SeqA-DNA複合体の結晶化のためのDNA二重鎖の反復最適化

この実験では、タンデムヘムがメチル化されたDNAに結合したタンパク質の回折品質の結晶を得る方法を詳しく説明しています。ガット。タンパク質DNA複合体の結晶充填を優先するために繰り返します。DNAの長さ、GATC間隔、DNA末端の合理的な設計から始めて、相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドでDNAを精製し、次にアネルをしてヘミメチル化DNA二本鎖を形成し、精製された配列Aを混合して複合体を形成します。

次に、市販のスパースマトリックススクリーニングを用いた結晶化試験により、タンパク質DNA複合体の回折品質結晶を成長させるための最適な条件を見つけます。実証された結果。DNAの長さ、GATCの間隔、末端が異なると、CQ A DNA結晶の回折品質に影響が及ぶ。

この研究の目標は、DNAに結合したCKの回折品質の結晶を取得することですが、他のタンパク質DNA複合体の結晶化のためのDNA二本鎖を設計する際に考慮する必要がある一般的な変数を理解するのにも役立ちます。この研究では、DNA複製制御タンパク質の変種を使用しています。安定な二量体を形成し、その化ドメインとDNA結合ドメインとの間に短縮されたリンカー領域を持つものを探します。

この変異体は、DNAを1ターンのみ分離したタンデムGATCリピートへのDNA結合を制限し、DNAを最初に形質転換BBL 20 1Dの3つの細胞とDEMETRIC配列AをコードするT7プロモータープレートの制御下で。100マイクログラム/ミリリットル、アンピシリンを含むLB寒天プレートでの形質転換反応と細菌インキュベーターに一晩置く。混合コロニーを選び、小規模な一晩の培養を開始します。

翌朝の接種器は、10ミリリットルの一晩の接種物で1リットルの培養物です。培養が対数期になったら、2ミリリットルの0.5モルIPTGを添加してタンパク質産生を誘導します。摂氏37度のオービタルシェーカーで3時間インキュベーションを続けます。

次に、3,300 Gで10分間遠心分離することにより細胞を回収します。リースは、精製中に細胞パレットを懸濁し、超音波処理によって嘘を緩衝し、40分間39,000倍Gで遠心分離によってライセートをクリアする。次に、S上清を精製バッファーで平衡化したヘパリンカラムにロードします。

CKタンパク質を溶出します。1モルの塩化ナトリウムCKタンパク質が約0.7モルの塩化ナトリウムで溶出する1モルの線形グラジエントを使用します。CKを含むフラクションを引っ張り、希釈してサンプルのイオン強度を下げます。

次に、精製バッファーと同等の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムEにサンプルをロードします。線形塩グラジエントを適用して、純粋なCKタンパク質を約0.4モルの塩化ナトリウムでループします。分数を含むCKを組み合わせます。

リットルあたり3ミリグラムに濃縮し、保管してください。バッファー設計は、非メチル化およびメチル化オリゴヌクレオチドを補完します。凍結乾燥された各一本鎖DNAの1マイクロモルのサンプルを800マイクロリットルのオートクレーブ、二重蒸留水渦で調製し、ここで15分間、800マイクロリットルのために取っておきます。

各サンプルに2回ローディングバッファーを予熱し、20〜30ヌクレオチドの長いオリゴヌクレオチドを調製し、大きな10%変性ゲルを調製します。重合したら、コームを取り外し、ウェルをよくすすいでください。上部と下部のリザーバーを1倍のTBEランニングバッファーで充填するゲルを組み立てます。

ゲルを750ボルトで事前に実行して、ゲルを摂氏55度に温めます。次に、ランを停止し、ランニングバッファーでウェルを十分にすすぎます。次に、オリゴヌクレオチドを摂氏90度に2分間加熱します。

ボルテックス&スピン。サンプルはすぐにゲルのロードに進みます。オリゴヌクレオチドが移動するまで、約700ボルトでゲルを泳動します。

10%ポリアクリルアミドゲルアルphフェノールブルーCOは、約20塩基のオリゴヌクレオチドと約60塩基のキシレンシルffで移動します。ゲルを装置から分解し、平らな面のスペーサーを取り外します。ガラスプレートを1枚取り外し、ジェルをラップで覆います。

次に、ゲルを裏返し、もう一方のガラスプレートを取り外し、ジェルをラップで覆います。次に、UVライトとゲルの後ろの蛍光板を使用してバンドに印を付けます。カミソリの刃でDNAの影を見るには、バンドを切り取り、細かく切ります。

