ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離

このプロトコルの目的は、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞を分離することです。一部のアプリケーションは虚血性疾患の治療、心血管のリスクを持つ患者を識別するためのバイオ マーカーとしてこれらの細胞を使用して、作成組織設計の血管や心臓の弁を構築あります。

この手順の全体的な目標は、ヒトの臍帯血から内皮前駆細胞を単離することです。この方法は、血管移植片の組織工学のための自家細胞としての可能性のために、臍帯血から内皮前駆細胞を単離する方法を示しています。この技術の主な利点は、アミノソーティングを必要とせずに、分離手順を特殊な媒体で実行できることです。

単離された内皮前駆細胞は、血管新生の研究に使用でき、これらの細胞を心血管疾患のリスクのある患者を特定するためのバイオマーカーとして使用できることも報告されています。単離手順を開始する前に、6つのウェルプレートに、ウェルごとに2ミリリットルの新しく調製したラットテール1コラーゲン溶液を事前にコーティングします。プレートを摂氏37度および5%CO2インキュベーターで少なくとも1時間平衡化します。

次に、約25ミリリットルの臍帯血をHBSSで1対1の濃度で希釈します。次に、20ミリリットルの密度勾配培地試薬を50ミリリットルの円錐管に加え、希釈した20ミリリットルの臍帯血をチューブの壁に慎重に分注して、血液を培地に重ねます。遠心分離により細胞を分離し、続いて血漿層を慎重に除去します。

18ゲージの針を取り付けたシリンジを使用して、バフィーコートを含む単核細胞を新しい50ミリリットルのチューブに集めます。そして、等量の内皮基礎培地を細胞に加えます。遠心分離によって細胞を洗浄し、得られた口蓋の赤血球を氷上で5ミリリットルの塩化アンモニウム溶液で溶解します。

時々振とうしながら5〜10分後、遠心分離により細胞を回収し、白色ペレットを新鮮な内皮増殖培地に再懸濁します。カウント後、6ウェルプレートの各ウェルからコラーゲンを吸引し、PBSでウェルを3回洗浄します。単核細胞を、ウェル濃度あたり培地2ミリリットルあたり10〜7番目の細胞に1回ずつ播種します。

そして、プレートをインキュベーターに24時間戻します。翌日、新鮮な内皮増殖培地で細胞を1回すすぎます。次に、洗浄液を3ミリリットルの新鮮な内皮増殖培地と交換し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。

明視野顕微鏡を使用して、細胞の画像を毎日取得して内皮細胞コロニーの進行を監視し、コロニーが発生するプレートをマークして成長を追跡します。内皮細胞コロニーのサイズが約3ミリメートルに達したら、T25培養フラスコに新鮮なラットテール1コラーゲンを少なくとも1時間細胞培養インキュベーターでコーティングします。次に、細胞培養インキュベーター内のウェルあたり150マイクロリットルの0.05%トリプシン-EDTAで細胞を2〜3分間回収します。

プレートを軽くたたいて、付着した細胞を取り除きます。細胞が剥離し始めたら、すぐに2ミリリットルの新鮮な内皮増殖培地を追加し、1つの15ミリリットルの円錐管に細胞を引き込みます。遠心分離により細胞を採取し、ペレットを新鮮な内皮増殖培地に再懸濁します。

計数後、コラーゲン被覆フラスコ中の細胞を10〜5の5倍の細胞にフラスコ密度3ミリリットルの培地で播種し、フラスコを継代1としてマークする。次に、フラスコをインキュベーターに戻し、コロニーが90%のコンフルエンシーに達するたびに細胞を再播種します。コラーゲン処理されたプレートに播種した後、最初のコロニーの成長は通常、5日目から9日目の間に観察されます。

コロニーは成長を続け、培養の初期段階では紡錘形の細胞形態を獲得し、その後、丸石のような形態に進行します。各継代で採取される細胞の総数は、培養の総日数と直接相関して増加します。ウェスタンブロット分析により、培養内皮細胞によるCD 31およびCD 34の早期発現が明らかになり、これはその後の継代とともに減少するようです。

しかし、血管内皮増殖因子受容体2の発現は、最初の経過後に観察される発現レベルよりもわずかに低いレベルではあるが、長期にわたって維持される。注目すべきは、内皮前駆細胞は、間葉系細胞マーカーであるα平滑筋アクチンに対して陽性ではなく、例えば、弁膜間質細胞溶解物とは異なり、陽性対照として含めることができる。すべての分離手順は、得られた臍帯血単位にもよりますが、5時間以内に完了することができます。

単核細胞を内皮増殖培地で単離して播種した後、EPCコロニーが培養物に現れるまでに通常5〜9日かかります。提案された単離法は、内皮前駆細胞を培養するための特殊な培地を使用し、内皮マーカーを持つための要件に関する限り、フローサイトメーターの使用を回避します。この方法は、短時間で大量の内皮前駆細胞を得るための効率的なプロトコールも提供します。

このビデオを見れば、ヒトの臍帯血ユニットから内皮前駆細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。人間の臍帯血は危険な場合があり、廃血や細胞培養製品の適切な廃棄に従う必要があることを忘れないでください。