Name: 頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学ぶ頭頸部扁平上皮癌のがん幹細胞分離法。Hoechst染料排出アッセイとフローサイトメトリーでCD44-high/ALDH-high細胞集団を特定し、化学療法抵抗性のメカニズム解明に貢献する。

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私たちは、UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8)のフローサイトメトリープラットフォームのThibault Andrieu氏とSebastien Dussurgey氏に感謝します。彼らの選別中のアドバイスと助けに感謝します。この研究は、ETOILEとLabex-PRIMES(ANR-11LABX-0063)の科学的枠組みの中で達成されました。

すべての動物の手順は、動物のケアのローカルガイドラインに従って行いました。本研究の全ての詳細はCECCAPP、フランスの倫理委員会によって承認されました。 ヘキスト染料流出アッセイによるサイドポピュレーション（SP）の1選定<ol><li>ヘキスト33342染料を用いて50万個の細胞を染色します。 <ol><li> 1「ヘキスト」と表示されたチューブと「ヘキストとベラパミル」と表示された1：2 15ミリリットルに円錐形の底部を有する滅菌チューブを準備します。滅菌水で5 mMのベラパミル塩酸塩溶液10mlを準備します。幹細胞の培養培地（CM）を調製します。 <ol><li> 、CSC（CM-CSC）のためのCM​​を調製以下を組み合わせる：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）：F12（1：3、v：v）によって精製したウシ胎児血清（FCS）を、5％、ヒドロコルチゾンの0.04 mg / Lでペニシリン、ストレプトマイシンを0.1g / L、および20μgの上皮成長因子（EGFR）の/ Lの、100 U / mlです。 </li></ol></li><li>層流フードの下で、細胞をトリプシン処理。秒で洗浄し、メディアを削除terileリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と75 cm 2のフラスコのためにトリプシンEDTA 1mlの（は0.5g / L）を添加します。 37℃で3分間インキュベート。親細胞株のために使用される培養培地を添加することによって反応を停止させます。細胞カウンターを用いて細胞数をカウントします。 <ol><li>親細胞株（CM-P）のためのCM​​を調製するために、10％FCS、0.4ミリグラム/ヒドロコルチゾンのL、ペニシリン100 U / mlで、0.1グラム/ Lのストレプトマイシン）を含むDMEMを補います。 </li></ol></li><li> CM-Pで10 7細胞/ mlを得るために、ステップ1.1.2で得られた細胞懸濁液を希釈します。チューブ内のチューブに100μlの（10 6細胞）を入れ、「ヘキストとベラパミル」と4ミリリットル（4×10 7細胞） &quot;ヘキスト」：準備2チューブ中の細胞懸濁液を分割します。 </li><li>サンプル「ヘキストおよびベラパミル」では、5 mMのベラパミル塩酸塩溶液（最終濃度：0.5 mM）の10μlのを追加し、穏やかに混合します。 1グラム/ Lのヘキストの5μlの溶液（：0.1グラム/ Lの最終濃度）を追加します。サンプル＆＃で34;ヘキスト」、10 6個の細胞（200μlの合計）あたり1グラム/ Lのヘキスト溶液5μlを追加するには、今後、アルミ箔を使用して直接光暴露から保護したサンプルを保ちます。 </li><li> 1時間30分間37℃の水浴ですべてのチューブをインキュベートします。沈降から細胞を防止するために、穏やかに15分ごとに混ぜます。 </li><li> 4℃で5分間、250×gで遠心分離管。上清を除去し、1×PBS 2mLで各ペレットを再懸濁します。 </li><li> 4℃で5分間、250×gで遠心分離管。上清を取り除きます。 PBS緩衝液で希釈した5 mg / LのPI 4ml中のPBS緩衝液と「ヘキスト「ペレットで希釈して5 mg / Lのヨウ化プロピジウム（PI）の500μLで再懸濁「ヘキストおよびベラパミル「ペレット。 </li><li>フローサイトメーター上のサンプルの取り込みのためのチューブに単一細胞を凝集物を除去し、収集するために70μmのセルストレーナーを介して試料溶液を転送します。サンプルを氷上に保ち、アルミ箔を使用して直接光の暴露から保護します。 </li></ol></li><li>私細胞選別によってヘキスト色素を除くサイド人口のゾル化。 <ol><li>次のパラメータを使用してソーターフローサイトメトリーヘキスト負の細胞分離を実行します。UVレーザー（355 nm）で、ブルーヘキスト（BPを450/50）と赤ヘキストフィルタ（BPを610/20）とUVレーザーパス上の2の検出器、および2コレクター。 <ol><li>まず、染色およびフローサイトメーターセットアップを流すための陽性対照として役立つサンプル「ヘキスト &quot;を分析します。 </li><li>サイトメーターソフトウェアを使用して、「グローバル・ワークシート」ウィンドウで、「ドットプロット」をクリックします（第五右画像を上）とグローバルワークシート上のグラフを作成します。縦軸に、右クリックで、FSC-A（前方散乱）、横軸に、SSC-A（側方散乱）（ 図1A）を選択します。同様に、SCC-Hドットプロット対SSC-Wを作成します。この第2のドットプロットでは、P1領域を作成するには、「多角形ゲート」（第十四右の写真をトップ）（ 図1B）33 をクリックします。 注：P1領域がします単一細胞を包含し、ダブレットを判別します。 </li><li>オプション：P1にゲートをPI対FSC-Aを作成することにより、PI陽性細胞を除外します。このドットプロットでは、PI陽性の死細胞を排除するために、PI陰性集団（P2）を選​​択します。 </li><li>サイトメーターソフトウェアを使用して、「グローバル・ワークシート」ウィンドウで、「ドットプロット」をクリックして、グローバルワークシート上のグラフを作成します。縦軸に、右クリックで、青ヘキスト-Aを選択し、横軸に、赤ヘキスト-A。人口の上で右クリックすると、「ショーの人口」とP1を選択します。このドットプロットでは、細胞（ 図1C）の主な人口の左側のサイドアームとして表示され、負のヘキスト色素側人口（SP）細胞を選択するための領域（P2）を作成します。 </li></ol></li><li>サンプル「ヘキスト」を分析し、10,000事象を収集します。 SP集団を表すゲートP2は、よく配置されていることを確認するために、サンプルを分析し、「ヘキストおよびベラパミル」（10,000イベント）SPの人口（ 図1D）の消失を観察しました。 </li><li> 1.1.1.1で作製したCM-CSCの1ミリリットルを含む15mlチューブでSPヘキスト染料陰性細胞を収集します。 </li><li> 5分間250×gで細胞選別、遠心分離細胞懸濁液の終わりに、上清を除去し、CM-CSCの1mlでペレットを再懸濁。細胞カウンターを用いて選別された細胞の数を計数し、培養フラスコへの細胞の適切な数を転送する（ 表1参照）。 CM-CSCを加え、37℃、5％CO 2雰囲気中でインキュベートします。 </li><li> 5×10 7細胞（ステップ3、「細胞培養法」を参照）の最小値があるまで2通路の最大のために、同じ条件下で培養中の細胞を維持します。 </li></ol></li></ol>サイド人口ソートにおけるCD44 高 / ALDH 高サブ人口の2セレクション<ol><li> ALDH検出キットおよびCとSP細胞の50万ドルを染色D44抗体。 <ol><li> 「未着色」（管A）、「CD44-APC」（管B）、「IgG1の-APC」（チューブC）、「ALDH」（チューブd）は、「ALDHとDEAB：7 15ミリリットルを次のようにラベルされた滅菌チューブを準備します「（チューブe）は、「ALDHおよびCD44-APC」（チューブf）は、「ALDH、DEABおよびCD44-APC」（チューブグラム）。染色中に4℃で全てのチューブおよび試薬を保管してください。 </li><li> （キットに含まれる）は、バッファ1の4.5ミリリットルとCD44-APC（アロフィコシアニン）抗体（1：100希釈）の45μlの緩衝液Aを準備します。バッファ1の100μlのおよびIgG1-APC抗体の1μlの（1：100希釈）を用いて緩衝液Bを準備します。