Name: Adenovirally形質分離されたげっ歯類膵島におけるレプリケーションおよびβ細胞機能を評価する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶ アデノウイルスベクターを用いたラット膵島のレプリケーションとβ細胞機能評価法。遺伝子発現操作によりインスリン分泌とDNA合成を測定し、糖尿病治療の標的となるシグナル伝達経路を同定する。

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1。ラット膵島のアデノウイルス形質導入と培養<ol><li>必要な数にメディアの2ミリリットル（8 mMグルコース、10％ウシ胎児血清、50ユニット/ mlペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地）を添加することにより、6ウェル非組織培養コーティングしたプレートを準備します。井戸。無ウイルスの制御のためのそれぞれ、ウイルス制御（例えば、GFPを発現するアデノウイルス）、および実験群 - 例えば、典型的な実験は、3つのウエルが必要な場合があります。 </li><li>少なくとも30分間組織培養インキュベーターにそれを置くことによって37℃にプレートを温める。 </li><li>すぐに6ウェル非組織培養コーティングしたプレートの各ウェルに、ラットの膵島分離18,19、場所100から200島を後に。シックス膵島インスリン分泌とチミジン取り込みアッセイに必要とされる。残りの島は、遺伝子発現の研究​​や免疫ブロット法のためのタンパク質分離のためのRNAの分離に使用することができます。 </li></ol> [注：この時点から、バイオハザード物質の取扱い、使用、廃棄のための制度のプロトコルに従ってください。] <ol start="4"><li>優しくスワールウェルの中央に島をもたらすプレート。 </li><li>皿の中央にある小島に直接アデノウイルスをピペット。感染症の100から500多重度（MOI、ウイルスのプラーク形成単位に標的細胞の比）を使用します。 </li><li> 5分間島の残りをしましょう​​。 </li><li>組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）のプレートを置きます。 </li><li> 24時間後、優しくスワールプレートのウェルの中心に島を持ってきても新鮮な培地を含む新しいP200にマイクロピペットを用いて膵島を転送することができます。島がプレートに取り付けられなくなった場合、それらは静かにピペットチップで外れすることができます。 </li></ol> [注：適切な伝達すると効率を確認するには島はその後、膵島コアにアデノウイルスの侵入を確認するには、共焦点顕微鏡を介して撮像することができるようにCY、コントロールウイルスを発現するGFPの使用は、有益である。] <ol start="9"><li>最適化のパイロット研究から実験の所望のタイミングに応じて追加の24〜72時間の培養では、膵島、。たとえば、増殖反応の誘導は、目的の遺伝子の24〜72時間またはノックダウンに至るまで時間が48時間または72時間が必要になる場合がありますが必要な場合があります。毎日新鮮なメディアへの膵島を転送します。 </li><li>実験の最後の24時間、文化1μCiの[メチル- 3 H] -thymidine/mlメディア（一般的には1μlのチミジン/ mlのメディア）を含むメディアの小島。 </li></ol> [注：この時点から、放射性物質の取扱い、使用、廃棄のための制度のプロトコルに従ってください。] 2。インスリン分泌アッセイ<ol><li>準備する分泌アッセイバッファー（SAB）10Xストック溶液（1.14 MのNaCl、47 mMの塩化カリウム、12mMのKH 2 PO 4、11.6 mMのMgSO 4）し、CaCl 2の 100Xストック溶液（0.25MのCaCl 2）。これらのストック溶液は、前もって準備し、室温で保存することができます。 </li><li>新鮮で作業SAB（10X SAB、1 MのHEPES、100XのCaCl 2 0.5mlの35％BSA、0.11グラムのNaHCO 3 0.28ミリリットルの1ミリリットルと、滅菌水に50ミリリットルの5 mL）中の50ミリリットルを準備50 mlコニカルチューブと37℃の水浴中で配置することにより、37°C​​に暖かい。 </li><li>ピペットで15 mlのコニカルチューブに作業SABの10mlと高グルコース（16.7 mM）のSABを準備する2.5 M D-グルコースの66.8μlを追加します。 </li><li>低グルコース（2.8 mM）のSABを準備する作業SABの残りの40 mlの2.5 M D-グルコースの44.8μlを添加します。 </li><li>ラベル6ウェルプレートの各ウェルの3つの1.7 mlマイクロチューブおよびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）1 mlを加える。 </li></oL&gt; [注：小島は放射性であるので、放射性物質の取扱い、使用、廃棄のための制度のプロトコルに従ってください。] <ol start="6"><li>それぞれのマイクロ遠心チューブに20の島を配置します。各遠心管に比較的大型の膵島を追加するには、あらゆる試みを行います。たとえば、各チューブは、5小、10中期、5大型の膵島（ 図1を参照）を含めることができます。 </li></ol> [注：ランゲルハンス島では、解剖立体または標準的な顕微鏡のいずれかを使用して可視化することができます。] <ol start="7"><li>膵島は重力（〜2分）でチューブの底に定住した後、マイクロピペットでPBSを吸引除去し、廃棄します。 </li></ol> [注：重力により沈降する代わりに、チューブは1分間300×gで遠心分離することができます。] <ol start="8"><li>プレインキュベーションのために、低GLU 400μlのCOSE SABは、組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）にチューブを（それらのキャップを開いた状態）に置き、60分間プレインキュベートします。プレインキュベーション低グルコースSABと廃棄を吸引除去する。 </li><li>基礎インスリン分泌、低血糖SAB 400μlを加えるために、組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）にチューブを（それらのキャップを開いた状態）に置き、60分間インキュベートします。低グルコースSABを収集し、インスリンラジオイムノアッセイのために保存します。 </li><li>刺激インスリン分泌については、高グルコースSAB 400μlを加え、組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）にチューブを（それらのキャップを開いた状態）に置き、60分間インキュベートします。高グルコースSABを収集し、インスリンラジオイムノアッセイのために保存します。 </li></ol> 3。チミジン取り込みアッセイ<ol><li>小島は重力によってチューブの底に定住した後、破棄され、マイクロピペットでPBSを吸引除去し、これを繰り返し、1 mlのPBSを追加します。一度ステップ実行します。 </li><li> 500μlの氷冷トリクロロ酢酸（TCA、10％w / v）の追加し、氷上で30分間インキュベートします。 </li><li> 4℃で3分間16 000 XG℃でチューブを遠心</li><li> TCAを吸引し、0.3 N NaOHの80μlを加え、室温で30分間インキュベートする。この間、5〜10秒間激しくボルテックスサンプルごとに10分。 </li><li> 7ミリリットルの液体シンチレーション計数管にエコノセーフ計数カクテルの4ミリリットルを追加します。 </li><li>シンチレーション計数管に試料の50μlを添加し、チューブのキャップを簡単に振ると、液体シンチレーションカウンターでカウントします。 </li><li>製造元のプロトコールに従ってビシンコニン酸（BCA）アッセイとサンプル10μlを用いてタンパク質濃度を測定します。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>製造業者のプロトコルに従ってインスリンラジオイムノアッセイを実行します。 </li><li>タンパク質の濃塩酸でインスリン分泌とチミジンの取り込みデータを正規化するentration。 </li></ol> 5。代表的な結果ラット膵島 ​​では膵島複製およびβ細胞機能を評価する実験の例を図2に示されています。この例では、架空の &quot;ジーン＃6&quot;そのアデノウイルスの過剰発現を示しています。確実にβ細胞機能を変更せずに膵島複製を刺激する。トップパネルには、チミジン取り込みアッセイの結果から、 &quot;遺伝子第6位&quot;の発現を増加させるようにチミジンの取り込みによって測定しDNA合成を増加させることを示している。ラット膵島の細胞のほとんどがβ細胞であるので、チミジンの取り込みの増加は、β細胞複製の増加を示している可能性があります。しかし、確証実験はしっかりとこれを確立するために実行する必要があります。下部のパネルに、インスリン分泌アッセイからの結果は &quot;遺伝子＃6&quot;の過剰発現を示して私は、すなわち、主なβ細胞の機能のいずれかを変化させなかった低域と高グルコースでnsulin分泌。アデノウイルスによる治療後に膵島の膵島分離と健康の質が低く、高グルコース濃度でのインスリン分泌倍に増加によって示されます。 &quot;ジーン＃6&quot;障害β細胞機能の発現を増加させる場合、これは可能性が高く、刺激グルコース濃度（16.7 mm）で分泌されるインスリンの減少として反映されます。グルコース濃度を変化させるための用量反応曲線も行うことができます。 <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig1.jpg" alt="図1"/> 図1遺伝子発現のアデノウイルス媒介性の変化を以下の単離ラット膵島 ​​膵島複製およびβ細胞機能を評価するためのプロトコルの概要。新たに単離したラット膵島を24時間アデノウイルスにさらされ、その後96時間まで培養されています。チミジン取り込みにおけるインスリン分泌の測定に続いて、最後の24時間で評価される低および高グルコース。 <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig2.jpg" alt="図2"/> 図2コントロールアデノウイルスおよびアデノウイルスを過剰発現する&quot;遺伝子第6位&quot;としてラベル付けされ架空の遺伝子を用いた実験からの結果。上部パネルには、インスリン分泌をチミジンの取り込みとボトムパネルを示しています。

