出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

この手順の全体的な目標は、単一のハプロ酵母細胞をその複製寿命全体にわたって追跡することです。最初のステップは、マイクロパッドの配列を含むマイクロ流体チップを作成することです。次に、酵母細胞をマイクロ流体チップにロードし、マイクロパッドの下の領域が酵母細胞の直径と同様の高さを持っているため、細胞はそこに定着します。

続いて、捕捉された酵母細胞上に新鮮な培地の連続的な流れが適用され、出現した娘細胞は培地明視野と蛍光の流れによって洗い流されます。顕微鏡法は、老化酵母細胞で発生する可能性のある細胞または細胞小器官の形態、タンパク質発現、およびタンパク質局在の変化を視覚化するために使用されます。この技術が従来のマイクロダイセクション法と比較した場合の主な利点は、労働集約的でなく、個々の酵母細胞の全寿命の長期連続顕微鏡画像を可能にすることです。

この方法は、複製老化に関する洞察を得ることができますが、長期間にわたる継続的な顕微鏡観察を必要とする研究にも使用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、マイクロフェイクチップの製造の特定のステップで注意を払う必要があるため、苦労するでしょう。さらに、細胞をマイクロFEICチップにロードするには、ある程度の経験が必要な場合があります。

シリコンウェーハモールドは、ソフトリソグラフィーによって製造されます。その製造の詳細については、付属のプロトコルを参照してください。テキストは、丈夫なタグを約0.5ミリメートル×3ミリメートルの細いストリップにカットします。

メスを使用して、インレットチャネルとマイクロパドレの間のチャネル構造の少し上にあるシリコンウェーハモールドにストリップを慎重に置きます。次に、ガラスのシャーレにアルミホイルを2重に重ねて覆い、ウェーハをシャーレに入れます。アルミホイルは、マイクロ流体チップの製造中にPDMSがウェーハとシャーレの間に流れるのを防ぎます。

マイクロ流体チップの作成手順を開始するには、空のプラスチックカップを天びんに置き、天びんを引き裂きます。プラスチックカップに40グラムのPDMSベースを注ぎます。PDMS硬化剤を1対10の重量比(この場合は約4ミリリットル)で添加します。

使い捨てのプラスチックピペットを使用して数分間十分に混合し、後でPDMSが適切に重合されるように、混合物を十分に混合することが重要です。PDMSをガラスのペトリ皿のウェーハの上に注ぎます。ペトリ皿内のPDMS混合物には、ドガに多くの泡が含まれます。

PDMSは、すべての気泡が除去されたときに、真空ポンプに接続された乾燥剤にシャーレを約30分間置きます。ペトリ皿とウェーハをホットプレートの上に置き、摂氏120度で1時間、続いて摂氏65度でさらに1時間かけて、PDMSを重合します。2時間後、アルミホイルウェーハと重合PDMSをガラスシャーレから取り出します。

ウェーハの裏側からアルミホイルをはがしてPDMSにします。次に、PDMSの層をウェーハの上部から慎重に持ち上げます。PDMS層を逆さまにして、チャネルをベンチに向け、メスでPDMSに刻印されたシングルチップデザインを慎重に切り取ります。

チャネルの端の周りに約 3 mm の PDMS を保持するようにしてください。次のステップは、この図に示すように、入口出口とサイドチャネルの端にあるPDMSに穴を開けることです。穴を開けるには、20ゲージのルアースタブをPDMS全体にまっすぐ押し込みます。

スタブを引き出す前に、ルアースタブ内のPDMSの列を取り外してください。この場合も、PDMSカラムが新しくパンチされた穴を塞ぐのを防ぐことができます。すべての穴を開けたら、チップにスコッチテープを貼り、すぐにテープをはがして、チップの表面をほこりの粒子や残留PDMSから取り除きます。

同様に、チップが取り付けられているカバーガラスを清掃します。ベンチトップUVオゾンクリーナーのUVランプの下にチップとカバーガラスを置き、接着が必要な側面を接着する必要のある側面をUV光にさらされたランプに向け、UV光にさらされたランプに6〜8分間さらされ、露出した表面を互いに重ねます。チップの側面を軽くたたいて、PDMSのカバーガラスへの取り付けを促進し、気泡を取り除きます。

チャネル構造の上部を軽くたたいて、マイクロパッドがカバーに取り付けられる可能性があるため、タップしないでください。ガラスも。新しく作成したマイクロ流体セットアップを摂氏100度のホットプレートに1時間置きます。

その後、PDMSチップの端を少し持ち上げて、カバーガラスとPDMSチップの接合を確認します。これが不可能な場合、ボンディングは成功し、チップを使用する準備が整います。細胞ローディング用のマイクロ流体チップを準備するには、チップのガラスとホルダーの金属部分の間に、チップをシリコーンゲルで金属ホルダーに入れます。

