ヒト臍帯血由来血管内皮コロニー形成細胞の表現型および機能解析

この手順の全体的な目標は、ヒトの臍帯血から内皮コロニー形成細胞または電子CFCを導出する方法を説明することです。これは、最初に臍帯血から単核細胞をプレーティングし、次にE CFCのコロニー増殖物をクローニングして拡大することによって達成されます。2番目のステップは、クローン増殖能の新しいシングルセルアッセイ技術を使用して、in vitroで細胞を特徴付けることです。

最後に、細胞は、E CFCを含むゲルの作製と移植を通じて、in vivo血管形成アッセイで特徴付けられます。最終的に、de novo宿主血液充填血管のin vivo形成は、細胞インプラントを含むECFCのhおよびe染色によって評価できます。これらの手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、これらの方法により、内皮細胞の増殖能を単一細胞レベルで調べることができることです。

この技術の意味は、患者の内皮細胞の増殖能力と生成能力を調べることができるため、野生動脈疾患やPADなどの疾患の診断および治療ツールを見つけることに拡張できます。手順を開始する前に、1ミリリットルのラットテールコラーゲンを追加し、6ウェル組織培養プレートの各ウェルに1つずつ入力し、手順の日にプレートを一晩インキュベートし、15ミリリットル単位の臍帯血を50ミリリットルの円錐形遠心分離チューブに分注します。次に、各チューブに20ミリリットルのPBSを追加し、混合物を数回上下にピペットで動かします。

次に、15ミリリットルのフィアルPAをピペットに引き込み、希釈した血液のチューブの底にピペットの先端を置き、アルパックを慎重に下敷きにし、減速ブレーキの設定なしで室温で740倍Gでチューブを遠心分離します。細胞分離後、トランスファーピペットを使用して、フィアルピークと希釈血漿との間の界面に位置する低密度単核細胞の濁った層を除去します。採取した細胞を10ミリリットルのE GM二培地を含む50ミリリットルの円錐管に分注し、単核細胞を室温で515倍Gで10分間ペレット化し、高減速ブレーキ設定で、慎重に吸引して上清を捨てる。

次いで、ペレット化した細胞をEGM 2回で洗浄した後、それらを単核細胞をEGM 2で10の1.25倍から10mLあたり7番目の細胞で懸濁する。次に、4ミリリットルの単核細胞懸濁液をコラーゲンコーティングプレートの各ウェルにピペットで入れ、初日にコロニーが形成されるまで細胞をインキュベートします。インキュベート後、使用済み培地をピペットでウェルからゆっくりと取り出し、緩く付着した細胞を乱さないようにします。

次に、4ミリリットルのE GM 2をウェルに慎重に加え、プレートをインキュベーターに戻します。コロニーは通常、手術の前日の5日目から14日目の間に現れます。ラットテールコラーゲンの50マイクロリットルで。

前回と同様に96ウェルプレートの各ウェルに1つずつタイプし、手順の日にプレートを一晩インキュベートします。まず、2〜3回しか継代していない細胞をPBSで2回洗浄します。PBSの最終洗浄を吸引した後、滅菌鉗子を使用して各シリンダーをプレートにしっかりと押し付け、各コロニーの周囲に滅菌ゲルコーティングクローニングシリンダーを置きます。

各クローニングシリンダーに温かいトリプルEエクスプレスを2〜3滴加え、細胞が剥離し始めるまでシリンダーを3〜5分間インキュベートします。細胞が約250マイクロリットルのEGMで剥離し始めた後、シリンダーの中央に2つの培地を注入し、上下にピペットで単細胞懸濁液を生成します。次に、各クローニングシリンダーから単細胞懸濁液を個別のマイクロ遠心チューブに移します。

6ウェルプレート内の細胞にEGFPを発現するレンチウイルスを感染させ、蛍光サイトメトリーによりEGFPを発現する細胞を採取します。次に、EEG FP陽性細胞とEGM 2をコラーゲンコーティングプレートでインキュベートします。E CFCsの準備ができたら、ちょうど示したように旅行Eの表現を使用してそれらを集め、resusは細胞およびe GMの2つの媒体をmmililあたり約10から第6細胞の最終濃度に

次に、毎秒20細胞の低流速のフローソーターを使用して、ウェルあたり1つのEGP陽性ECFCを事前に調製したコラーゲンコーティングされた96ウェルプレートに選別し、EGMを含む各ウェルの最終容量をウェルあたり2〜約200マイクロリットルに調整します。次に、倒立型蛍光顕微鏡を使用して、各ウェルに1つの細胞のみが含まれていることを確認します。プレートを2週間にわたってインキュベートし、培養14日目に2回の培地交換を行います。