<ol><li>Ferrannini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Cell+function+in+subjects+spanning+the+range+from+normal+glucose+tolerance+to+overt+diabetes%3A+a+new+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).</li>
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<li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53, 149-159 (2004).</li>
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<li>Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+hexokinase+I+in+isolated+islets+of+Langerhans+via+recombinant+adenovirus.+Enhancement+of+glucose+metabolism+and+insulin+secretion+at+basal+but+not+stimulatory+glucose+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels.</a> J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).</li>
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<li>Csete, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+to+pancreatic+islets+mediated+by+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors.</a> Transplantation. 59, 263-268 (1995).</li>
<li>Meng, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+liver+X+receptors+inhibits+pancreatic+islet+beta+cell+proliferation+through+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest.</a> Diabetologia. 52, 125-135 (2009).</li>
<li>Ronnebaum, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyruvate+cycling+pathway+involving+cytosolic+NADP-dependent+isocitrate+dehydrogenase+regulates+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion.</a> J. Biol. Chem. , (2006).</li>
<li>Milburn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cells+in+obesity.+Evidence+for+induction+of+functional%2C+morphologic%2C+and+metabolic+abnormalities+by+increased+long+chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids.</a> J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).</li>
<li>Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Islet+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Islet Isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

複製を刺激し、β細胞の機能を強化するために調節することができる確立する経路は、糖尿病の両方の主要な形態に関連しています。機能β細胞塊は、これらの決定を評価し、インスリン分泌細胞の存在と機能に依存しているため、同時にその利点を持っています。このプロトコルは、タンパク質の過剰発現または抑制し、in vivoでの有効性をテストすることができ、in vitroで機能的なβ細胞量の変化につながるかどうかを識別するために合理化されたプロトコルについて説明します。 このプロトコルの1つの制限は、膵島を含む多くの細胞型から構成される微小器官ですが、アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、およびPP細胞に限定されないということです。ラット膵島の細胞の80-90％がβ細胞であるため、膵島のレプリケーションの変更が完全にβ細胞の複製の変化に翻訳することはできません。膵島における可能性、その観測された変化レプリケーションは、複製が存在する非β細胞によるものである。