ヒト臍帯血由来血管内皮コロニー形成細胞の表現型および機能解析

本手順の全体的な目的は、ヒト臍帯血から血管内皮コロニー形成細胞（eCFCs）を誘導する方法を説明することです。まず、臍帯血から単核細胞を播種し、次にeCFCsのコロニーアウトグロウスをクローニングおよび拡大培養することでこれを達成します。第2のステップでは、クローン増殖能を評価するための新しい単一細胞アッセイ技術を用いて、in vitroで細胞の特性解析を行います。

最後に、nudマウスへのECFC含有ゲルの作製および移植によるin vivo血管形成アッセイを用いて、細胞の特性評価を行います。最終的に、ECFC含有細胞インプラントのH&E染色により、ホストの血液で満たされたde novo血管のin vivo形成を評価することができます。既存の手法に対するこれらの技術の主な利点は、単一細胞レベルで血管内皮細胞の増殖能を検討できることです。

この手法の意義は、患者の内皮細胞の増殖能および遺伝的能力を検討できるため、末梢動脈疾患（PAD）などの疾患に対する診断および治療ツールの探索へと拡張できる可能性があります。手順を開始する前に、6ウェル組織培養プレートの各ウェルに1 mLのラットテールコラーゲン（タイプI）を加え、プレートをオーバーナイトでインキュベートします。処置当日に、臍帯血を15 mLずつ50 mLコニカル遠心チューブに分注します。その後、各チューブに20 mLのPBSを加え、ピペッティングで数回混ぜ合わせます。

次に、15 mLのFicoll-PAqueをピペットで吸い取り、希釈した血液が入ったチューブの底にピペットチップを配置し、慎重に層を重ねます。チューブを室温で740 ×gで30分間、減速ブレーキ設定なしで遠心分離します。細胞分離後、トランスファーピペットを使用して、Ficoll-PAqueと希釈血漿の界面にある低密度単核細胞の混濁層を取り除きます。回収した細胞を、10 mLのEGM-2培地 containing containing 50 mLコニカルチューブに移し、室温で515 ×gで10分間、高減速ブレーキ設定で単核細胞をペレット化し、上清を慎重に吸引して廃棄します。

次に、ペレット化した細胞をEGM-2で2回洗浄し、単核細胞をEGM-2を用いて1.25 × 10⁷ cells/mLの濃度で再懸濁します。その後、コラーゲンコートプレートの各ウェルに単核細胞懸濁液を4 mLずつ分注し、1日目にコロニーが形成されるまで細胞を培養します。培養後、弱く付着している細胞を乱さないように、ピペットを用いてウェルから使用済みの培地をゆっくりと除去します。

その後、各ウェルにE GM twoを4 mL慎重に加え、プレートをインキュベーターに戻します。コロニーは通常、処置の前日である5日目から14日目の間に現れます。ラットテールコラーゲンを50 µL使用します。

前述と同様に、96ウェルプレートの各ウェルに1つずつ投入し、処置当日にプレートを一晩インキュベートします。まず、継代回数が2〜3回のみである細胞をPBSで2回洗浄します。最後のPBS洗浄液を吸引した後、各コロニーの周囲に滅菌済みのゲルコーティングクローニングシリンダーを配置し、滅菌ピンセットを用いて各シリンダーをプレートにしっかりと押し付けます。

各クローニングシリンダーに温めたTriple E Expressを2〜3滴加え、細胞が剥離し始めるまで3〜5分間インキュベートします。細胞の剥離が始まったら、シリンダーの中央にEGM-2培地を約250 µL加え、ピペッティングして単一細胞懸濁液を作成します。次に、各クローニングシリンダーから単一細胞懸濁液を個別のマイクロ遠心チューブにそれぞれ移します。

6ウェルプレート中の細胞にEGFP発現レンチウイルスを感染させ、蛍光細胞分取法によりEGFP発現細胞を回収します。その後、EGFP陽性細胞をEGM-2と共にコラーゲンコートプレート内で培養します。E CFCsが準備できたら、先ほど示したようにTrypLE Expressを用いて回収し、細胞をEGM-2培地で再懸濁して、最終濃度を約10⁶ cells/mLに調整します。

次に、フローソーターを用いて、1秒あたり20個という低流量で、あらかじめ準備したコラーゲンコート済み96ウェルプレートの各ウェルにEGP陽性ECFCを1個ずつ分取します。各ウェルの最終容量をEGM-2で約200 µLに調整してください。その後、倒立蛍光顕微鏡を用いて、各ウェルに細胞が1個のみ存在することを確認します。プレートを2週間培養し、その間に2回の培地交換を行い、培養14日目に回収します。

