インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

次の実験の全体的な目標は、X線結晶構造解析による標的タンパク質の構造決定にマルチターゲットアプローチを使用することであり、ここで紹介するケースでは、単一の遺伝子または遺伝子配列のみから始めて開始します。標的タンパク質は、ウイルス複製の重要な構成要素であるインフルエンザA由来のPB 2ポリメラーゼサブユニットです。マルチターゲットアプローチは、まず、単一の標的配列とタンパク質について知られている他の情報に基づいて、一連の遺伝子コンストラクトを並行して設計し、クローニングすることによって達成されます。

2番目のステップは、各コンストラクトの発現レベルをテストし、細胞培養における大規模なタンパク質発現に最適なものを選択することです。次のステップでは、細胞を割って発現材料から標的タンパク質を除去し、それぞれを非常に高い純度に精製する必要があります。次に、各タンパク質に対して一連の結晶化試験を設定し、X線研究に適した結晶形態を取得します。

次に、高解像度のX線回折データを1つ以上の結晶に収集し、各標的タンパク質の構造を概説する電子密度マップを解き、精緻化するために使用されます。これらの結果により、電子密度マップに基づいて標的タンパク質の3次元構造をレンダリングすることができます。マルチターゲット処理は、経路のあらゆる潜在的な障害に対して実行可能な代替手段を提供することにより、構造化された決定が成功する可能性を大幅に高めます。

また、複数のターゲットを並行して処理することも非常に効率的で、各ステップでのタンパク質あたりの時間とコストを削減します。創薬可能なターゲットについて構造化された決定が完了する速度を向上させる可能性は、年間より多くの治療法開発の機会を可能にします。この方法は構造生物学において貴重な洞察を提供しますが、これらの方法を通じて得られる高品質のタンパク質は、あらゆるタンパク質ベースの研究をサポートすることができます。

プロセスの各フェーズには独自の科学があり、独自の専門知識が必要ですが、すべてのピースが組み立てられると、人による計装とノウハウへの投資は見事に報われる可能性があります。標的遺伝子と遺伝子産物を研究対象として選択したら、最初のステップでは複数の遺伝的変異体またはコンストラクトを設計する必要があります。Gene Composerソフトウェアは、これらのコンストラクトを、人工合成遺伝子配列の関連コードとともにタンパク質レベルで設計するために使用されます。

アライメントビューアモジュールとコンストラクトデザインモジュールを使用して、タンパク質配列のアラインメントを比較し、タンパク質コンストラクトのデザインインサートPCRおよびベクターPCRの末端プライマーまたはアンペアを定義します。次に、gene composer の protein to DNA アルゴリズムを使用して、各アミノ酸配列を人工核酸配列のコードに逆翻訳します。使用表の適切なコードを使用して、特定の細胞株での発現の配列を最適化します。

この場合、大腸菌の細菌。標的遺伝子配列の準備ができたら、その遺伝子を仮想的にクローニングし、細菌発現に適したベクタープラスミドに挿入します。この場合、修正されたPET 28ベクターです。

このベクターには、発現とタンパク質精製に必要な特定の成分が含まれています。標的遺伝子は、タンパク質のN末端またはC末端のいずれかにヒスタミンタグ配列を組み込むように改変され、精製中にタグを除去できるように切断配列が組み込まれます。また、このベクターは、発現試験や発酵のための抗生物質耐性遺伝子も保有しています。

次に、各標的タンパク質の遺伝子配列は、パイプクローニングポリメラーゼの不完全な一次伸長クローニングに備えて標準的な遺伝子合成法によって作成されます。または、パイプクローニングは、標的遺伝子を目的のベクターに相補的なプライマーで増幅するPCRベースのクローニング戦略です。この方法は、後期PCRの不完全な性質を利用しており、PCR産物に可変の一本鎖末端が残ります。インサートPCRまたはIPCRは、各反応にフォワードプライマーとリバースプライマーをそれぞれ5マイクロリットル追加して調製します。

プレートマップに従った96ウェルプレートにおいて、プレートマップに従って、各全長合成遺伝子の2マイクロリットルをその適切なウェルに加える。それぞれに25マイクロリットルのPFUマスターミックスを加えた後、以下のPCR条件を用いて反応を25回ウェルサイクルします。摂氏95度で30秒間変性します。