防水シールを作成するには、ガラスが壊れないようにナットをそっとねじ込みます。細いチューブをチップのサイドチャネルとアウトレットチャネルに接続します。ピンセットを使用すると、パンチ穴にチューブを挿入しやすくなります。

50ミリリットルのルアーロックシリンジに培地を入れます。シリンジから空気を抜き、シリンジに順番に接続します。20ゲージのルアースタブ、短くて厚いチューブ、細いチューブをろ過します。

シリンジをシリンジポンプに入れ、細いチューブが媒体で完全に満たされるまでポンプを早送りします。シリンジに接続された細いチューブをの入口チャネルに押し込み、媒体を毎分10マイクロリットルの速度でチップに流します。チップをペトリ皿に残して培地を集めます。

媒体はサイドチャネルを介してなくなります。大きくて丈夫なタグで作られたサイドチャネルとアウトレットチャネルとの間の抵抗差のため。チップを顕微鏡ステージに置き、顕微鏡の焦点をパッドにセットします。

この手順を開始するには、5ミリリットルのルアーチップシリンジを20ゲージのルアースタブと太いチューブに接続します。チップにロードするセル懸濁液の約1ミリリットルをシリンジにロードします。ローディングに推奨されるセル数は、ミリリットルあたり6個のセルのうち10の1〜5倍です。

シリンジポンプの流量を毎分0.5マイクロリットルに減らします。この手順で最も難しいのは、細胞をマイクロミーチップにロードすることです。これには通常、ある程度の練習が必要です。

細胞懸濁液を含むシリンジを出口チャネルのチューブに接続します。シリンジのプランジャーを押してセルをロードします。マイクロパッドの下に入り込み、沈殿する細胞を、眼球またはコンピューターの画面を通して優しく観察します。

十分なセルがパッドの下に落ち着くまで、プランジャーに圧力をかけ続けます。最適な負荷は、パッドあたり1〜3セルです。セルローディングに使用したシリンジを外し、サイドチャネルを高流量で数分間フラッシュして、気泡やチップからまだ出ていないセルを取り除きます。

シリンジポンプの流量を再び毎分0.5マイクロリットルに減らし、端にカテーテルプラグが入った太いチューブに接続してサイドチャネルを閉じます。シリンジポンプの流量を、毎分1〜5マイクロリットルの最終流量に増やします。流量は、培地や酵母株によって異なる場合があります。

実験の目的に適した顕微鏡とカメラの設定で動画を開始します。これは、YPDで増殖する単一の野生型E細胞のタイムラプス動画の例です。中程度の画像は10分ごとに撮影され、示されているスケールバーは5マイクロメートルを表しています。

細胞は死ぬ前に合計30個の芽を作ります。複製寿命は、単一の母細胞によって生成される芽の数を数えることによって決定できます。このデータは、生産された芽の数または世代数に対する生存細胞の割合をプロットすることにより、寿命曲線に変換されます。

この図は、野生型酵母株と2つの変異株について得られた寿命曲線の例を示しています。SER 2遺伝子の欠失は寿命の短縮をもたらし、FOB 1遺伝子の欠失は寿命の延長をもたらす。年齢の関数としてのミトコンドリアの形態は、マイクロ流体デバイスを使用して研究できます。

ミトコンドリアを標的とするILV 3G FPを発現するBY7 42野生型酵母細胞を用いて老化実験を行った。この図では、単一細胞におけるミトコンドリア形態の加齢に伴う変化の代表例を白い矢印で示しています。すべての画像は同じようにスケーリングされ、スケールバーは5マイクロメートルを表します。

2つ目のタイムラプス動画は、年齢の関数としてのミトコンドリアの形態が観察された実験で、ILV 3G FPを発現する単一細胞のものです。画像は30分ごとに撮影され、スケールバーは5マイクロメートルを表しています。この最終的な図は、10回の芽の後、死ぬ前に最初の芽を生成する前に、異なる複製年齢の同じ細胞セットで観察されたミトコンドリアの形態を示しています。

各形態クラスのイメージの例には、管状、断片化された管状、スポットと大きなスポットが含まれます。中年細胞に見られる形態変化は、以前に報告されたものと似ています 細胞が分裂するにつれて細胞を継続的に監視することによって。この方法は、酵母細胞がなぜ老化するのか、どのような表現型の変化が起こっているのか、そしてこれらが酵母の複製寿命にどのように影響するのかなど、酵母の複製老化における重要な質問に答えるのに役立ちます。

このビデオを見れば、自分だけのマイクロチップを作成する方法や、基本的にはどんな蛍光顕微鏡でも細胞の反復老化を研究する方法がわかるはずです。