Name: ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶ ヒト臍帯血由来血管内皮前駆細胞の分離法。専用培地を用いフローサイトメーター不要で効率的に細胞を取得でき、心血管疾患リスクのバイオマーカー研究や血管組織工学への応用が可能です。

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この材料はグラント号下の国立科学財団によってサポートされる作業に基づいてください。CMMI 1452943、アーカンソー大学の名誉の大学によって。我々 はまたアーカンソーの臍帯血バンク臍帯血の単位を提供する私たちを認識したいと思います。

アーカンソー制度検討委員会 (承認番号 16-04-722) の大学の承認を得て本研究を行った。クエン酸リン酸ブドウ糖 (CPD) ソリューション アーカンソー臍帯血バンクでの臍帯血の単位が採集し、ストレージの要件を満たしていないユニット研究寄付しました。臍帯血の単位が周囲温度でコレクションの 24 h 内のラボに取った。
 1 臍帯血から血管内皮前駆細胞の分離 <ol><li>試薬の準備。。
	<ol><li>インスリン様成長因子 (IGF) の 20 ng/mL、1 μ G/ml アスコルビン酸、5 ng/mL 組換えひと上皮増殖因子 (rhEGF)、22.5 μ G/ml を添加した内皮細胞基本培地 (EBM) を 10% 牛胎児血清 (FBS) に追加することで EGM を準備ヘパリン、および 0.5 ng/mL 血管内皮増殖因子 (VEGF)、10 ng/mL 組換えひと線維芽細胞成長因子 B の (rhFGF-B)、0.2 μ g/mL ヒドロコルチゾン 2% ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンと。0.2 μ m ポリエーテルサルホン (PES) 膜の真空フィルターを用いた培養培地を滅菌します</li>。
		<li>準備ラットの尾私コラーゲン液 0.02 N 酢酸を使用して 50 μ g/mL の濃度で。0.2 μ m のシリンジ フィルターを使用してこのソリューションを滅菌します</li>。
		準備されたラットの 2 mL で <li>前コート 6 ウェル プレートは私に各ウェルのコラーゲン溶液を尾します。播種前に 5% CO 2 1 h 以上の 37 ° C で維持されるインキュベーター内に配置します</li>。
		<li>臍帯血とハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) 1:1 の濃度の約 25 mL の希釈します</li>。
		<li>準備ラジオ免疫沈澱試金塩化ナトリウム 150 mM、1% トリトン X-100, デオキシ コール酸ナトリウム 0.5%、1 mM の β-グリセロリン酸、0.1 %sds と 50 mM トリス (pH 8.0) を使用して (RIPA) バッファーします</li>。
	</ol></li> <li>血管内皮前駆細胞の単離。
	<ol><li>暖かいすべて準備隔離前の 37 ° C で維持水浴の試薬</li>。
		<li>密度勾配中の試薬の 20 mL を 50 mL の遠心管に追加します</li>。
		<li>慎重にチューブの側の壁に向かってピペットを目指すことでこの層を壊すことがなく密度勾配媒体を含む遠心管中の希薄臍帯血 20 mL をレイヤーします</li>。
		<li>は、オフ遠心ローターのブレーキと、室温で 30 分間 800 × g で遠心分離によって血液の密度 ( 図 1) に基づくコンポーネントを区切ります。異なるレイヤーを邪魔しないでください</li>。
		<li>は、慎重にピペット チップが MNC に到達できるまでのレイヤー層 ( 図 1 を参照)、他のセルを乱すことがなくチューブからそれをピペッティングによるプラズマ層を削除します。削除されたプラズマを破棄します 。
		注: プラズマを削除するピペット チップを使用している間プラズマ MNC 層擾乱を抑える ( 図 1) の上の小さい層のままにします</li>。
		<li>18 g 針に装着する注射器を使用して多国籍企業を含むバフィー コートを収集し、新鮮な遠心管にそれを転送します</li>。
		<li>EBM の等量に追加収集した遠心多国籍企業これらの管 500 × g 10 分間で 4 ° c. 破棄上澄み。 。
		注: 細胞ペレットが表示されます赤い赤血球・赤血球の存在のため</li>。
		<li>は、赤色の血液細胞を溶解する塩化アンモニウム溶液 5 mL を追加します。時折揺れとの 5-10 分のための氷にこのチューブをインキュベートします 。
		注: 注意が必要このステップの間に時間の長さを超えないように多国籍企業に有害することができます</li>。
		<li>(500 g) x 4 ° C で 10 分間のチューブを遠心分離し、上澄みを廃棄します。赤血球が持続する場合手順を繰り返して 1.2.8 と 1.2.9 ペレットでは赤い色は認められなかった</li>。
		<li>準備 EGM でペレットを再懸濁し、多国籍企業をカウントするため、検定を使用します</li>。
		<li>吸引ラット尾私 (ステップ 1.1.3) からのコラーゲン膜 6 ウェル プレート、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 で 3 回洗浄します</li>。