バッファ1の4ミリリットルとキットの試薬20μlの緩衝液Cを準備します。 </li><li> 10 7細胞/ mlで、以前に選別された細胞（ステップ1.2.5）の細胞懸濁液を準備します。 、BおよびC、ならびに管Fに4ミリリットル（4×10 7細胞）を試験管に100μLの細胞懸濁液（10 6細胞）を加えます。現時点では、チューブのD、E及びグラムで細胞を入れないでください。 </li><li> 5分間250×gで細胞を含むチューブを遠心。上清を除去し、チューブにペレットを再懸濁し、バッファ1の100μl中b及びcチューブeおよびgのジエチルアミノ5μlの（DEAB）、ALDH阻害剤を追加します。 <ol><li> 4ミリリットルの試薬Cと、すぐにF管で細胞を再懸濁し、チューブのD、E及びグラムに100μLを移します。 30分間37℃の水浴ですべてのチューブをインキュベートし、アルミ箔を用いた直接光の暴露から保護します。沈降から細胞を防ぐために15分後にボルテックスで穏やかに細胞懸濁液を混合します。 </li></ol></li><li>この瞬間から、氷上のチューブを保持し、アルミ箔を用いた直接光の暴露から保護しました。遠心分離機4℃で5分間、250×gで全てのチューブ、上清を除去します。 </li><li> 4ミリリットルと他のチューブに緩衝液Bを100μlの緩衝A.再懸濁管cの100μlのとb及びグラムのチューブ、再懸濁チューブfは1インキュベート10分4℃で緩衝液100μlを追加します; C。 </li><li>遠心分離機4℃で5分間、250×gで全てのチューブ、上清を除去します。 4℃で5分間、250×gで再びバッファ1（チューブfの4 ml）及び遠心分離機の1ミリリットルで一回すすいでください。上清を取り除きます。再懸濁4ミリリットルとバッファ1の1ミリリットル中の他のすべてのチューブ内チューブFペレットを。 </li><li>凝集物を除去し、フローサイトメーター上のサンプルの取り込みのために適切なチューブ内の単一細胞を収集するために70μmのセルストレーナーを介して試料溶液を転送します。 </li></ol></li><li>蛍光活性化細胞選別によってCD44 高 / ALDH 高細胞集団の単離。 <ol><li>ブルーレーザー（488 nm）の赤色レーザ（波長633nm）、FITCフィルター（530/30）と青色レーザ経路上の1検出器、1：次のパラメータを使用してフローサイトメトリーソーターのソートCD44 高 / ALDH 高いセルを行いますAPCフィルタ（20分の660）と2コレクターの赤色レーザー経路上の検出器。 </li><li>サイトメーターソフトウェアを使用して、ドットPLO」をクリックしてくださいトン」（第五右上の画像）のセクション1.2.1.2に記載されているように細胞形態をチェックして、SSC-H対SSC-Wで単セルで構成される集団を選択するために、SSCドットプロット対FSC-Aを作成しますドットプロット。 </li><li>サイトメーターソフトウェアを使用して、「グローバル・ワークシート」ウィンドウで、「ドットプロット」をクリックして、グローバルワークシート上のグラフを作成します。縦軸に、右クリックで、二重染色された集団を選択するために、APC-Aと横軸、FITC-A上を選択します。 ALDH 高い細胞（ 図2A）を選択するために、dおよびeチューブを使用してゲートを作成します。注：陽性細胞はDEAB（ 図2B）で処理されたチューブe。で消えます。 <ol><li>同じチャート上では、CD44 high細胞（ 図2Cおよび2D）を選択するために、チューブのb及びcを用いて第2のゲートを作成します。陽性細胞は、IgG1-APCを含むチューブに消えます。 fとgのチューブを分析し、CD44 高 / ALDHを&lt;含まれる第3ゲートを作成SUP&gt; high細胞（ 図2Eおよび2F）。 注：陽性細胞のIgG1-APC（ 図2D）を含む管中に存在する場合、細胞およびAPC染色抗体との間の相互作用は特異的ではありません。 </li></ol></li><li> CM-CSCの1ミリリットルを含む15ミリリットルチューブにCD44 高 / ALDH 高細胞を収集します。 CM 19の1ミリリットルを含む15ミリリットルチューブにも低 CD44 低 / ALDHを収集します。注：ステップ1.1.1.1で説明したようにCM-CSCを準備します。 </li><li> 、5分間250×gで細胞懸濁液を遠心上清を除去し、CM-CSCの1mlでペレットを再懸濁。選別された細胞の数をカウントします。 </li></ol></li></ol> 3.細胞培養法<ol><li>上記のように細胞の二重選別した後、5％CO 2、37℃で、CM-CSCと適切な培養フラスコ（ 表1）に分類された細胞をプレート。 18-24時間後、細胞が付着しているかどうかを確認し、培地を変更します。拡大コロニーが50％コンフルエントより大きくなるまで、3日毎に培地を変更します。 </li><li>培養フラスコから細胞をトリプシン処理するためにEDTA（ 表1） -トリプシン0.5グラム/ Lの適切な量を使用してください。 37℃で細胞を3~5分間インキュベートします。トリプシンの作用を停止するためにCM-CSC（ 表1）の適切な量を追加します。 </li><li>得られた細胞の数をカウントし、CM-CSCと175 cm 2の培養フラスコ中で4×10 5細胞をプレー。 37℃で培養し、5％CO 2。この濃度で、24時間の倍加時間を有する細胞は、7日間で70％コンフルエントになります。 </li><li>彼らは3継代を受けた前に、in vitroおよびin vivo実験のためのCSCを使用してください。 </li></ol>腫瘍の可能性とCSC特性4.確認<ol><li> CD44 高 / ALDHの腫瘍の可能性を確認するために、腫瘍球形成高い細胞。 <ol><li> 3.2で説明したように、細胞をトリプシン処理します。 5分間、250×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に1×10 6個の細胞を追加します。上清を除去し、DMEM中でペレットを再懸濁：F12（3：1）rhEGFのメディアFCS無料、20 ng / mlで、ヘパリンおよび1×B27の4 mg / Lでを。 37℃で6ウェル低足場プレート培養フラスコ中で細胞をインキュベートし、5％CO 2。 注意：使用DMEM：F12（3：1）細胞は、FCSなく成長しない場合、FCSの5％、rhEGFの20 ngの/ mlの、4ヘパリンのmg / Lでかつ1×B27を含む培地。 </li><li> （ 図3A）を播種後4〜10日から光学顕微鏡で腫瘍球形成を観察します。 注：腫瘍球の直径以上35μmであるべきです。 CD44 高 / ALDH 高細胞はCD44 低 / ALDHの低に比べ数と大きさの点でより速く、より強化された腫瘍球形成を表示します。 </li></ol></li><li> in vivoで腫瘍形成能を評価した後NOD-SCIDマウスにおけるCD44 高 / ALDH 高い細胞の皮下注射。 <ol><li>選別後の3つの異なる濃度でPBS中に再懸濁細胞（10 4細胞/ mlで、10 5細胞/ mlで、10 6細胞/ ml）。 6マウスの右側腹部に皮下に10 4細胞/ ml（10 3細胞）の100μLを注入します。 10 5細胞/ ml（10 4細胞）、および10 6細胞/ ml（10 5個の細胞）についても同様にします。 注：10 3個の細胞を試験することができるよりも低い希釈。 </li><li>左脇腹領域にCD44 低 / ALDH low細胞の同じ濃度を注入します。最大10週間モニター注射したマウスは、腫瘍の進行19を参照してくださいします。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、他のHNSCC細胞系にも適用可能である特定の細胞株からのCSCの成功を単離するための信頼できる方法を記載しています。孤立した頭と首のCSCは、その後、免疫不全マウス19内移植によるvitroおよび機能的検証のさらなる分子特性に適しています。しかし、いくつかの変更は、サイドポピュレーションまたは親細胞株中に存在するCD44 高 / ALDH 高い割合に応じて試験することができます。側集団の細胞の割合は、特定の細胞株における低すぎる場合、例えば、CD44 高 / ALDH 高い選別を直接行うことができます。本研究で使用したマーカーは、細胞株に適切な他のマーカーで置き換えられてもよく、このようなCD133 高い34または高 CD10 35として研究。 このプロトコルは、2セルソーティングに基づいています。 SP + CD44 + ALDHでソート三色はpossi...

頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）は、世界的に一般的な悪性腫瘍であり、現在の治療法の進歩にもかかわらず、進行した疾患を有する患者は予後不良です。患者の全体の5年生存率は、手術、化学療法、放射線療法及び標的 - 療法を含む治療法の組み合わせにもかかわらず、約30％です。最近の研究では、抗がん治療1次がん幹細胞様細胞（CSCは）の生存に局所再発および遠隔転移を属性。乳房、脳、前立腺、肺、結腸、膵臓、肝臓および皮膚2-含む種々の固形腫瘍における幹細胞の特性（未分化状態、自己再生および分化能力、およびテロメラーゼ活性）を提示する細胞の存在を支持する証拠が蓄積されています10。しかし、CSCをの起源は11,12不明のままです。これらは、正常な幹細胞3,13またはdedifferenの悪性転換から生じ得ますCSCのような機能14,15を獲得する腫瘍細胞のtiation。したがって、CSCをに関連する独特の経路を理解することは耐性HNSCCの早期診断と治療への洞察を提供します。 それのCSCはまた、腫瘍細胞のバルク16〜19と比較し、低酸素ニッチ20内に局在する腫瘍の再発を生じ、標準的な化学療法および放射線療法を回避耐性の表現型を有することが提案されています。多くの要因は、静止の傾向としてのCSCのこれらの抵抗、強化DNA修復、アップレギュレートされ、細胞周期制御機構、及びフリーラジカルスカベンジャー21を説明するために提案されています。また、いくつかの発癌分子経路は、具体的にCSCを17で活性化されてもよいです。さらにターゲット・治療のためのCSCの知識を向上させるために、我々は、中の幹細胞関連マーカーの不均一性のために、のCSCの同定および単離のための信頼できる方法が必要癌22の様々なタイプ。 HNSCCにおいて、幹様腫瘍開始細胞が、そのような薬物排出トランスポーターの発現23と異なるCSCバイオマーカー（CD44 高 、CD24 低 CD133 高 、のc-Met +表現型10,24を発現する細胞を選別することにより、一次患者の腫瘍から単離されています25、またはALDH 高活性26）またはCSC特性を有するsquamospheresを形成するために、主要な患者の腫瘍を栽培。それにもかかわらず、squamospheresの数は、このように、さらなる特徴付けのための小さなサンプルサイズが27を研究して与え、2継代後に劇的に減少します。したがって、十分に確立された細胞株から出発インビトロアッセイのCSCの知識を向上させるために実験を設計するための簡単なソリューションです。 この記事の目的は、マルチパラメトリックフローサイトメトリー分析aを用いHNSCC細胞株からのCSCを単離するための方法を提案することですNDセルソーティング。 ALDH活性を含むいくつかのCSCの特性との相関におけるCD44の発現は、サイドポピュレーション（SP）の表現型、スフェロイド形成能と腫瘍形成を分離したCSCのこのサブ集団を特徴付けるために使用されます。 CD44、細胞表面糖タンパク質は、細胞接着および遊走に関与しています。 CD44は、高度に頭頸部癌モデル29-31を含め、CSCを28多くの固形腫瘍で発現されます。 CD44 low細胞が10できないのに対し、さらに、CD44 高細胞は、in vivo異種の腫瘍を発生させることができます。 SPアッセイは、CSC膜内で過剰発現トランスポータータンパク質のATP結合カセット（ABC）ファミリーを介しヘキスト色素22を流出する細胞の差電位に基づいています。このアッセイでは、対照試料中のベラパミルなどのABCトランスポーター阻害剤の使用を含みます。アルデヒド脱水素酵素（ALDH）は、RETにレチノールの変換に関与する細胞内酵素であります初期の幹細胞の分化25,26の間inoic酸。高いALDH活性ショーHNSCC 26における幹様細胞の挙動およびALDH 高い細胞の非常に少ない数を示す細胞は、 インビボ 26,32 に腫瘍を生成することができます。 これらのマーカーとプロパティの組み合わせが正常にベルトラン間tのアルで使用されていた。 インビトロ及び光子と炭素イオン照射19にこれらのCSCの生体内で抵抗を研究します。それらの結果は、様々な細胞マーカーおよび特性の組み合わせは、単一のマーカーのアプローチよりHNSCCのCSC集団に関する有用な研究のために、より選択的であることを示しました。