したがって、このプロトコルには、論理的確証次のステップでは、免疫蛍光またはFACS分析5,6</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> RPMI 1640培地</td><td>ギブコ</td><td> 11879 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td> BD-ファルコン</td><td> 35から1146 </td><td>非TC扱わ</td></tr><tr><td> [メチル- 3 H] -チミジン</td><td>パーキンエルマー</td><td> NET027Z001MC </td><td> 1 mCiの/ mlの</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>デンヴィル</td><td> C2170 </td><td> 1.7ミリリットル</td></tr><tr><td> NaClを</td><td>シグマ</td><td> 59888 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>アクロス</td><td> 42409 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 &lt;/ SUB&gt; PO 4 </td><td>アクロス</td><td> 20592 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4で </td><td>アクロス</td><td> 41348 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2を </td><td>アクロス</td><td> 34961 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H0887 </td><td> 1 M溶液を</td></tr><tr><td> 35パーセントBSA </td><td>シグマ</td><td> A7979 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3を </td><td>アクロス</td><td> 42427 </td><td></td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td>シグマ</td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> TCA </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> SA9410-1 </td><td>の10％w / vの</td></tr><tr><td> NaOHで</td><td>アクロス</td><td> 12426 </td><td></td></tr><tr><td>シンチレーション計数管</td><td>ザルスタット</td><td> 58.536 </td><td> 7ミリリットル、PP </td&gt; </tr><tr><td>シンチレーション計数管のキャップ</td><td>ザルスタット</td><td> 65.816 </td><td></td></tr><tr><td>エコノセーフカウントカクテル</td><td> RPI </td><td> 111175 </td><td></td></tr><tr><td>インスリンRIA </td><td>ジーメンス</td><td> TKIN2 </td><td></td></tr><tr><td> BCAアッセイキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 23250 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5415R </td><td></td></tr><tr><td>シンチレーション計数管ラック</td><td>ザルスタット</td><td> 93.1431.001 </td><td></td></tr><tr><td>液体シンチレーションカウンター</td><td>パーキンエルマー</td><td>トライ炭水化物2910TR </td><td></td></tr></tbody></table>

adenovirally形質分離されたげっ歯類膵島におけるレプリケーションおよびβ細胞機能を評価する

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

グルコース恒常性は、主にそれぞれ、膵臓のβとα細胞から分泌され、内分泌ホルモンのインスリンとグルカゴンによって制御されます。機能β細胞塊を解剖ベータ細胞塊など栄養素の負荷に対応するβ細胞の能力によって決定されます。機能β細胞量の減少は、糖尿病1-3の両方の主要な形態の中心となります。 1型糖尿病の自己免疫攻撃から減少し、機能β細胞塊の結果に​​対し、2型糖尿病では、この減少は、適切なインスリンを分泌するβ細胞の無力とメカニズムの幹部からベータ細胞の破壊の両方から開発しています。従って、機能β細胞量を復元するための努力は、より良い治療と糖尿病の潜在的な治療に最も重要なことです。 努力は複製を刺激し、β細胞の機能を強化するために悪用される可能性が分子経路を特定するために進行中です。理想的には、治療の目標は、β細胞の増殖と機能の両方を向上させるだろう。しかしおそらくもっと重要なβ細胞の増殖を刺激する戦略は、β細胞機能（例えば、いくつかの遺伝子と同様に）、およびその逆を損なうことの代償かどうかを識別することである。 単離したラット膵島 ​​における標的遺伝子の発現を体系的に抑制または過剰発現することによって、人が増えて、機能のベータ細胞塊4-6の潜在的な治療標的を識別することができます。アデノウイルスベクターは、単離されたラット膵島​​4,7-15で効率的に過剰発現やノックダウンの蛋白質に用いることができる。ここでは、アデノウイルス形質導入を利用して遺伝子発現を操作し、膵島の複製と分離されたラット膵島 ​​のβ細胞機能（ 図1）を評価する手法を提案する。このメソッドは、β細胞の複製または関数5,6,8,9,16,17を調節する新たな標的を識別するために以前に使用されています。

このプロトコルは1つが糖尿病の治療のための潜在的な治療標的を見つけるために機能的なβ細胞量を調節する因子を同定することができます。プロトコルは、アデノウイルスによる遺伝子発現の操作後に膵島の複製と分離されたラット膵島のβ細胞機能を評価するための効率的な方法で構成されています。

Adenovirally形質分離されたげっ歯類膵島におけるレプリケーションおよびβ細胞機能を評価する

血糖恒常性は、主に膵臓のβ細胞およびα細胞から分泌される内分泌ホルモンであるインスリンとグルカゴンによって制御されており、...

