Adenovirally形質分離されたげっ歯類膵島におけるレプリケーションおよびβ細胞機能を評価する

この手順の全体的な目的は、機能的なベータ細胞量の変化を調節するシグナル伝達経路を特定することです。これは、単離されたラットアイレットで、アデノウイルスベクターを使用して遺伝子の発現を過剰発現または抑制することによって達成されます。この操作後、ベータ細胞の機能は、トリチウム化チミジン取り込みによって測定されるインスリン分泌とアイレット複製によって評価されます。

最終的に、これらのアッセイは、目的の遺伝子がベータ細胞の増殖を調節し、in vitroで機能するかどうかを示すことができます。この方法は、シグナル伝達経路の特定の成分がベータ細胞の成長と機能に影響を与えるかなど、まぶた生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。必要なウェル数に2ミリリットルの改変培地を添加して、6ウェルの非組織培養コーティングプレートを調製します。

例えば、典型的な実験では、3つのウェル(それぞれ1つはウイルスなしコントロール用、ウイルスコントロール用)が必要であり、実験グループは、組織培養インキュベーター内でプレートを少なくとも30分間摂氏37度に温めます。ラットアイレット単離の直後に、調製したプレートの各ウェルに1〜200個のアイレットを配置します。60個のアイレットは生化学的アッセイに使用され、残りのアイレットは遺伝子発現の研究または免疫ブロッティングに使用でき、プレートを穏やかに膨らませてアイレットをそれぞれの中央に持ってくることができます。

その後、すぐにアデノウイルスをアイレットに直接ピペットで移します。皿の中央に。アデノウイルスの有効性に応じて、1〜500の感染の多様性を使用し、目的のタンパク質を過剰に発現またはノックダウンします。

アデノウイルスがまぶたの芯部まで効率的に浸透することで、結果の一貫性が向上します。まぶたの直後にまぶたを形質転換します。分離は不可欠です。

プレートを5分間邪魔しないでから、24時間インキュベーターに移動します。翌日、インキュベーターからプレートを取り外し、アイレットをウェルの中心まで静かに膨らませます。200マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、アイレットを新鮮な培地を含む新しいウェルに移します。

アイレットがプレートに付着した場合は、ピペットチップでアイレットをそっと外すことができます。GFPを発現するコントロールウイルスを使用して、共焦点顕微鏡を使用してアデノウイルスの膵島コア培養への浸透を視覚化することにより、適切な形質導入効率を確認することが有用です。さらに1〜3日間、メディアを毎日交換します。

培養時間は、パイロット研究によって最適化する必要があり、実験目標によって異なります。最後の24時間、トリチウム化チミジンを培地1ミリメートルあたり1マイクロキュリーの濃度で培地に組み込みます。まず、50ミリリットルのコニカルチューブに50ミリリットルの作業用SABを新たに準備し、摂氏37度の水浴で温めます。

10ミリリットルの作業用SABを15ミリリットルの円錐管にピペットで移し、66.8マイクロリットルの2.5モルDグルコースを追加します。高グルコースSABを調製するには、44.8マイクロリットルの2.5モノロDグルコースを残りの40ミリリットルの作業用SABに加えます。低グルコースSABを準備するには、次に3つの1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブをラベル

6ウェルプレートの各ウェルについて、各チューブに1ミリリットルのPBSを追加します。放射性アイレットの取り扱いと廃棄に関する制度上のプロトコルに従うことを忘れないでください。ステレオスコープまたは標準的な顕微鏡を使用して、20個の同等のサイズのアイレットを選択し、各マイクロ遠心チューブに移します。

たとえば、各チューブには、5 つの小、10 の Medium、および 5 つの大サイズのアイレットを含めることができます。結果は実験の最後に総タンパク質含有量に正規化されますが、グループ間のアイレットのサイズを一致させることが重要です。アイレットを重力または遠心分離によってチューブの底に沈殿させた後、吸引し、マイクロピペットでPBSを秤量し、生化学的アッセイのためのアイレットの準備に進みます。

インスリン分泌アッセイ用のアイレットを調製するには、まずアイレットを低グルコースSABと事前にインキュベートする必要があります。これを行うには、400マイクロリットルの低グルコースSABをチューブに加え、キャップをかぶった状態で組織培養インキュベーターに1時間後の60分間、インキュベーション前の低グルコースSABを吸引して、基礎インスリン分泌を測定する。インキュベーション前の手順を繰り返します。

ただし、刺激されたインスリン分泌を測定するには、低グルコースSABの代わりに400マイクロリットルの高グルコースSABを使用し、以前と同様に、インキュベート後60分間アイレットを高グルコースSAB吸引液または低グルコースSABとインスリンラジオイムノアッセイ用のSABでインキュベートします。次に、同じアイレットのコレクションを使用してチミジン取り込みアッセイを進めます。インスリン分泌アッセイに使用したばかりのアイレットから始めます。

1ミリリットルのPBSを追加し、アイレットが重力によって落ち着くのを待ちます。次に、マイクロピペットでPBSを吸引します。破棄して、この手順をもう一度繰り返します。

次に、500マイクロリットルの氷冷トリクロロ酢酸をアイレットに加え、氷上で30分間インキュベートします。チューブを摂氏4度で遠心分離します。次に、願望、TCAを破棄します。

次に、80マイクロリットルの0.3正常水酸化ナトリウムを加え、アイレットを室温で30分間インキュベートします。このインキュベーション中、10分ごとに5〜10秒間、サンプルを激しくボルテックスします。並行して、4ミリリットルのconnoセーフカウンティングカクテルを7ミリリットルの液体シンチレーションカウンティングチューブに追加します。

アイレットのインキュベーションが終了したら、50マイクロリットルのアイレットをシンチレーションチューブに追加します。キャップ付きのチューブを短時間振って、液体シンチレーションカウンターでサンプルの放射能を測定します。また、タンパク質濃度を測定するには、10マイクロリットルのヴィラスを市販のバイオニック酸アッセイに移し、メーカーのプロトコルに従います。

その後のデータ解析中に、記載されたプロトコルを使用して結果をタンパク質濃度に正規化します。アイレット複製とベータ細胞機能。ラットのアイレットでは、仮説的な遺伝子6のアデノウイルス過剰発現が評価され、ベータ細胞の機能を変化させることなくアイレットの複製が強力に刺激されました。

遺伝子6の発現の増加、ラットアイレット内の細胞のほとんどがベータ細胞であるため、チミジンの取り込みによって測定されるDNA合成の増加。さらなる実験により、このチミジン取り込みの増加はベータ細胞の複製の増加によるものであることが示される可能性があります。インスリン分泌アッセイは、遺伝子6の過剰発現が、低グルコースおよび高グルコースでのインスリン分泌の主要なベータ細胞機能の1つを変化させないことを実証しました。

低グルコース濃度と高グルコース濃度でのインスリン分泌の増加は、アデノウイルスによる治療後のアイレットの健康状態を反映しています。遺伝子6の発現を増加させると、ベータ細胞の機能が損なわれると、これは高刺激で分泌されるインスリンの減少として反映される可能性があります reグルコース濃度。このビデオを見れば、特定の遺伝子がベータ細胞の成長や機能に影響を与えるかどうかを判断するために、ベータ細胞の複製とインスリン分泌を測定する方法についてよく理解できるはずです。