50°Cで45秒間、68°Cで3分間伸ばします。フラグメント増幅は、IPCR産物のAGROSゲル分析によって確認されます。成功した IPCR 製品は、堅牢なバンドで表されます。

あまり望ましくない結果は、多くの場合、別の反応でかすかなまたは汚れたバンドとして見られます。発現プラスミドはベクターPCRによって増幅されるか、VPCR産物のAROSゲル分析によりVPCRフラグメント増幅が確認されます。IPCRおよびVPCR生成物が増幅されると、それらはマージプレートに加えられ、マージ反応のためにサーモサイクラーに入れられます。

次いで、成功裏にクローニングされたコンストラクトを化学的にコンピテントな大腸菌細胞に変換し、グリセロール茎に保存して発現試験ストリークを開始する。クローニングされたコンストラクトのグリセロールストックから各サンプルを少量ずつ、別々の寒天プレートに含んでいます。プレートは細菌の栄養ブロスで作られ、ベクターにコードされた抗生物質マーカーのカナマイシンは、翌日に摂氏37度で一晩インキュベートします。

各サンプルの前培養は、新しく育てた寒天プレートから1つのコロニーを選んで開始します。このコロニーを使用して、1.2ミリリットルの結核ブロスに缶マイシンとグルコースを補給して並列処理します。各プレカルチャーは、96ウェルラウンドボトムブロックで栽培されます。

摂氏37度で一晩で成長し、毎分220回転で揺れます。一夜の成長の後。各サンプルに対して、40マイクロリットルのプレカルチャーを使用して接種することにより、小規模なインダクション培養を開始します。

1.2ミリリットルのTBブロス。缶マイシンとnovagenオーバーナイトエクスプレスシステムのミリリットルあたり50ミリグラムが補充されています。1つは、4, 000 GForce単位で15分間の遠心分離により、220 RPMの収穫細胞を220 RPMで振とうしながら、摂氏20度で48時間誘導培養物を成長させます。

上清を注ぎ、ペレットをマイナス20°Cで少なくとも1時間保存してから、精製後のさらなる処理を行います。切断反応の有無にかかわらず、メーカーのプロトコルに従ってキャリパーラボCHIP 90システムを使用したキャピラリー電気泳動によりタンパク質を分析します。インフルエンザの場合、PBは、34のコンストラクトのうち2つのタンパク質サブユニット14が可溶性標的タンパク質につながり、次のステップの大規模発酵に入った。

大規模な発酵を開始するには、100ミリリットルあたり50ミリグラムを含む細菌細胞培養ブロスを接種します。グリセロールストックからのマイシンは、摂氏37度で一晩で成長できますか?翌日に220RPMで振とうし、10ミリリットルで接種してプレカルチャーを広げます。

自動誘導媒体とミリリットルあたり50ミリグラムを含む1リットルのブロスを2リットルのバッフルフラスコにマイシンすることができます。拡張した培養物を摂氏37度で約30分ごとに振とうします。600ナノメートルの波長でUV吸光度を測定することにより、培養物の光学密度を確認します。

光学密度が0.6に達したら、所望の成長時間後に振とうインキュベーターの温度を摂氏20度に変更します。発現試験のために、代表的な 10 ミリリットルの Ali 四角形を各コンストラクトから取り出します。5, 000 GForce単位で15分間遠心分離することにより細胞を回収します。

上清を注ぎ、細胞ペレットをマイナス80°Cで凍結します。この手順を開始するには、細胞ペーストを溶解バッファー内で1〜5マスター容量の比率で解凍し、再懸濁します。摂氏4度で30分間激しく攪拌します。

きれいなヘラを使用して、ビーカーの側面からチャンクを解き放ちます。氷上の細胞をフリーメーソンの超音波処理で機械的に溶解します。18, 000 GForce単位で4°Cで30分間遠心分離することにより、粗溶解物を清澄化します。

上清を収集し、分析のために少量のアリコートを保存してから、大規模な精製を進めます。SDSページゲル解析により、各培養物の大規模なタンパク質発現を確認します。この代表的なSDSページの結果は、堅牢なタンパク質発現、約50%の溶解度、約50%の切断を示しています。