<table><tbody><tr><td>子牛胎児血清 ゴールド</td><td>GEヘルスケア</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン 水溶性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>溶液は、非常に不安定であるため、使用直前に調製する必要があります</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamin A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>腐食性、急性毒性(経口、経皮、吸入) カテゴリー4</td></tr><tr><td>ベラパミル塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>急性毒性(経口、経皮、吸入)カテゴリー3</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>急性毒性(経口、経皮、吸入)カテゴリー4</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>Stem Cell</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC、ヒト抗体</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC、ヒト抗体</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Z1コールター粒子</td><td>ベックマン・コールター</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B細胞株</td><td>John Little'からの贈り物研究室</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FaDu細胞株</td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr>低<tr><td>アンカレッジプレート</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDivaソフトウェア v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）の進行の理解の進歩にもかかわらず、5年生存率は、局所的再発および遠隔転移に低いままです。この再発を説明するための1つの仮説は、固有の化学療法および放射線抵抗性を提示するがん幹細胞様細胞（CSCは）の存在です。新たな治療戦略を開発するためには、標的治療の有効性を検証する実験モデルを有し、したがって、のCSCの同定および単離のための信頼できる方法が必要です。この目的のために、我々は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって実行二つの連続するセルソーティングの組み合わせに依存しているヒトHNSCC細胞株からのCSCを単離するためのプロトコルを提示します。第1は、ヘキスト33342などの重要なDNA色素は細胞が目にソートし、ATP結合カセット（ABC）トランスポータータンパク質を過剰発現するため、除外し、他の人の間でするのCSCのプロパティに基づいていますこの方法は、「サイドポピュレーション」（SP）として識別されています。 SP細胞は親細胞の（&lt;5％）低いパーセンテージを表すように、成長期には、第二の細胞選別の前にそれらの数を増加させるために必要です。次のステップは、他の二つのHNSCC幹細胞の特性は、細胞表面マーカーCD44（ 高 CD44）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現（ALDH 高い ）の高発現レベル、すなわち有する細胞の選択を可能にします。単一のマーカーの使用は、CSCを単離するための多数の制限および落とし穴を有するため、SP、CD44およびALDHマーカーの組み合わせは、生細胞を必要とするさらなる分析および機能的アッセイのためのCSCを単離するための有用なツールを提供します。 CSCの幹のような特性は、最終的にtumorispheresの形成とβカテニンの発現によりin vitroで検証しました。

HNSCC細胞株からのCSCの単離は、理由親細胞株でのCSCの非常に低い割合の2つの連続した​​ソートを必要としました。最初のソートは、薬物排出トランスポーターによるヘキスト色素を排除するためのCSCの能力に基づいていました。このソート全細胞集団（ 図1）の1〜5％の獲得をもたらしました。ヘキスト染料負の細胞選別の間、SSCドットプロット（ 図1A）対FSC-Aを見て、サイズと選別された細胞の造粒をチェックしてください。その後、SSC-Hドットプロット対SSC-Wを使用して、人口のP1（ 図1B）を選択することにより、二重および細胞フラグメントを区別。このP1の人口で、ヘキストブルードットプロット対ヘキストレッド-Aを作成します。 「ヘキスト」と表示されたチューブで、SPは主細胞集団（ 図1C）から左側のサイドアームとして表示されます。彼らはarをすると、この人口は消えなければなりませんeはベラパミル（ 図1D）、ABC...

