン運動の変動の大きさと様々な磁石の位置（ 図2）でロールオフ周波数の計算の両方を使用して、1μmと3μmのビーズ用ピンセットを校正されています。力のタンパク質分解実験では、セットアップでは、DNAはコラーゲン（ 図3、図4）に置き換えられていることを除いて似ています。残りのビーズの正規化数は、タンパク質分解率（ 図5）を見つけるために時間の関数としてプロットすることができ、このプロセスはすることができます酵素濃度と力を変化させるために繰り返されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1磁気トラップのキャリブレーションプロセスの模式図（スケールしないように）。 2つの永​​久希土類磁石は、超常磁性ビーズを引っ張る磁場を作成します。上下に磁石を翻訳することに加わる力を調整します。ビーズは、二つの磁石の間にピンホールを通過した光で、従来の明視野顕微鏡を用いて画像化されている挿入図 ：40倍空気の目的で撮影した画像。シャープ、丸いスポットはカバースリップの表面に付着したビーズに対応しています。アウト·オブ·フォーカスオブジェクトがデタッチされたビーズです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2は1μm（ 左 ）および2.8ミクロン（ 右 ）ビーズのために試料表面から磁石の距離の関数としてのキャリブレーション力のプロットだ。データは、経験的関数に適合させた<img alt="式4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="式4"> ここで、x は、磁石からの距離です。= 31.8、B = 5.61、cは1μmのビーズとのために= 4.39 = 140、B 3μmのビーズ= 3.10とc = 1.86。これらの値は、私たちの特定の測定器と実験的幾何学に固有であり、各楽器を個別に校正する必要があります。各ポイントでのエラーバーは、ビーズの大きさのばらつきに起因するビーズ基礎にビーズ上に印加される力の約10％の変動を表しています。加えられた力は、ビーズの体積に比例し、ビーズ量は（メーカーの仕様に応じて）平均以上〜9％に変化します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3。フォースタンパク質分解アッセイのセットアップ（実寸ではありません ）。コラーゲンモデル三量体は 、mを介してカバースリップの表面に取り付けられているYC /抗-myc共役。ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズは、ビオチン - ストレプトアビジン結合を介してコラーゲントリマーに取り付けられている。活性化MMP-1カット時間の経過とともにコラーゲン、ビーズ表面からデタッチし、焦点面から離れて移動させる。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"> 図4：時間の関数としてのタンパク質分解の模式図漫画。タンパク質分解が発生すると漫画は、時間の経過ビューのサンプルフィールドを示しています。時間が経つにつれて、MMP-1カットコラーゲンとビーズがデタッチと磁場の影響下で焦点面から離れて移動します。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図5"> 図5。タンパク質分解率が適用された力16に依存しています。 6.2 PN（3μMのMMP-1、 赤 ）および13 PN（0.2μMのMMP-1、 メイジ 、1.0 PN（ ブラック 3μMのMMP-1）で収集したデータも示されNTA）。タンパク質分解の速度（フィットパラメータ）は次のとおりです。0.22±0.02分-1（1 PN）、0.46±0.09分-1（6.2 PN）、および2.08±0.18分-1（13 PN）。長い時間のポイント（&gt; 15分）unproteolyzedビーズの割合は、異なる実験間で〜0.25でほぼ一定のままです。エラーバーは、各時点で観測値の数を反映したポアソン統計に対応しています。 n個のビーズの各時点でのエラーは 、n 1/2である。接続されているビーズの割合で発生したエラーは、エラーpropagation.1μmのビーズが1.0 pNで、6.2 pNの実験に使用した、2.8μmのビーズが13 pNの実験に用いたことにより算出した。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