この場合、ヒスチジンタグは、元のコンストラクトで操作された追加のタンパク質溶解度タグとともに除去されました。ニッケル樹脂は、固有のヒスタミンタグを持つ標的タンパク質を、天然の細菌タンパク質を含む他のすべての細胞材料から分離するために使用されます。ニッケル1カラムは、4カラム容量のUE水で洗浄して保存バッファを除去し、続いて1カラム容量のバッファBと5カラム容量のバッファを洗浄することによって調製されます。

A for E平衡化の並列化は、一度に複数のカラムを実行できるタンパク質メーカーで行われます。ヒスタミンタグ付きの可溶化タンパク質を含む清澄化された各ライセートを、毎分 2 mL の速度で別のカラムにロードし、続いてバッファー A で数回のカラム容量洗浄を行い、バッファーを通じて流れを回収し、分析用に保存します。95 から 5 60 から 40、そして最後に 100%バッファー B.The の成分がニッケル樹脂のためにヒスタミンと競合し、したがって、所定の比率でカラムからタンパク質を除去するために、バッファー A と B の一連のステップグラジエントで結合タンパク質を溶出します。

各溶出画分を別々に収集します。ニッケル 1 カラムでの分析による代表的なクロマトグラム結果を以下に示します。ニッケル1が逃れた画分、粗溶解物、清澄化されたライセート、ニッケル1が流れることをSDSページで分析し、カラム精製中に収集された280ナノメートルのUV吸光度と比較します。

この手順では、精製が成功したかどうかを判断します。標的タンパク質を含む画分を選択してプールし、さらなるプロセッシングのために持ち越します。この段階でのタンパク質の総量を、タンパク質の理論上の吸光係数で計算し、280ナノメートルでのUV吸光度を測定し、プールされた画分の総体積を考慮に入れます。

分析用に小さなサンプルを保存します。標的タンパク質の遺伝子は、ULP Oneによって切断部位として認識される特定の配列でコードされているため、ULP Oneを追加すると、ヒスチジンタグと目的のタンパク質との間に切断が生じます。この手順を開始するには、プールされた画分に存在するタンパク質の5ミリグラムごとに1マイクロリットルのユビキチン様プロテアーゼを追加します。

この時点で、切断されたタンパク質をバッファーBからバッファーAに移し、透析チューブを用いてさらなる処理を行い、2リットルのバッファーに対してタンパク質を透析し、Aを摂氏4度で4時間攪拌しながら透析した。透析後のPB 2には10キロダルトンの分子量カットオフを使用します。標的タンパク質の別のSDSページゲルを、ULP1が存在するものがある場合とない場合で実行します。

これにより、ULP 1 の切断が成功したかどうかが判断され、次の処理のために繰り越すのに最適な画分を選択できます。ここには、ポリメラーゼpbの3つのコンストラクトの代表的なSDSページの結果が示されています。レーン1には2つのサブユニット分子量マーカーがあります。

レーン 2、6、および 10 は、ニッケル 1 カラムからプールされたタンパク質です。レーン3、7、および11は、ニッケル2およびレーン4、8、および12からのバッファーA中の切断されたタンパク質のフロースルーを含んでいます。ニッケル2からのバッファーBのヒスタミンタグの除去を示しています。

ヒスタミンを除去した後、ニッケル2からプールされた画分が濃縮されます。この場合、acere S 110 over 30 GLカラムを使用し、5ミリリットルシリンジを使用して毎分0.5ミリリットルの流速で200ミリリットルのSECバッファーと平衡化し、サンプルを10ミリリットルのサンプルループにロードしてSECカラムの実行を開始します。280ナノメートルのUV吸収性クロマトグラムをモニターしながら、少量の体積分画を収集します。

SDSページを介して関連するすべてのSECフラクションを実行します。タンパク質結晶化試験の標準的なアプローチは、蒸気拡散を伴うシッティングドロップ法によって行われます。各標的タンパク質に対して、最初に2つ以上のスパースマトリックススクリーニングを設定することは珍しくありません。

このプロセスを開始するには、96ウェルコンパクトジュニア結晶化プレートの各リザーバーに80マイクロリットルを事前に充填し、選択した結晶化スクリーンの各条件で、SECバッファー内の0.4マイクロリットルのタンパク質を96ウェルのそれぞれに分注します。次に、0.4マイクロリットルの結晶化スクリーンを追加し、それぞれに液滴が完全に混合されるようにします。よくクリスタルクリア天井テープで全体のトリトを覆い、すべてのウェルで完全なシールを確保し、環境振動のない邪魔されない場所で摂氏16度でプレートを保管します。