各ウェルを100マイクロリットルのPBSで洗浄してから、細胞を100マイクロリットルの4%パラフォームアルデヒドで30分間固定します。EGFPを発現していない電子CFCの場合は、パラホルムアルデヒド固定後の緑色蛍光核色素であるcyt試薬を添加し、摂氏4度で一晩インキュベートします。蛍光顕微鏡を使用して、拡張した内皮細胞の数を視覚的に定量化します(ここで示すように、内皮細胞数が2〜50のウェルは内皮細胞クラスターと見なされます)。

51〜2000個の細胞を有する井戸は増殖性が低い電子CFCであり、2001個以上の井戸は増殖性が高いと考えられる。前回と同様にトリプルE発現で細胞を剥離した後、ヘモ、サイトメーター、トライアンブルーにより細胞培養の生存細胞数を得る。240万個の生細胞を50ミリリットルの円錐管に移し、細胞をスピンダウンしながら遠心分離により細胞をペレット

ゲルマトリックスの成分を十分に混合し、溶液を氷上に保持しながら、水酸化ナトリウムでpHを7.4に調整します。上清を捨てた後、ペレットを360マイクロリットルの温かいe GM2に再懸濁します。次に、840マイクロリットルのゲルマトリックス溶液を細胞に加え、細胞がゲルに完全に懸濁するまで溶液を慎重に混合しますこの1ミリリットルの細胞化ゲル懸濁液を12ウェル組織培養プレートの1ウェルに移し、ゲルが重合するまでプレートをインキュベートします。

その後、一晩インキュベートする前に、翌日と移植の直前に、ゲルを2ミリリットルの温かいEGM 2で優しく覆います。虹彩ハサミを使用してゲルを2等分し、ゲル片をe GM 2培地を含む同じ培養ウェルに戻します。つま先つまみで鎮静を確認した後、5〜6週齢の麻酔をかけたうなずきの下腹部を剃り、マウスを滑らせ、アルコールとベタジンパッドを回転させて手術部位を徹底的に洗浄します。

次に、滅菌された鋭利な虹彩ハサミを使用して、腹部の下腹部に約5ミリメートルの切開を行い、皮膚と腹筋の間の皮下空間を露出させます。鈍。腹部の2つの異なる領域で腹部の筋肉から真皮層を解剖して、幅15〜20ミリメートルのポケットを作成します。1つは上腹部の象限に、もう1つは腹部の別の領域に通じています。次に、真皮層を持ち上げて、切開部に寄り添います。

ジェルの半分を片方の腹部ポケットに挿入し、もう片方の腹部ポケットにジェルのもう半分を挿入します。ゲルを挿入した後、切断針に5つのOHポリプロピレン縫合糸を使用して、各切開部を2〜3針縫います。ケージカードにラベルを付け、施設およびプロトコルの要件に従って術後のモニタリングと鎮痛を行います。

移植の14日目に動物を犠牲にした後、アルコールパッドでマウスの腹部を綿棒で拭き取り、元の切開線まで甘やかされた皮膚を切断します。次に、皮膚のフラップを切除し、ゲルの可能性のある位置に甘やかしました。ゲルの周囲を円周方向に切開して各インプラントを取り外し、切除したインプラントを亜鉛固定剤に入れます。

このECFC導出技術を用いて、我々は早くも5日目に一次コロニー形成の伸長を観察した。矢印で示されているように、これらの日の5つのECFC文化の石畳の形態に注意してください。拡大したコロニーは内皮抗原を発現しますが、造血抗原は発現しません。

この代表的な内皮細胞および造血細胞の表現型評価で示されているように、免疫表現型検査は、e CFCがCD31、CD34、CD1 44、CD1 46、FL one、flick one、flip four、およびNRP twoなどの内皮抗原を発現することを明らかにしたが、造血抗原、CD45、CD14、CD11BCキットCXCR4またはCD133を発現しなかった。重要なことに、この棒グラフに示されているように、拡張されたコロニーは、2〜50個の細胞のクラスターから2001を超えるコロニーまでの範囲で、単一細胞レベルでクローン増殖能の完全な階層を示しています。緑色蛍光核色素であるcytで染色したコロニーのこれらの顕微鏡写真は、臍帯血由来のE CFCを単一細胞レベルで14日間培養した後に得られた。

さらに、電子CFCは、免疫不全マウスに移植すると宿主赤血球と灌流されるヒト化血管を形成します。このCELLULARIZEゲルインプラントを含む臍帯血由来ECFCのh染色およびe染色では、移植後14日後にコラーゲンフィブロネクチンゲルに形成された宿主赤血球で満たされた微小血管が観察されます。ここで、褐色に染色された抗ヒトCD31は、これらの血管のヒト起源をさらに確認する。

このビデオを見た後、ヒトの臍帯血から電子CFCを導出する方法、およびECFCコロニーの機能をクローニング、拡張、および特徴付ける方法についてよく理解しているはずです。この技術は、血管内皮の研究者が、複数の供給源から得られる内皮細胞の内皮クローン増殖能と遺伝子能力を探求する道を開きました。