本手順の目的は、機能的なβ細胞量の変化を調節するシグナル伝達経路を特定することである。これは、アデノウイルスベクターを用いて特定の遺伝子を過剰発現または抑制させることで、単離したラット膵島において達成される。この操作の後、インスリン分泌によるβ細胞機能の評価、およびトリチウム標識チミジンの取り込み量による膵島増殖の測定を行う。最終的に、これらのアッセイにより、目的の遺伝子がin vitroでβ細胞の増殖および／または機能を調節しているかを確認できます。この手法は、シグナル伝達経路の特定の構成要素がβ細胞の増殖と機能に影響を与えるかなど、眼瞼生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。6ウェル非組織培養コーティングプレートを用意し、必要な数のウェルに2 mLの改変培地を添加します。例えば、典型的な実験では、ウイルス陰性コントロール、ウイルスコントロール、および実験群のそれぞれに1ウェルずつ、計3ウェルが必要となります。プレートを組織培養インキュベーターに入れ、37 °Cで少なくとも30分間温めておきます。ラット眼球の分離直後、準備したプレートの各ウェルに1〜200個の眼球を配置します。60個の眼球は生化学的アッセイに使用し、残りの眼球は遺伝子発現解析または免疫ブロッティングに使用できます。プレートを静かに揺らし、眼球を各ウェルの中心に集めます。その後、直ちにアデノウイルスをディッシュの中央にあるアイレットの上に直接ピペットで滴下します。目的タンパク質の過剰発現またはノックダウンにおけるアデノウイルスの有効性に応じて、感染多重度（MOI）を1〜500の範囲で使用してください。アデノウイルスの眼瞼深部への効率的な浸透により、結果の再現性が向上します。眼瞼を分離させた直後に導入を行うことが不可欠です。プレートを5分間静置した後、インキュベーターに移して24時間培養します。翌日、プレートをインキュベーターから取り出し、アイレットをウェルの中心まで緩やかに膨張させます。200 µL マイクロピペットを使用して、アイレットを新鮮な培地を含む新しいウェルに転送します。アイレットがプレートに付着した場合は、ピペットチップでそっと剥がしてください。共焦点顕微鏡を用いてアデノウイルスがアイレットコア培養に浸透しているかを確認し、GFPを発現するコントロールウイルスを使用して、十分な導入効率が得られているか検証することが有用です。培地を毎日交換しながら、アイレットをさらに1〜3日間培養します。培養時間はパイロットスタディによって最適化する必要があり、実験目的によって異なります。最後の24時間は、培地1 mLあたり1 µCiの濃度でトリチウム標識チミジンを培地に添加します。まず、50 mLコニカルチューブに50 mLのSABワーキングソリューションを調製し、37 °Cの恒温水槽で温めます。15 mLコニカルチューブに10 mLのSABワーキングソリューションをピペットで分注し、2.5 M D-グルコースを66.8 µL加えます。高グルコースSABを調製するには、残りの40 mLのSABワーキングソリューションに2.5 M D-グルコースを44.8 µL加えます。次に、低グルコースSABを調製するため、1.7 mLマイクロ遠心チューブ3本にラベルを貼ります。6ウェルプレートの各ウェルに対し、各チューブに1 mLのPBSを加えます。放射性標識された眼球の取り扱いおよび廃棄に関する施設内プロトコルに従うことを忘れないでください。実体顕微鏡または標準的な顕微鏡を用いて、大きさがほぼ同等の眼球を20個選択し、各マイクロ遠心チューブに転送します。例えば、各チューブに小サイズ5個、中サイズ10個、大サイズ5個のアイルレットを含めることができます。