今後数週間にわたって、解剖顕微鏡でタンパク質の結晶化を定期的にチェックします。タンパク質の結晶が表示されない場合は、新しいプレートを異なる条件でセットし、収穫前に成功の可能性を高めるために、最終ドロップでタンパク質濃度を変化させます。液体窒素で満たされたドゥーダーでA LSスタイルのパックを冷やし、蓋で覆って収穫を開始します。

ターゲットタンパク質結晶でウェルを覆っている透明なテープを近くの空にカットします。対応する結晶化条件の1.6マイクロリットルをよく加え、それを0.4マイクロリットルのエチレングリコールと組み合わせます。結晶化状態の20%エチレングリコールの溶液は、タンパク質結晶を保護します。

クライオ凍結中は、顕微鏡で結晶を分析し、回収に適したクライオループを選択し、ループの内径を結晶の最大幅に一致させます。クライオループを磁性結晶ワンドに取り付け、ウェル溶液から直接結晶をループします。採取した結晶を入れたクライオループをすぐにクライオプロテクタントに浸し、LSスタイルのパックに沈めます。

フラッシュするには、クリスタルリピートを必要な数のクリスタルで凍結します。収穫が完了したら、パックワンドを使用して、舌が曲がった瞬間凍結結晶が入ったパックに磁気蓋を置きます。次のステップのためにパックを逆さまにします。

パックプッシャーをパックにねじ込み、パックをKUアクタードゥーアーに移し、それを使用して蓋をパンチオフします。パック内の結晶は、J Director画像取得ソフトウェアを使用したX線回折研究の準備が整うまで、液体窒素浴で凍結されたままになります。0.5°の検出器距離50mmの結晶スクリーニングビームスリット、70°のイメージステップ、30秒の露光時間について、以下のパラメータを設定します。

これは、結晶がスクリーニングされている間の画像取得ソフトウェアからのスクリーンショットの例です、中央のパネルは、代表的な結晶からの観察されたX線回折を示し、3次元構造決定に必要な完全なデータセットのために高解像度で十分な画像を収集します。このビデオで紹介したクローニングおよびタンパク質精製戦略により、14個の精製PBと2個のサンプルが得られ、そのうち9個から回折研究に適した結晶が得られました。社内のX線回折データセットは、QKアルファ線を用いた9つのコンストラクトのうち5つについて、ossec variax hf、HF光学系、およびSaturn 944 plus CCD検出器を備えたrigaku超高輝度FREプラス回転陽極X線発生器を使用して収集されました。

ポリメラーゼPBの2つのサブユニットのX線回折像を以下に示します。各データセットが処理され、PB 2サブユニットの合計4つの構造が決定されました。各構造は査読され、一般公開のためにタンパク質データバンクにアップロードされました。

この図は、結晶学的非対称ユニット内の分子のリボン図を示しています。4つのPB 2構造体のうち、二次構造体は、対応するPDBコードとともに虹色のパターンで色付けされています。この表に示されているのは、このビデオ記事で説明されている方法によるインフルエンザPBの2つのターゲットの結果分析です。

遺伝子から構造への決定のためのマルチターゲット並列処理パイプラインは、クローニング、溶解度、精製、結晶化、構造決定の5つのステップで示されています。当社の構造生物学パイプラインの成果は、構造ベースの研究の基盤を提供するだけでなく、タンパク質機能を確認する機能アッセイや、MARまたはSPRによる新規化合物の生物物理学的スクリーニングなど、医薬品開発の新たな出発点を特定するための追加研究にも役立てられます。この技術とそれに伴い発明されたツールは、構造生物学者が、人間の健康と病気に大きな影響を与えた構造ベースの薬物設計を含む、さまざまな種類の発見ベースの研究を検出する道を開くのに役立ちました。

このビデオを見れば、マルチターゲット並列処理によって構造化された決定の成功率がどのように向上するかを十分に理解できるはずです。構造生物学研究室での作業は非常に危険である可能性があり、研究室での活動に従事する際には、PPEの使用などの適切な予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。