出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

この手順の全体的な目的は、単一の半倍数性酵母細胞をその複製寿命全体にわたって追跡することです。最初のステップは、マイクロパッドの配列を含むマイクロ流体チップを作製することです。次に、酵母細胞をマイクロ流体チップに導入します。マイクロパッドの下の領域の高さが酵母細胞の直径と同程度であるため、細胞はそこに沈降します。

その後、捕捉された酵母細胞の上に新鮮な培地を連続的に流し、出現した娘細胞を培地の流れで洗い流します。明視野および蛍光顕微鏡を用いて、老化する酵母細胞で起こり得る細胞または細胞小器官の形態、タンパク質発現、およびタンパク質局在の変化を可視化します。従来のマイクロダイセクション法に対する本手法の主な利点は、労力が少なくて済み、個々の酵母細胞の全生存期間にわたる長期的な連続顕微鏡観察が可能である点にあります。

この手法は複製老化に関する知見を得るために有用であるだけでなく、長期間にわたる連続的な顕微鏡観察を必要とする研究にも利用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、マイクロ流体チップの作製における特定のステップで細心の注意を払う必要があるため、苦労することがあります。また、マイクロ流体チップへの細胞の導入には、ある程度の経験が必要となる場合があります。

シリコンウェハーモールドはソフトリソグラフィーによって作製されます。作製の詳細については、付随するプロトコルを参照してください。テフロンテープを約0.5 mm × 3 mmの細い帯状に切り出します。

メスを用いて、ストリップをシリコンウェハーモールド上の、インレットチャネルとマイクロパドレの間のチャネル構造のわずかに上に慎重に配置します。次に、ガラス製ペトリ皿をアルミホイルの二重層で覆い、その中にウェハーを入れます。アルミホイルは、マイクロ流体チップの作製中にPDMSがウェハーとペトリ皿の間に入り込むのを防ぎます。

マイクロ流体チップの作製手順を開始するために、空のプラスチックカップを天秤に載せ、風袋引きを行います。プラスチックカップに 40 grams の PDMS ベースを注ぎます。PDMS 硬化剤を重量比 1:10 の割合で添加します。この場合、約 4 milliliters に相当します。

使い捨てプラスチックピペットを用いて数分間十分に撹拌します。後のPDMSの重合を適切に行うために、混合液を十分に混ぜ合わせることが重要です。ガラス製シャーレに入れたウェハーの上にPDMSを注ぎます。シャーレ内のPDMS混合液には多くの気泡が含まれているため、脱気が必要です。

PDMSを配置した後、気泡がすべて消失するまで約30分間、真空ポンプに接続したデシケーター内にペトリ皿を置きます。ウェハを載せたペトリ皿をホットプレートに置き、120 °Cで1時間、続いて65 °Cでさらに1時間加熱してPDMSを重合させます。2時間後、ガラス製のペトリ皿からアルミ箔ウェハと重合したPDMSを取り出します。

ウェハの背面からPDMSに貼り付いたアルミホイルを剥がします。次に、ウェハの上端からPDMS層を慎重に持ち上げます。PDMS層をチャネルが上を向くようにベンチに伏せて置き、メスを用いて、PDMSに転写されたシングルチップのデザインに沿って慎重に切り出します。

チャネルの周囲に約3 mmのPDMSを残すようにしてください。次のステップは、この図に示すように、入口、出口、およびサイドチャネルの末端にあるPDMSに穴を開けることです。穴を開けるには、20ゲージのルアースタブをPDMSに真っ直ぐに押し込みます。

スタブを引き抜く前に、ルアースタブ内のPDMSカラムを除去します。これも同様に、PDMSカラムが新しく打ち抜いた穴を塞ぐのを防ぐためです。すべての穴の打ち抜きが完了したら、チップの表面にセロハンテープを貼り、すぐに剥がすことで、塵や残留PDMSを取り除いて洗浄します。

同様に、チップを貼り付けるカバーガラスを洗浄します。チップとカバーガラスをベンチトップ型UVオゾンクリーナーのUVランプの下に配置し、接合させる面をランプに向けて6〜8分間UV光に曝露させた後、曝露させた面同士を重ね合わせます。チップの側面を軽く叩いて、PDMSのカバーガラスへの密着を促進し、気泡を除去します。

マイクロパッドがカバーやガラスに付着する可能性があるため、チャネル構造の上部を叩かないでください。作成したマイクロ流路セットアップをホットプレートに載せ、100 °Cで1時間加熱します。

その後、PDMSチップの端を軽く持ち上げて、カバーガラスとPDMSチップの接合状態を確認します。持ち上がらない場合は接合に成功しており、チップが使用可能な状態です。細胞をロードするためにマイクロ流体チップを準備するには、チップのガラス部分とホルダーの金属部品の間にシリコーンゲルを挟み、チップを金属ホルダーに設置します。