各ウェルを100 µLのPBSで洗浄した後、100 µLの4%パラホルムアルデヒドで30分間細胞を固定します。EGFPを発現していないCFCsについては、パラホルムアルデヒド固定に続き、緑色蛍光核染色剤を添加し、4 °Cで一晩インキュベートします。蛍光顕微鏡を用いて、ここで実演するように拡張した血管内皮細胞の数を視覚的に定量します。内皮細胞数が2〜50個のウェルを血管内皮細胞クラスターとみなします。

51～2000個の細胞を含むウェルは低増殖能eCFCとし、2001個以上の細胞を含むウェルは高増殖能eCFCとみなします。前述と同様にTriple E Expressで細胞を剥離させた後、ヘモサイトメーターとトリパンブルーを用いて、細胞培養液中の生存細胞数を算出します。240万個の生存細胞を50 mLコニカルチューブに移し、遠心分離して細胞をペレット化します。

ゲルマトリックスの成分を十分に混合し、溶液を氷上で保持しながら、水酸化ナトリウムを用いてpHを7.4に調整します。上清を捨てた後、ペレットを360 µLの温めたe GM twoに再懸濁します。次に、840 µLのゲルマトリックス溶液を細胞に加え、細胞がゲル中に十分に懸濁されるまで慎重に混合します。この1 mLの細胞含有ゲル懸濁液を12ウェル組織培養プレートの1ウェルに移し、ゲルが重合するまでプレートをインキュベートします。

その後、一晩インキュベートする前に、2 mLの温めたEGM-2でゲルを優しく覆います。翌日、移植の直前に、アイリス剪刀を用いてゲルを2等分に切り分け、EGM-2培地を含む同じ培養ウェルに戻します。足指つまみ法で鎮静を確認した後、麻酔をかけた5〜6週齢のヌードマウス（SKIDマウス）の下腹部を剃毛し、アルコール綿とベタジン綿を回転させながら手術部位を十分に清浄します。

次に、滅菌済みの鋭利なアイリス剪刀を用いて、腹部の下腹四分画に約5 mmの切開を加え、皮膚と腹筋の間の皮下組織を露出させます。腹部の2つの異なる領域で、真皮層を腹筋から鈍的に剥離し、幅15～20 mmのポケットを2つ作成します。1つは上腹四分画に向かうように、もう1つは腹部の別の領域に向かうように作成します。その後、切開部のすぐ側にある真皮層を持ち上げます。

ゲルの半分を一方の腹腔ポケットに、もう半分のゲルをもう一方の腹腔ポケットに挿入します。ゲルの挿入後、カッティングニードルに装着した5-0ポリプロピレン縫合糸を用い、各切開部位を2〜3針で縫合します。ケージカードにラベルを貼り、施設およびプロトコルの規定に従って術後モニタリングと鎮痛処置を行ってください。

移植後14日目に動物を安楽死させた後、マウスの腹部をアルコールパッドで拭き、元の切開線に合わせて皮膚を切開します。次に、ゲルの存在が推定される位置に合わせて皮膚のフラップを切り出します。ゲルの周囲を円状に切開して各インプラントを取り出し、切り出したインプラントを亜鉛固定液に入れます。

このECFC誘導法を用いることで、早ければ5日目で一次コロニー形成による増殖が観察されました。矢印で示されている、5日目のECFC培養における石畳状の形態に注目してください。拡大したコロニーは血管内皮抗原を発現しますが、造血抗原は発現しません。

内皮細胞および造血細胞の代表的なin vitro表現型評価に示されているように、免疫表現型解析により、e CFCsはCD 31、CD 34、CD 1 44、CD 1 46、FL one、flick one、flip four、NRP twoなどの内皮抗原を発現している一方で、造血抗原であるCD 45、CD 14、CD 11、BC Kit、CXCR four、またはCD 1 33は発現していないことが明らかになりました。重要な点として、この棒グラフに示されるように、拡張したコロニーは、2〜50個の細胞からなるクラスターから200個を超えるコロニーまで、単一細胞レベルでのクローン増殖能の完全な階層性を示しています。緑色蛍光核染色剤であるcytで染色されたコロニーのこれらの顕微鏡写真は、臍帯血由来のE CFCsを単一細胞レベルで14日間培養した後に取得されました。

さらに、ECFCは免疫不全マウスに移植されると、宿主の赤血球が灌流するヒト化血管を形成します。臍帯血由来のECFCを含むCELLULARIZEゲルインプラントのこのH&E染色では、移植から14日後にコラーゲン・フィブロネクチンゲル内で形成され、宿主の赤血球で満たされた微小血管が観察できます。ここでは、茶色の抗ヒトCD31染色が、これらの血管がヒト由来であることをさらに裏付けています。

このビデオを視聴することで、ヒト臍帯血からECFCを誘導する方法、および形成されたECFCコロニーをクローニング、拡大し、その機能を特性評価する方法について十分に理解できるはずです。この技術により、血管内皮研究者は、さまざまなソースから得られた内皮細胞の内皮クローン増殖能および遺伝的能力を探索することが可能になりました。