このプロトコルは、古典的な単一分子技術の新しい使用方法を説明します。磁気ピンセットは、コスト効率の高い方法で高スループットの単一分子アッセイの培地ができます。ただし、すべての実験手法と同様の課題や潜在的な落とし穴があります。 磁気ピンセットの制限事項光学トラップに比べてMT装置の空間分解能と時間分解能が低い。また、ここで説明したシンプルなMTによって生成された力は、日常的にAFM実験でアクセスの力を大幅に下回る30 PNまたは以下である。この制限は、美徳であることができます：MTはよく、サブpNの力を適用するために適しています。 そのようなここ装置などの光学トラップやAFM、従来のMTとは異なり、個々の粒子の操作を許可されていません。光トラップは通常、MTは垂直引っ張り実験のために最高に適している一方で、カバースリップに平行に力を適用するために使用されています。 ElectromagneチックMTが増加し複雑さのコストであるが、これらの制限に対処します。 <p clas...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス＃1.5（22x22） </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス＃1.5（22x40） </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td>ラムダDNA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td>マイクロコンウルトラYM-100 </td><td>ミリポア</td><td> 42413 </td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20を</td><td>シグマ</td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> 抗 Myc抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> 46から0603 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td>ダイナビーズM-280ストレプトアビジン</td><td>インビトロジェン</td><td> 658.01D </td></tr><tr><td>ダイナMyOne T1ストレプトアビジン</td><td>インビトロジェン</td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> P-Aminophenylmercuric酢酸</td><td>カルビオケム</td><td> 164610 </td></tr><tr><td>ビオチン - マレイミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B1267 </td></tr><tr><td>ビオチンは、オリゴを標識した</td><td> IDT DNA </td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>オリゴ標識したジゴキシゲニン</td><td> IDT DNA </td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>コラーゲンペプチド遺伝子</td><td> DNA 2.0 </td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td> MMP-1のcDNA </td><td>ハーバードプラスミドデータベース</td><td></td></tr><tr><td> Z-変換</td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td>翻訳者のためのサーボコントローラ</td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

機械的な力の生成と検出は、癌転移1、アテローム2、治癒3を巻きに直接関連して、細胞生理学のユビキタスな側面です。これらの各例では、細胞はその周囲に力を発揮すると同時に、酵素的に細胞外マトリックス（ECM）を改造両方。 ECMでの力の影響は、このように4月7日 、その可能性が高い生物学的および医学的重要性のためにかなりの関心のある分野となっています。 このような光トラッピング8、原子間力顕微鏡9、磁気ピンセット10,11として単一分子技術は、研究者が個々のタンパク質に力を発揮することによって分子レベルでの酵素の機能を調べることができます。これらの技術のうち、磁気ピンセット（MT）は、低コスト、高スループットが特徴です。 MTは、1から100〜PNの範囲内で力を発揮し、ミリ秒の時間分解能を提供することができますよく単一分子レベル12で酵素機構の研究に一致している資質。ここでは、単一のタンパク質分子のタンパク質分解に力の影響を検討するための、高度な並列化MTアッセイを報告します。我々は、マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP-1）による三量体のコラーゲンペプチドのタンパク質分解の具体例を提示しますが、このアッセイは、簡単に他の基質とプロテアーゼを研究するために適応させることができます。