		<li>種子 1 x 10 7 各ウェルの多国籍企業の濃度のコラーゲン プレートに EGM で再停止される多国籍企業ペレットです。37 ° C、5% CO 2 インキュベーターにそれを配置します</li>。
		<li>後 24 h、培地を吸引、EGM で一度洗浄します。各ウェルに EGM 培地 3 mL を追加し、37 ° C、5% CO 2 インキュベーターに戻した</li>。
		<li>は、毎日 7 日間新鮮な EGM 媒体とプレートを補充します。7 日後 EGM 媒体に他の毎日を変更します</li>。
		<li>血管内皮細胞コロニーの進行を追跡するため、毎日 6 ウェル プレートの画像を取る明視野顕微鏡を用いたします。マーク プレート、コロニーが彼らの成長を追跡するため発生します 。
		注: それは通常文化に表示する植民地、5 ~ 9 日かかります</li>。
	</ol></li> <li>血管内皮前駆細胞の拡張。
	<ol><li>コート T-25 培養用フラスコのラット尾私のコラーゲン (50 μ g/mL) 37 ° C、5% CO 2 インキュベーター、少なくとも 60 分吸引それを置くし、T-25 細胞培養用フラスコ、細胞を播種する前に 1x PBS で 3 回洗う</li>。
		<li>は、各ウェルに 0.05% トリプシン EDTA 溶液を 150 μ l 添加を使用サイズ約 3 mm に達すると内皮細胞コロニーを trypsinize します。6 ウェル プレートを 37 ° C、2-3 分のため 5% CO 2 インキュベーターに配置</li>
		<li>は、添付の細胞を除去する 6 ウェル プレートを軽きます。すぐに EGM の 2 mL を加えて 15 mL 遠心管の細胞を回復します</li>。
		<li>診断を使用してセルをカウントし、初期播種密度を計算します</li>。
		400 x g で 5 分間 <li>スピン 15 mL 遠心管は EGM で細胞ペレットを再懸濁しますで 〜 500,000 細胞 T-25 フラスコをシードします。通路 1 としてこのフラスコをマークし、37 ° C、5% CO 2 インキュベーターに戻って T-25 フラスコを配置します 。
		注: セルは EGM の成長を比較する EBM と DMEM でめっきすることをがします</li>。
		<li>さらに通路のフラスコでは、90% の合流点に達すると、手順 1.3.1 - 1.3.5 と T-75 または T-175 細胞培養フラスコに 10 の 4 セル/cm 2 で細胞を再シードします。隔離されたセル (手順 2 および 3) の評価に進みます</li>。
	</ol></li></ol> 2。隔離されたセルを使用して西部にしみが付く特性 隔離されたセルを特徴付ける拡張手順に従うときすべての通路に <ol><li>追加 50-100 μ L の換散バッファー。約 500,000 以上の細胞から蛋白質を収集します</li>。
	<li>の細胞を破壊し、蛋白質を解放する精力的にピペットを上下。収集し、遠心管にバッファーを転送します</li>。
	<li>は 500 × g で遠心管を回転し、新しい微量遠心チューブに上清を慎重に転送します。ラベル付けし、長期保存用-80 ° c チューブを保存します</li>。
	<li>いずれかのブラッドフォードを使用して各チューブの蛋白質の量を定量化する &#39; s または BCA アッセイ 27 , 28 , 29</li>。
	<li>は、ウエスタンブロット標準手順 27 , 28 , 29 を使用して実行します。総蛋白質 CD31、CD34、VEGFR2、α SMA の表現のための 5 μ g を分析します。データの正規化のため α-チューブリンを使用します</li>。
</ol> 3。間接蛍光抗体法 <ol><li>50% エタノールで 18 mm ガラス coverslips に超音波を照射して乾燥させる。それらを殺菌する光 uv クリーン coverslips を残すバイオ セーフティ フードで一晩 12 ウェル プレートで</li>。
	<li>コート 50 ・ #18 と coverslips1; グラム/mL のラットの尾私のコラーゲンと 37 ° C, 60 分、少なくとも 5% CO 2 インキュベーターにプレートを転送</li>
	<li>は、コラーゲンを吸引し、洗浄、coverslips に 12 ウェル プレートに 1 mL の 1x PBS を追加します。1 × PBS を吸引し、2 回繰り返します</li>。
	<li>シード 250,000 培養も 37 ° C では、免疫染色を行う前に、少なくとも 3 日間 5% CO 2 インキュベーターに戻ってそれらの場所で Epc</li>。
	<li>1x PBS で 3 回洗浄します。各ウェルに冷たいメタノール 1 mL を追加し、セルを修復するのに 15 分間、室温でインキュベートします</li>。
	<li>は、標準プロトコル 27 , 28 , 29 を使用して染色を行います。抗体を使用して、彼らの適切な希薄で (例えば CD31 (1:20)、CD34 (1:50)、α SMA (1: 100) と VEGFR2 (1:50)).</li>
	<li>落射蛍光顕微鏡を用いた immunostained coverslips の画像を撮影します</li>。
</ol>