腫瘍の再発と治療に対する抵抗性における癌幹様細胞の役割を理解することは、過去10年間で大きな関心事となっています。この記事では、頭頸部扁平上皮がん細胞株(HNSCC)からのがん幹様細胞の亜集団の単離と特性評価について説明します。

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

この手順の全体的な目的は、頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）細胞株から癌幹細胞を単離することです。この手法は、腫瘍の放射線耐性を克服するために化学療法をどのように活用すべきかという、癌治療分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の主な利点は、複数のマーカーを組み合わせて使用することで、HNSCC細胞株由来の癌幹細胞に対して高い特異性を達成できる点にあります。手順のデモンストレーションは、テクニシャンのPrescillia Battiston-Montagneと、私の研究室の博士であるMarion Gilorminiが行います。Hoechst色素排出アッセイによって癌幹細胞様細胞のサイドポピュレーションを選択するには、まずコニカルチューブに「Hoechst」と「Hoechst and Verapamil」のラベルをそれぞれ貼ります。次に、HNSCC細胞培養物を滅菌PBSで洗浄し、続いて1 mLのTrypsin EDTAを添加します。37°Cで3分間後、新鮮な細胞培養液を加えて反応を停止させ、細胞数を計測する。培養液を1×10⁷ cells/mLに希釈し、親細胞株用培地で定量を完了させる。その後、HoechstおよびVerapamil用チューブに100 µLを、Hoechst用チューブに4 mLの細胞液を加える。次に、5 mMの塩酸ベラパミル溶液10 µLをHoechstおよびベラパミルのサンプルに静かに混ぜ、続いて両方のチューブに1×10⁶個の細胞あたり5 µLのHoechstを添加します。その後、サンプルをアルミホイルで遮光し、37 °Cで保持します。15分おきに静かに混ぜながら90分間インキュベートした後、チューブを遠心分離し、ペレットを2 mLのPBSに再懸濁します。遠心分離後、HoechstおよびVerapamilのペレットをPBSで希釈した500 microlitersのpropidium iodideに、Hoechstのペレットを4 millilitersの同溶液にそれぞれ再懸濁します。次に、凝集物を取り除くため、サンプルを70-micronのセルストレーナーでろ過してFACSチューブに移し、遮光して氷上に置きます。続いて、Hoechstサンプルをフローサイトメーターにロードし、フローサイトメーターソフトウェアのGlobal Worksheetウィンドウを開きます。Dot Plotをクリックしてグローバルワークシート上にグラフを作成し、右クリックして前方散乱光（forward scatter）および側方散乱光（side scatter）のパラメータを選択します。同様の手順で側方散乱光ワイド（side scatter wide）対側方散乱光ハイト（side scatter height）のドットプロットを作成し、次にポリゴンゲートをクリックして2番目のグラフにP1領域を作成し、単一細胞を選択してダブレットを排除します。続いて、レッドHoechst領域対ブルーHoechst領域のドットプロットを作成し、細胞を右クリックしてP1集団をハイライトします。次に、細胞のメイン集団の左側にサイドアームとして現れるHoechst染料陰性のサイドポピュレーションを選択するためのP2領域を作成し、Hoechstサンプルのイベントを10,000個収集します。サイドポピュレーションを示すP2ゲートが正しく配置されているか確認するため、HoechstおよびVerapamilサンプルのイベントも同様に10,000個収集します。