この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。

機械的な力の生成と検出は、細胞生理学において普遍的な側面であり、がんの転移や動脈硬化の形成などに直接的に関与しています。

この手順の全体的な目的は、単一タンパク質のタンパク質分解切断に対する機械的負荷の影響を、高度に並列的かつ費用対効果の高い方法で研究することです。このデモンストレーションでは、まずマトリックスメタロプロテアーゼ1によるコラーゲンの切断を検証します。フローセルのガラスカバーのスリップにコラーゲントリマーを固定し、続いて個々のコラーゲン分子にマイクロメートルサイズの磁性ビーズを付着させます。第2段階では、フローセルを磁気ピンセット装置に装着し、非特異的に付着したビーズがカバーのスリップ表面から除去されているかを確認します。次に、プロテアーゼをフローセルに添加します。最終ステップは、ビーズの脱離をリアルタイムでモニタリングし、タンパク質分解速度を決定することです。さまざまなプロテアーゼ濃度および荷重条件下でビーズの脱離速度を測定することにより、極少量の基質とプロテアーゼを用いて標準的な酵素反応速度論的パラメータを導き出すことが可能です。さらに、この手法は、タンパク質分解の速度および切断に伴う基質タンパク質の構造変化に及ぼす機械的な力の及ぼす影響について、独自の情報を提供します。光学的なTトレースや原子間力顕微鏡などの他の手法と比較した際の本手法の主な利点は、ハイスループットであり、コスト効率に優れていることです。この方法は単一タンパク質のタンパク質分解切断における有効な力に関する知見を提供できますが、その装置と技術は、タンパク質の折り畳みや高次構造に力が及ぼす影響を含む、広範な生物物理学的問題に適用可能です。超音波洗浄を用いてカバーガラスを洗浄し、フローセルの準備を開始します。カバーガラスを、超音波洗浄機に収まるサイズの小さなガラス容器に入れます。容器にイソプロパノールを満たし、バス型超音波洗浄機で20分間ソニケーションします。その後、イソプロパノールを取り除き、カバーガラスを大量の脱イオン水で洗浄します。容器に水を満たし、20分間超音波洗浄します。超音波洗浄後、ろ過されたダストフリーのエアストリームでカバーガラスを乾燥させます。カバーガラスを点検し、汚れのないもののみを使用してください。カバーガラスをブンゼンバーナーのガス炎にかざし、数秒間軽く火あぶりにして、残っているほこりや水分を取り除きます。この際、過剰な熱でカバーガラスが歪まないように注意してください。この工程により、表面に残った汚染物質が除去されます。次に、両面スコッチテープを使用して、2枚のカバーガラスを貼り合わせます。まず、長さ約3 cm、幅0.3 cmに切ったテープを、22 × 40 mmのカバーガラスに貼り付け、中央に1.6 cmのチャンネル（隙間）を残します。ピペットチップを使用してカバーガラスを軽く押し、テープが適切に密着していることを確認してください。磁気ピンセット装置は、直径1 mmのピンホールを持つアルミニウム製L型ブラケットを用い、ピンセットの高さを調節するための垂直Z軸トランスレーターに取り付けることで、当研究室で構築しました。磁場勾配を形成するため、ピンホールの両側に2つの永久レアアース磁石をブラケットに取り付けました。本手順においては、磁気トラップの適切なキャリブレーションが不可欠です。確実な結果を得るために、本セクションで概説する2つの異なる方法を用います。磁気トラップを校正するには、記述プロトコルに従い、5'末端と3'末端にビオチンとデキソジェンでラベルした、あらかじめ調製したラムダファージ由来DNAを使用してください。DNAをフローセルに固定するには、まずフローセルを抗デキソジェン抗体溶液で満たし、抗体がガラス表面に吸着するまで15分間静置します。次に、BSA溶液をフローセルに注入して表面をコーティングし、DNAの非特異的な吸着を防止します。このブロッキングステップおよびそれ以降のすべてのステップにおいて、フローセルに注入する試薬量は、フローセル容量の少なくとも2倍にする必要があることに注意してください。本デモンストレーションでのフローセル容量は75 µLであるため、フローセルを室温で45分間インキュベートします。この手順を繰り返した後、50 pMの機能化されたlambda DNAを加え、カバーガラスに付着させるために15分間静置し、過剰なDNAを1回分のXPBSで洗い流します。最後に、ストレプトアビジンコート超常磁性ビーズを加え、固定化されたDNAに付着させるために15分間静置します。このデモンストレーションでは、2.8 µmのビーズを使用しています。過剰なビーズを1回分のXPBSで洗い流します。次に、永久磁石を試料表面から十分に離れた位置に移動させ、磁気ピンセットのキャリブレーションを行います。その後、準備したフローセルを顕微鏡に設置します。永久磁石をフローセルの上方の所定の位置に移動します。両方のガラス表面から離れた位置にあるビーズに焦点を合わせ、Lambda DNA機能化ビーズの焦点面を選択してください。適切な焦点面とは、目的のビーズの中心が明るく見える面のことです。80 Hz以上のサンプリングレートで、ビーズの運動を500フレーム分撮影します。磁石を試料表面に近づけ、各位置でのビーズの運動をビデオで記録します。5 mmを超える距離については1 mm刻みで、1 mmから5 mmまでの距離についてはさらに細かく移動させてください。1 mm未満の距離では0.5 mm刻みで、それ以上の場合は0.25 mm刻みで移動させます。各データセットについて、2Dガウスフィッティングを用いてビーズの中心を追跡します。記述された手順に従い、ブラウンゆらぎを介して力を算出します。パワースペクトル線形フィッティングによる力計算を確認し、力の精度を検証します。遮断周波数（ロールオフ周波数）を求めるために、印加力と遮断周波数の関係を、フローセルへのコラーゲンペプチドの固定に先立って、コラーゲンペプチドおよびMMP-1タンパク質を発現・精製して確認します。まず、抗MIC抗体溶液をフローセルに添加し、室温で20分間インキュベートして、抗MICをフローセルの表面に結合させます。5 mg/mLのBSAを用いてフローセルをブロッキングし、タンパク質の非特異的な吸着を防ぎます。次に、150 pMのコラーゲンペプチドを添加し、M-tagを介して抗体に45分間結合させます。フローセルに2.8 µmのビーズを添加する前に、PBSバッファーを用いて過剰なコラーゲンを洗い流します。ビーズは強力な磁石を用いてstrep dividおよびコーティングビーズ溶液から分離させ、その後PBSで再懸濁させてください。この工程を3回繰り返します。このステップは、2.8 µmのビーズを表面固定化されたコラーゲンペプチドに結合させるために不可欠です。次に、ストレプトアビジンコート超常磁性ビーズを添加し、コラーゲン分子に付着するまで45分間静置します。フローセルにコラーゲンペプチドと磁性ビーズが組み込まれたら、磁気トラップ内でフローセルのイメージングを行います。低荷重下では、ビーズの一部が非特異的に表面に付着しており、結合が弱い場合があります。適度な荷重を加えることで、これらのビーズを確実に遊離させます。活性化させた酵素をフローセルに注入します。本ケースでは、3.5 mM の PMA を添加して MMP1 をあらかじめ活性化させ、37 °C で 3 時間インキュベートしました。フローセルをマグネティックツイーザー装置に再導入した直後に、数個の視野にわたるビデオを記録します。これにより、通常、数百個の付着ビーズが得られます。この測定時点を時間 t = 0 とします。すべてのビーズが脱離するか、あるいはそれ以上のタンパク質分解が認められなくなるまで、一定の時間間隔で複数の視野を記録する同じプロセスを繰り返します。磁気ツイーザーは、1 µmおよび2.8 µmのビーズを用いて校正されました。強制的なタンパク質分解実験において、観察されたブラウン変動の振幅と、さまざまな磁石位置におけるロールオフ周波数の算出の両方を用いることで、残存しているビーズの正規化数を時間の関数としてプロットし、タンパク質分解速度を算出することができます。このプロセスは、異なる酵素濃度および荷重で繰り返すことができます。タンパク質分解速度は印加される荷重に依存します。本実験では、1 pN、6.2 pN、および 13 pN の荷重においてタンパク質分解速度を測定しました。15分以降で未分解のままのビーズの割合は、異なる実験間でおよそ0.25とほぼ一定に保たれています。本研究において、このアッセイにより、印加された力の関数としてMMP1の触媒効率を測定することができました。データを分析した結果、コラーゲンの三重らせん構造は、タンパク質分解が行われる前に局所的に解く必要があることが分かりました。この手法を習得すれば、正しく実施することで5〜6時間で完了させることができます。データの統計的有意性を十分に確保するためには、1視野あたり少なくとも30〜50個のビーズが必要であることに留意してください。また、PMAは極めて危険な可能性があるため、本実験の実施中は常に手袋、白衣、フェイスマスクなどの予防策を講じてください。このビデオを視聴することで、磁気ピンセットを用いて単一タンパク質のタンパク質分解切断に対する力の効果を測定する方法について、十分に理解することができます。磁気ピンセットは、単一分子生物物理学的実験を理解するための優れたツールです。この手法は、他のプロテアーゼと基質の組み合わせにも応用することが可能です。さらに、同様の手法を用いることで、タンパク質の構造ダイナミクスの解明だけでなく、RNAやDNAに結合または修飾を行う他のタンパク質の理解を深めることができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

