遺伝子組み換え細菌細胞における標的酵素発現の検出

まずは遺伝子組み換え細菌細胞を含むチューブから始めます。各細菌は高コピーのフォスミドを持ち、さまざまな酵素をコードしています。

チューブを振ってキュベートし、さまざまな細胞内酵素の発現を促進します。

試験管に標的酵素特異的な基質を加え、対照チューブに同量の緩衝液を加えます。

振って孵化させてください。基質は細胞内に入り、標的酵素がそれを切断して蛍光生成物を生成します。

制御チューブをあらかじめ校正済みのフローサイトメーターに装填します。

各セルがレーザービームを通過する際、光が散乱します。散乱図を作成して、塊よりも光の散乱が少ない単一セルを特定します。

細胞塊を除外し、単一細胞の蛍光信号をプロットして基準蛍光を確立します。

基質処理済みのチューブをフローサイトメーターに入れて蛍光信号を測定します。

基質処理細胞で対照細胞に比べて蛍光信号が増加すると、標的酵素の発現が確認されます。

対象のメタゲノム酵素をスクリーニングするために、選別した細胞を37度摂氏、200回転分でOD₆₀₀ が0.5に達するまで培養します。次に、細胞内フォスミドのコピー数を増幅するために1マイクロリットルのコピー誘導液を加えます。

37度・250回転で3時間後、細胞の0.5ミリリットルを適切な基質と14ミリリットルの丸底管で結合し、最終濃度100マイクロモルにします。その後、対照サンプルと実験サンプルを37度摂氏、200回転分の温度でさらに3時間培養します。

サンプルが揺れている間に、先ほど示したようにFACSマシンのパラメータを設定してください。次に、各サンプルから5マイクロリットルの細胞を、PBS1ミリリットルを含む5ミリリットルの丸底チューブに加えます。次にサンプルセルを読み込み、イベントレートを1000〜3000イベント/秒に設定します。

対数スケールの前方散乱領域と対数スケールの側散乱面積散乱プロットを作成し、R1散乱ゲートを調整してシングレットイベントの細菌細胞を包含させます。次に、対数スケールの前方散乱と対数スケールのFITC面積散乱図を作成し、R2ソートゲートを設定して、ネガティブセルの検出率が0.1%未満に抑えられるようにします。次にサンプルチューブをロードし、必要に応じてイベントレートを1000〜3000イベント/秒に再調整します。