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</ol>

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前述したように、付着性の Epc は、石畳の形態を所有しています。私たちの孤立した多国籍企業から進歩した紡錘形細胞コロニー (図 2A 2 D) 初期段階で石畳の植民地 (図 2E 2 階) に 10 日間の培養期間。Epc ラベル付けされている異なる研究グループによって異なる後期の血管内皮前駆細胞の10、としてすなわち内皮細胞コロニー形成細胞5、または血管内皮前駆細胞12。それは、これらの細胞は機能的に同じと類似の細胞表面マーカーを表現こと注意してください。ほぼ 108セル、前の出版物に類似して、Epc3、5の高い増殖能の典型的な増資文化期間 (<strong class...

いくつかの調査官は、特性と人間 Epc5,10、11,12,13の可能性を勉強しています。Epc は、循環血管内皮組織低酸素、虚血、外傷、あるいは腫瘍形成のサイトに従うし、新しい血管構造4,14の形成に貢献する能力を持っている細胞として記述することができます。観測へ生後発生の形での血管新生の関与は、これらの細胞とその治療への応用4,15,の病態生理の理解につながっている16. 心血管の病理学9,15,16,17,と18,19 相関する個々 の Epc の数が示されています。 ,20。他の研究も Epc を弁線維芽細胞のような表現型に分化して組織工学心臓弁7、21のこれらの細胞を使用できることを提案しました。
調査4間の不一致のための Epc を分離するために必要な特定の細胞表面分子が明確に識別されていません。いくつかグループ1,17,22,23, Epc の推定される可能性があることを示唆によって実行された多国籍企業のさまざまな培養条件への露出で、特定のマトリックスへの接着異なる表現型プロパティを表示します。これらのプロパティには、貪食能力、マトリゲル、管形成と Dil アセチル化低密度リポタンパク質の摂取量の不足が含まれます。高いクローンと増殖能は、どの Epc と階層化された5をすることができます 2 つのプロパティです。Epc はまた4ひと胎児肺線維芽細胞の遊走と、体外に尿細管を形成できます。これらの細胞は、血管内皮細胞表面マーカーを表現して造血マーカー13,24,25のいくつかを共有するために知られています。フェノタイピング Epc の広く受け入れられている積極的に表現されたマーカーは CD31 CD34、血管内皮増殖因子受容体 2 (VEGFR2)、フォン ・ ヴィレブランド因子 (vWF)、CD133、c キットと血管内皮細胞のカドヘリン (VE カドヘリン)4,18. 共同 CD90、CD45、CD14、CD115、または α-平滑筋アクチン (α SMA) を発現する細胞が貪食、細菌およびde novo人間を形成することができない限られた増殖、潜在的な能力のため Epc をするとは見なされません船生体内で4,7。この資料では、プロトコルをソートの任意のセルを必要とせず人間の臍帯血から血管内皮前駆細胞の分離のための修正されたプロトコルについて説明します。この記事の負のインジケーターとして α SMA との肯定的なマーカーとして VEGFR2、CD34、CD31 を使いました。
この記事での分離及び細胞を使用して選別することがなく臍帯血由来の血管内皮前駆細胞を培養法特化成長因子 (EGM) と内皮増殖培を提案する.この EGM には、血管内皮増殖因子 (VEGF) と線維芽細胞成長因子 (FGF)、生存、増殖、および内皮細胞26の移行を強化が含まれています。セルの石畳の形態を維持するために責任があるアスコルビン酸も含まれていますインスリン様成長因子-1 (IGF-1 の)、血管新生と渡り鳥関数を提供します。成長因子の長期的な安定性の向上は、中型26ヘパリン。血管内皮細胞の培養液に追加他の成長因子には EGF26 に細胞の感受性を高める、ヒドロコルチゾンと分化、細胞増殖を刺激するのに役立ちます表皮の成長因子 (EGF) の補充が含まれています.この特定の成長媒体の使用の Epc 内皮細胞基本培地 (EBM) またはダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) と比較して高い数値を生成することを示す.