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1分子磁気ピンセットを用いたテロメアタンパク質-DNA相互作用の解析

我々は、短いDNA分子の機械的性質を探求する一定の力軸光ピンセットの使用を例証します。軸方向にDNAを延伸することによって、私たちは私たちが約100nm限り短くDNA分子を研究できるように、立体障害と、従来の横方向の操作で生じるアーチファクトを最小限に抑えることができます。...

コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす

持続長や生体高分子の曲げ剛性を測定するための方法が記載されている。この方法は、実験的に個々の微小管の持続長を決定するキネシン駆動型微小管滑走アッセイを使用しており、アクチンベース滑空アッセイに適応可能です。...

グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

セルロソームは、セルロースを消化するために設計された多酵素複合体です。AFMベースのSMFSを使用して、セルローム関連タンパク質集合体の機械的特性とフォールディング配置を研究しました。セルロソームの組み立てに関与する個々の受容体-リガンド複合体の相互作用を研究するための、タンパク質の固定化、データ取得、およびデータ解析のための完全なワークフローを紹介します。...

AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索

学ぼう、磁気ピンセットを用いて単分子レベルでタンパク質分解を測定する方法。コラーゲンとマトリックスメタロプロテイナーゼを用いた高スループットなアッセイにより、力が酵素活性に与える影響を解析できます。

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

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