防水シールを作成するため、ガラスを破損させないようナットをゆっくりと締めます。チップのサイドチャネルとアウトレットチャネルに細いチューブを接続します。ピンセットを使用すると、パンチ穴にチューブを挿入しやすくなります。

50 mLのルアーロックシリンジに培地を満たします。シリンジ内から空気を抜き、別のシリンジに順次接続します。20ゲージのルアースタブ、短く太いチューブ、および細いチューブでろ過します。

シリンジをシリンジポンプにセットし、細いチューブ内が完全に培地で満たされるまでポンプを高速で回します。シリンジに接続された細いチューブをチップの入口チャンネルに挿入し、10 µL/minの流速で培地をチップ内に流します。チップから流出する培地をペトリ皿で回収します。

培地はサイドチャネル経由で流出します。これは、大きなタフタグで作られたサイドチャネルとアウトレットチャネルとの間に抵抗差があるためです。チップを顕微鏡ステージに置き、パッドに顕微鏡の焦点を合わせてください。

この手順を開始するには、5 mL ルアーチップシリンジを20ゲージのルアースタブと太いチューブに接続します。チップにロードする細胞懸濁液を約1 mL、シリンジに充填します。ロード時の推奨細胞数は、1×10⁶～5×10⁶ cells/mLです。

シリンジポンプの流量を0.5 µL/minまで下げます。この手順で最も困難なのは、マイクロチップへの細胞のロードです。通常、これにはある程度の習熟が必要です。

細胞懸濁液を入れたシリンジを、流出チャネルのチューブに接続します。シリンジのプランジャーを押し、細胞をロードします。接眼レンズまたはコンピュータ画面を通して、細胞が流入し、マイクロパッドの下に沈降する様子を慎重に観察してください。

パッドの下に十分な数の細胞が沈降するまで、プランジャーに圧力をかけ続けます。最適な負荷量は、パッドあたり1〜3個の細胞です。細胞充填に使用したシリンジを取り外し、気泡やチップからまだ排出されていない細胞を除去するため、高流量でサイドチャネルを数分間フラッシュします。

シリンジポンプの流量を再び0.5 µL/minまで下げ、末端にカテーテルプラグが入った太いチューブを接続してサイドチャネルを閉じます。シリンジポンプの流量を、最終的に1〜5 µL/minまで上げます。流量は、培地や酵母株によって異なる場合があります。

実験の目的に適した顕微鏡およびカメラの設定で動画撮影を開始します。これは、YPD培地で増殖する野生型E細胞単一のタイムラプス動画の例です。培地の画像は10分ごとに撮影されており、表示されているスケールバーは5 µmを表しています。

細胞は死滅するまでに合計30個の出芽を行います。複製寿命は、単一の母細胞によって形成された出芽数をカウントすることで決定できます。このデータは、生存細胞の割合を出芽数または世代数に対してプロットすることで、寿命曲線として変換されます。

この図は、野生型酵母株と2つの変異株で得られた生存期間曲線の例を示しています。SER2遺伝子の欠損は生存期間の短縮をもたらし、FOB1遺伝子の欠損は生存期間の延長をもたらします。マイクロ流体デバイスを用いることで、加齢に伴うミトコンドリア形態の変化を解析することが可能です。

ミトコンドリアに標的化したILV 3G FPを発現するBY 7 42野生型酵母細胞を用いて、老化実験を行いました。この図では、単一細胞におけるミトコンドリア形態の老化に伴う変化の代表例を白矢印で示しています。すべての画像は同一のスケールで表示されており、スケールバーは5 µmを表しています。

2番目のタイムラプス動画は、加齢に伴うミトコンドリア形態を観察した実験において、ILV 3G FPを発現している単一の細胞を示したものです。画像は30分ごとに撮影されており、スケールバーは5 µmを表しています。最後の図は、同一の細胞群において、最初の出芽前、10回出芽後、および死滅前の異なる複製年齢で観察されたミトコンドリア形態を示しています。

管状、断片化した管状、スポット、および大きなスポットの各形態クラスの例示画像が含まれています。中年期の細胞に見られる形態変化は、細胞分裂を継続的にモニタリングすることで以前に報告されたものと類似しています。この手法は、酵母細胞はなぜ老化するのか、どのような表現型の変化が起きているのか、そしてそれらが酵母の複製寿命にどのように影響するのかといった、酵母の複製老化における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

このビデオを視聴することで、独自のマイクロチップを作成し、基本的にあらゆる蛍光顕微鏡を用いて細胞の複製老化を研究する方法を習得できます。