<table><tbody><tr><td>A) 分離および培養用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>ロンザ</td><td>CC-3162</td><td>この製品には、内皮成長培</td></tr>地胎児<tr><td>ウシ血清</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>ペンシルリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100x)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック サイエンティフィック イシューティフィック <td>10378016を作るために必要なすべての成長因子が付属しています</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Heatlhcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffer</td><td>Saline Thermofisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail I Collagen</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>Amresco</td><td>0714-500ML</td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック 25300054</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES バッファー</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ モディファイド イーグルス ミディアム</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>B) 抗体および細胞溶解物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>1:250希釈&nbsp; ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>用 CD34</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7045</td><td>1:100 ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>用希釈&α;-SMA</td><td></td><td>abcam ab5694</td><td>1:100 ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>用希釈&α;-tubulin</td><td>abcam</td><td>ab7291</td><td>1:2,500 ウェスタンブロッティング用</td></tr><tr><td>VEGFR2</td><td>abcam</td><td>sc504</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞溶解物</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc24709&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>バルブ間質細胞ライセート</td><td></td><td></td><td>初代細胞株を自身の研究室で培養し、RIPAバッファー</td></tr><tr><td>で溶解<ストロング>C) ウェスタンブロッティングおよび免疫染色</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x トリス/グリシン/SDSバッファー</td><td>Biorad</td><td>161-0772</td><td>ランニングバッファーとして使用</td></tr><tr><td>10x トリス/グリシンバッファー</td><td>Biorad</td><td>161-0771</td><td>トランスファーバッファーとして使用</td></tr><tr><td>Immobilon-FL転写膜</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL0010</td><td>これは、45 &micro;mの細孔のサイズは、ウェスタンブロット膜としてプロトコルに記載されています</td></tr><tr><td>4x Laemmli サンプルバッファー</td><td>Biorad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Biorad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>10% 基準 TGXプレキャストゲル</td><td>Biorad</td><td>5671033</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 退色防止</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36930</td><td>長期保存のための免疫染色カバースリップの取り付けに使用されます</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>VWR分析</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr></tbody></table>

ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

末梢血血管内皮前駆細胞 (Epc) の存在とその血管関与 Ashara と同僚1によって報告されました。後で、他の人は骨髄2,3から発信された Epc の類似の種類の存在を記載されています。最近では、ヨーダとイングラム臍帯血由来の Epc を示した可能性があった、高い増殖大人周辺から分離されたものと比較して血の4,5,6。生後の発生に関与しているから離れて Epc また組織設計血管や心臓弁構造7、8を作成するための細胞源として約束を示しています。様々 な隔離のプロトコルが存在、内皮細胞および造血のマーカーの助けを借りて、上記のソースから派生した単核細胞 (多国籍企業) のセルの並べ替えや養殖専門内皮増殖とこれらの多国籍企業を含むいくつか媒体、またはこれらの技術9の組み合わせ。ここでは、隔離のためのプロトコルを提案する、Epc を使用しての文化専門血管内皮成長因子、西部にしみが付くことを使用して隔離されたセルの特性評価に続いて immunosorting を使用せず培と免疫染色。

分離と血管内皮前駆細胞の拡張: 総合的なプロトコルを描いた模式図 (図 1) を提供します。次の密度勾配媒体でひと臍帯血の密度勾配遠心法別の血コンポーネント レイヤーが観察されました。コラーゲン治療プレートに多国籍企業を播種時にコロニーの副産物が最初日 5 と 7 (図 2A) の間観察されました。これらの植民地は成長を続け、石畳のような形状 (図 2E 2 階) に進んで後初期の段階で紡錘形細胞の形態 (図 2A 2 D) を持っていた。図 3A文化、時間対セルの合計数を示しています、各データ ポイント...