実験の最後に全タンパク質含有量で結果を標準化しますが、群間でアイルレットのサイズを一致させることが極めて重要です。重力または遠心分離によってアイルレットをチューブの底に沈殿させた後、マイクロピペットでPBSを吸引して重量を測定し、その後、生化学的アッセイに向けてアイルレットの調製に進みます。インスリン分泌アッセイに向けてアイレットを調製するため、まず低グルコースSABでプレインキュベートする必要があります。この操作を行うには、チューブに低グルコースSABを400 µL加え、キャップを閉めた状態で組織培養インキュベーターに入れます。60分後、プレインキュベーションに使用した低グルコースSABを吸引して除去します。基礎インスリン分泌量を測定する場合、このプレインキュベーションの手順を繰り返します。ただし、刺激インスリン分泌量を測定する場合は、低グルコースSABの代わりに400 µLの高グルコースSABを使用します。前述と同様に、高グルコースまたは低グルコースSABでインキュベートした後、アイレットを60分間インキュベートし、インスリンラジオイムノアッセイ（製造元のプロトコルに従って実施）用のSABを吸引回収します。その後、同じアイレットを用いてチミジン取り込みアッセイに進みます。インスリン分泌アッセイに使用した直後のアイレットから開始してください。PBSを1 mL加え、アイレットを重力で沈降させます。その後、マイクロピペットでPBSを吸引します。これを廃棄し、同様の操作をもう一度繰り返します。次に、氷冷したトリクロロ酢酸を500 µL、アイレットに加えて、氷上で30分間インキュベートします。チューブを4 °Cで遠心分離します。その後、吸引してTCAを除去します。次に、0.3 N 水酸化ナトリウムを 80 µL 添加し、アイレットを室温で 30 分間インキュベートします。このインキュベーションの間、10 分ごとに 5～10 秒間、サンプルを激しくボルテックスします。並行して、7 mL 液体シンチレーション計数管に Conno Safe カウンティングカクテルを 4 mL 添加します。アイレットのインキュベーションが終了したら、アイレット 50 µLをシンチレーションチューブに加えます。キャップをしたチューブを軽く振り、液体シンチレーションカウンターでサンプルの放射能を測定します。また、タンパク質濃度を測定するために、10 µLのバイアルを市販のbionic acid assayに移し、製造元のプロトコルに従って操作してください。後のデータ解析において、記載されたプロトコルに従い、結果をタンパク質濃度で標準化します。アイレットの複製とβ細胞機能について。ラットのアイレットにおいて評価したところ、仮想遺伝子6のアデノウイルスによる過剰発現は、β細胞機能を変化させることなく、アイレットの複製を強力に刺激しました。遺伝子sixの発現が増加し、ラット膵島細胞の大部分がβ細胞であるため、チミジンの取り込み量で測定されるDNA合成が増加しました。さらなる実験により、このチミジン取り込みの増加がβ細胞の複製増加によるものであることを示す可能性があります。インスリン分泌アッセイにより、遺伝子sixの過剰発現は、低血糖および高血糖時におけるβ細胞の主要な機能の一つであるインスリン分泌を変化させないことが示されました。低濃度および高濃度のグルコースにおけるインスリン分泌の増加は、アデノウイルス処理後の膵島の健全性を反映しています。もし遺伝子6の発現上昇がβ細胞機能を損なうのであれば、それは高濃度の刺激グルコースにおけるインスリン分泌の減少として現れると考えられます。このビデオを視聴することで、特定の遺伝子がβ細胞の増殖や機能に影響を与えるかどうかを判断するための、β細胞の複製およびインスリン分泌の測定方法について十分に理解できるはずです。