各サンプルを滅菌済みの15ミリリットルチューブに移します。9ミリリットルのelucianバッファーを追加し、攪拌しながら摂氏37度で一晩希釈します。ゲルローディングピペットチップを使用して、溶液をオートクレーブ遠心チューブに慎重に移します。

アクリルアミド片の移し替えを避けるために、pH 7の3ミリ酢酸ナトリウムの1ミリリットルと冷却された100%エタノールの25ミリリットルを少なくとも3時間摂氏マイナス20度でインキュベートします。沈殿したDNAを遠心分離します。次に、中火で速度vacでペレットを乾燥させ、各ペレットを400マイクロリットルのオートクレーブ、二重蒸留水に再懸濁し、新しいチューブに移します。

pH 7で40マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムと1ミリリットルの100%エタノールボルテックスを加え、遠心分離後マイナス20°Cで30分間インキュベートします。G、DNAの餌を70%冷たいエタノールの100マイクロリットルと18、000回で6分間残る塩の回転を取除くために洗い流す。次に、Gはエタノールを廃棄し、ペレットをスピードバックで乾燥させます。

次に、各ペレットを100マイクロリットルのオートクレーブ二重蒸留水に再送ります。分光法によりオリゴヌクレオチドの濃度を決定します。ヘミメチル化DNA二本鎖を調製するには、まず、相補的な一本鎖の同濃度のmolo concentrationを混合します。

次に、混合物を水浴で摂氏95度に5分間加熱します。サンプルをゆっくりと室温まで冷まします ウォーターバス内。等量の81マイクロモル精製CQAタンパク質と81マイクロモルヘムメチル化DNAを組み合わせます。

その後、室温で15分間インキュベートしました。市販のスパースマトリックススクリーンを使用して結晶化条件のスクリーンを使用するまで、摂氏4度で保管してください。最初の結晶化リードが特定されたら、回折品質の結晶を成長させるための条件を最適化します 得られたCKのDNA結晶を保護して保護します。

結晶化溶液中に存在するPEG 400の量を最終濃度の25%まで増やすか、結晶化溶液に20%のグリセロールを添加します。ナイロンループフラッシュで個々の結晶をすくい取ります。サンプルを液体窒素で凍結します。

次に、100 kで各結晶の回折限界をテストします。HEMIメチル化DNAに結合したCKの短縮変異体の結晶構造を得るために、DNA上の3つのパラメータ、すなわちHemiメチル化GATC配列間の間隔、二本鎖の長さ、および5つのプライムオーバーハングの有無を連続的に最適化します。この研究では、靭帯化をさらに防止する末端ドメインに点変異を持つシークaのDMEバリアントと、DNAのタンデム結合を制限する短縮リンカーを使用しています。

DNAエレクトロモビリティシフトアッセイでは、1ターンのみ分離されたGATCリピートは、修飾CKタンパク質が9〜10塩基対で分離されたGATCリピートに優先的に結合することを示しています。したがって、初期スクリーニングは、メチル化された2つのヘムを含む長さの23〜24塩基対のデュプレックスを利用します。GATC は、9 塩基対または 10 塩基対で区切って繰り返されます。

3つのデュプレックスは、きれいに形作られた結晶をもたらしました。結晶はどれも高解像度に収縮しませんでした。データは、9つの塩基対のA-G-A-T-C分離が結晶化に好まれることを示しました。2つのGATCサイト間にCGジヌクレオチドを含めることにより、溝骨格の相互作用を予想外に強化しても、結晶の回折限界は変更されませんでした。

対照的に、オーバーハングの長さを最適化すると、分子の接触と結晶の形態が劇的に変化しました。ヘムメチル化DNA二本鎖に結合したこのCKタンパク質の結晶構造は、DNA二本鎖の自由面がタンパク質とDNAの相対的なサイズにもかかわらず結晶接触に関与しないことを確認しました。興味深いことに、この特定のケースでは、5プライムジヌクレオチドオーバーハングの有益な効果は、疑似連続DNAの形成によるものではありません。

それどころか、メチル化鎖の5つのプライムエンドがDNA軸から離れて突き出ており、複合体の近位CK分子と相互作用するため、結晶のパッキングを変更するために2つのヌクレオチドが厳密に必要であった理由が説明されています。このビデオを見れば、タンパク質の精製方法と、タンパク質DNA複合体の結晶化のためのDNA二本鎖の設計方法について十分に理解できるはずです。このプロトコルはCKのDNA複合体を結晶化する装置でしたが、DNAの長さの配列と末端の合理的な最適化は、他のタンパク質DNA複合体の結晶化のためのDNA二本鎖の設計のための一般的なフレームワークを提供することを覚えておくことが重要です。