このプロトコルの目的は、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞を分離することです。一部のアプリケーションは虚血性疾患の治療、心血管のリスクを持つ患者を識別するためのバイオ マーカーとしてこれらの細胞を使用して、作成組織設計の血管や心臓の弁を構築あります。

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

この手順の全体的な目的は、ヒト臍帯血から血管内皮前駆細胞を単離することです。本手法では、血管グラフトの組織工学における自己細胞としての利用を目的とした、臍帯血からの血管内皮前駆細胞の単離について説明します。この手法の主な利点は、アミノソーティングを必要とせず、特殊な培地を用いて単離手順が行える点にあります。単離された血管内皮前駆細胞は新生血管形成の研究に利用でき、また、これらの細胞が心血管疾患のリスクがある患者を特定するためのバイオマーカーとして利用できることも報告されています。単離操作を開始する前に、6ウェルプレートの各ウェルに、調製したばかりのラットテールタイプIコラーゲン溶液を2 mLずつコーティングします。プレートを37 °C、5% CO2インキュベーター内で少なくとも1時間平衡化させます。次に、約25 mLの臍帯血をHBSSで1:1の濃度に希釈します。続いて、50 mLコニカルチューブに密度勾配分離用試薬を20 mL加え、希釈した臍帯血20 mLをチューブの壁面に沿って慎重に注入し、分離試薬の上に血液を層状に重ねます。遠心分離によって細胞を分離し、その後、血漿層を慎重に除去します。18ゲージの針を装着した注射器を用いて、単核球を含むバフィーコートを新しい50 milliliterチューブに回収します。そして、細胞に同容量の血管内皮細胞基礎培地を加えます。遠心分離により細胞を洗浄し、得られたペレットに5 milliliterの塩化アンモニウム溶液を氷上で加え、赤血球を溶血させます。時々振盪しながら5〜10分間放置した後、遠心分離で細胞を回収し、白いペレットを新鮮な内皮細胞増殖培地で再懸濁します。細胞数をカウントした後、6ウェルプレートの各ウェルからコラーゲンを吸引し、PBSで3回洗浄します。単核細胞を、1ウェルあたり培地2mLにつき1×10⁷ cellsの濃度で播種します。その後、プレートをインキュベーターに戻し、24時間培養します。翌日、新鮮な血管内皮細胞増殖培地で細胞を1回洗浄します。次に、洗浄液を3 mLの新鮮な血管内皮細胞増殖培地に交換し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。明視野顕微鏡を用いて、細胞の画像を毎日取得し、血管内皮細胞コロニーの進行状況をモニタリングするとともに、コロニーが出現したプレートに印を付けてその成長を追跡します。血管内皮細胞コロニーの大きさが約3 mmに達したとき、T25培養フラスコに新しいrat tail one collagenをコーティングし、細胞培養インキュベーター内で少なくとも1時間静置します。その後、細胞培養インキュベーター内で、ウェルあたり150 µLの0.05% Trypsin-EDTAを用いて2～3分間細胞を回収します。プレートを軽く叩いて、付着した細胞を剥離させます。細胞が剥がれ始めたら、直ちに2 mLの新鮮な血管内皮細胞増殖培地を加え、細胞を1本の15 mLコニカルチューブに回収します。遠心分離により細胞を回収し、ペレットを新鮮な血管内皮細胞増殖培地で再懸濁します。細胞数をカウント後、コラーゲンコートしたフラスコに、1フラスコあたり3 mLの培地を用いて5×10⁵ cellsの密度で播種し、フラスコに継代1代（passage one）と記載します。その後、フラスコをインキュベーターに戻し、コロニーが90%コンフルエントに達するたびに細胞を再播種します。コラーゲン処理したプレートに播種した後、通常5日から9日の間に最初のコロニーの成長が観察されます。コロニーは成長を続け、培養の初期段階では紡錘形の細胞形態を示し、その後、石畳状の形態へと変化します。各継代で回収される総細胞数は、総培養日数に正の相関を持って増加します。ウェスタンブロット分析により、培養された血管内皮細胞においてCD 31およびCD 34の早期発現が認められますが、これは継代を重ねるにつれて減少すると考えられます。しかしながら、血管内皮細胞増殖因子受容体2の発現は、初回継代後に観察されたレベルよりはわずかに低いものの、時間の経過とともに維持されます。注目すべき点として、内皮前駆細胞は間葉系細胞マーカーであるα-smooth muscle actinに対して陽性ではありません。これは、例えば陽性対照として含めることができる心臓弁間質細胞溶解物とは異なる点です。分離手順全体は、得られた臍帯血ユニットによって異なりますが、5時間以内に完了させることができます。単核細胞を分離し、血管内皮増殖培地に播種した後、通常5日から9日で培養液中にEPCコロニーが出現します。提案された分離法では、血管内皮前駆細胞の培養に特化した培地を使用しており、内皮マーカーの確認にフローサイトメーターを使用する必要がありません。また、この手法により、短期間で大量の血管内皮前駆細胞を効率的に取得することが可能です。このビデオを視聴することで、ヒト臍帯血ユニットから血管内皮前駆細胞を単離する方法について十分に理解できるはずです。ヒト臍帯血は有害である可能性があるため、廃血および細胞培養産物の適切な廃棄手順に従うことを忘れないでください。