assessing-replication-beta-cell-function-adenovirally-transduced

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

我々は、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（HDAd）と高血糖の反転を用いた遺伝子Neurogenin3の転送（Ngn3）とベータセルリン（BTC）によりSTZにおける肝ネオ膵島形成（ストレプトゾトシン）誘発糖尿病マウスを記述します。我々の方法は、生体内伝達および長続きが遺伝子発現におけるそれらの高効率を持つヘルパー依存型アデノウイルスベクターの機能を活用できます。...

ヘルパー依存型アデノウイルスベクターによる遺伝子導入による糖尿病マウスの肝臓におけるネオ·膵島形成

ランゲルハンス単離したマウスの膵島を用いたin vitroβ細胞機能をアッセイすることは、糖尿病の病態と治療薬の研究に重要な要素である。多くの下流のアプリケーションが利用可能であるが、このプロトコルは、具体的にはβ細胞機能を決定する本質的なパラメータとして、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の測定を記載する。...

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

ここでは、2型糖尿病のマウスモデルから膵島を分離するためのプロトコル、Leprdb、および2光子顕微鏡を利用した無傷の膵島からのインスリン分泌を測定するための生細胞アッセイの詳細を紹介します。...

LEPR<sup&gt; DB</sup&gt; 2型糖尿病のマウスモデル：無傷の膵島の膵島単離およびライブセル2光子イメージング

自己再生および成体マウスの膵臓から単離された前駆細胞の分化を検出するためのインビトロコロニーアッセイに考案されています。これらのアッセイでは、膵臓前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で3次元空間での細胞コロニーを生じます。単一細胞、個々のコロニーの特徴を処理するためのプロトコルが記載されています。...

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

糖尿病研究分野のための重要な課題は、膵島β細胞の複製を調節する分子機構を理解し、β細胞の再生を刺激するための方法を開発することです。本明細書中の小分子のβ細胞の複製を促進する活性を同定および評価するためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。...

ハイコンテンツ<em&gt;インビトロ</em&gt;膵島β細胞の複製ディスカバリー・プラットフォーム

ここでは、興味を含んだポリ(lactic-co-glycolic...

無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与<em&gt; ex vivoで</em&gt;生分解性ポリ（乳酸-co-グリコール酸）微小球を使用して

短いヘアピンRNA(shRNA)を運ぶレンチウイルスによってトランスネクションされた分散ヒトイストレット細胞から遺伝子改変ヒト擬似を作成するプロトコルが提示される。このプロトコルは、容易に入手可能な酵素および培養容器を利用し、容易に行うことができ、機能的および形態学的研究に適した遺伝子改変ヒト擬似性を産生する。...

低アタッチメントプレートで調製されたヒト擬似スイスレットにおけるレンチウイルス媒介遺伝子サイレンシング

このプロトコルの目的は、ヒト膵島の生着プロセスと寄与する宿主対ドナー細胞のダイナミクスを継続的に監視することです。これは、NODの眼の前房(ACE)にヒトの小島を移植することによって達成される。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-Rag2-/-マウスの受信者に続いて2光子イメージングを繰り返す。...

前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

このプロトコルは循環アデノシンの一リン酸塩(cAMP)の生物センサー、 その場 (cADDis)のcAMPの相違の探知器のアデノウイルス配達を使用して細胞内シグナリングでき事およびインシュリンおよびグルカゴンの分泌およびmicroperifusionシステムの同時獲得そしてco登録のための方法を記述する。...

蛍光バイオセンサーの動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価のためのヒト偽島システム

このプロトコルは、ルイスラット膵島の外科的収穫、酵素的消化、密度勾配精製のための標準化された方法を説明し、移植や in vitro...

酵素による消化および密度-勾配分離を用いたルイスラットからの膵島の分離と精製

学ぶ アデノウイルスベクターを用いたラット膵島のレプリケーションとβ細胞機能評価法。遺伝子発現操作によりインスリン分泌とDNA合成を測定し、糖尿病治療の標的となるシグナル伝達経路を同定する。

Adenovirally形質分離されたげっ歯類膵島におけるレプリケーションおよびβ細胞機能を評価する

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