isolation-endothelial-progenitor-cells-from-human-umbilical-cord

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオプロトコルは、ヒト臍帯からヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の単離と文化を示しています。一旦単離さこれらの細胞はまた、ヒューズの研究室で実証最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイなどのin...

ヒト臍帯静脈内皮細胞の単離（HUVEC）

このプロトコルは、間葉系幹細胞および実験的移植の目的のために自己のペアを生成するために動物血清を使用することなく、内皮コロニー形成細胞の分離とその後の展開について説明します。...

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（MSCs）と血管内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）の単離および動物血清自由膨張

内皮コロニー形成細胞（ECFCs）組み込み表示されていること、堅牢なクローン増殖能と血管内皮細胞を循環している...

ヒト臍帯血由来血管内皮コロニー形成細胞の表現型および機能解析

この記事は、最初の臍帯静脈からヒト内皮細胞を単離するための手順を説明した後、フロー条件下で好中球の遊出を調べるために、これらの細胞を使用する方法を示します。ガラスの光学特性を有するポリマーから作られた低容量のフローチャンバーを用いて、希少細胞集団の生細胞蛍光イメージングも可能です。...

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

ここでは、臍帯血から前駆体のサブセットB-細胞を単離するためのプロトコルを記述します。核酸の十分な量と質を細胞から抽出したDNAまたはRNAを利用して、その後のアッセイに使用することができる。...

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。...

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

このプロトコルは、少量の成体末梢血からの血液増殖内皮細胞(BOEC)の信頼性の高い生成と特性評価を可能にします。BOECは、血管障害患者の内皮細胞の代用として、また人工多能性幹細胞を作製するための基質として使用することができます。...

ヒト末梢血からの血液伸長内皮細胞の生成と文化

造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）は、まだ少しはいくつかの内皮細胞は、血液が形成になることを指定するプロセスについて知られている、開発中に特殊な（造血）内皮細胞に由来します。我々は、マウス胚組織から造血内皮細胞およびHSPCの同時分離を可能にするフローサイトメトリーベースの方法を示しています。...

マウス胚性造血内皮細胞の単離

内皮前駆細胞（EPC）が決定的に虚血組織の血管新生に関与しています。この方法は、末梢血由来のヒトEPCの単離、ならびに心臓手術患者の血清サンプルに対する彼らの渡り鳥の可能性の同定を記載します。...

健康なボランティアからの内皮前駆細胞の単離および心臓手術後の血清試料の影響を受け彼らの渡り鳥の可能性

ここで、ex は説明 cd34 陽性から造血幹細胞の体外増幅+臍帯血由来の細胞は、サイトカイン カクテルとバルプロ酸の併用治療します。このメソッドは、いずれかのプリミティブの HSCs...

ひと臍帯血由来 cd34 陽性造血幹細胞の体外増幅+細胞を用いたバルプロ酸

ここでは、4つの骨髄系統に対する臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞の免疫発食特性特性およびサイトカイン誘導分化のためのプロトコルを提示する。このプロトコルの応用には、CD34+細胞の骨髄性分化に対する骨髄疾患変異または小分子の影響に関する調査が含まれる。...

ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化

学ぶ ヒト臍帯血由来血管内皮前駆細胞の分離法。専用培地を用いフローサイトメーター不要で効率的に細胞を取得でき、心血管疾患リスクのバイオマーカー研究や血管組織工学への応用が可能です。

ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離

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