これにより、サイドポピュレーションが消失することを確認してください。次に、Hoechst染料陰性細胞のサイドポピュレーションを、1 mLの完全がん幹細胞様細胞培地を含む15 mLコニカルチューブにソートします。ソート終了後、細胞を遠心分離し、サイドポピュレーションのペレットを1 mLの新鮮な完全がん幹細胞様細胞培地で再懸濁します。その後、細胞数を計測し、適切な細胞数で新しい細胞培養フラスコに播種します。ソート済みのサイドポピュレーション細胞からCD44-high/ALDH-highサブセットを選択するために、まず7本の滅菌済み15 mLコニカルチューブに指示通りラベルを貼ります。次に、ソートした細胞を幹細胞培地を用いて1×10⁷ cells/mLに希釈し、氷上で、unstained CD44-APCチューブとIGG1-APCチューブに細胞液100 µLずつを、ALDHおよびCD44-APCチューブに細胞液4 mLを分注します。細胞を遠心分離し、unstained CD44-APCおよびIGG1-APCのペレットをALDEFLUORキットのbuffer one 100 µLで再懸濁します。次に、ALDH、ALDHおよびDEAB、ALDH、DEABおよびCD44-APCの各チューブに、ALDH阻害剤であるDEABを5 µLずつ加えます。ALDHおよびCD44-APCチューブ内の細胞を、4 mLのバッファー1とキットの試薬20 µLを含む4 mLの試薬Cで再懸濁し、直ちにこれらの細胞100 µLをALDH、ALDHおよびDEAB、ALDH、DEABおよびCD44-APCの各チューブに移します。その後、すべてのチューブを遮光した状態で37 °Cの恒温水槽に30分間置き、15分後に緩やかにボルテックスしてサンプルを混合します。インキュベーション終了後、すべてのサンプルを遠心分離し、上清を除去します。その後、すべてのチューブを氷上に置き、ALDHおよびCD44-APCペレットを4 mLのバッファーAに、CD44-APCおよびALDH DEABおよびCD44-APCペレットを同バッファー100 µLにそれぞれ再懸濁します。IGG1-APCペレットは100 µLのバッファーBに、未染色のALDHおよびALDHおよびDEABチューブは100 µLのバッファー1に再懸濁します。10分後、すべてのサンプルを再び遠心分離し、ALDHおよびCD44-APCサンプル以外のすべてのサンプルを1 mLのbuffer oneで洗浄します。ALDHおよびCD44-APCサンプルは4 mLのbuffer oneで洗浄します。2回目の遠心分離後、ALDHおよびCD44-APCサンプル以外のすべてのペレットを1 mLの新鮮なbuffer oneで再懸濁します。ALDHおよびCD44-APCサンプルは4 mLのbuffer oneで再懸濁します。次に、ALDHおよびCD44-APCのチューブをフローサイトメーターにロードし、APC対FITCのドットプロットを作成して、二重染色された集団を視覚化します。次に、ALDH管をロードしてALDH高発現細胞のゲートを作成します。ALDHおよびDEAB管をロードすると、陽性細胞が消失するはずです。同じグラフ内で、CD44-APCおよびIGG1-APC管を用いて2つ目のゲートを作成し、CD44高発現細胞を選択します。IGG1-APCチューブをロードすると、陽性細胞は消失します。次に、ALDHおよびCD44-APCチューブと、ALDH DEABおよびCD44-APCチューブをロードし、CD44-high/ALDH-high細胞を含む3つ目のゲートを作成します。ダブルステインALDH-CD44チューブを使用して、ダブルポジティブ細胞に最後のゲートを設定します。次に、CD44-high/ALDH-high細胞を、1 mLの完全がん幹細胞様細胞培地を含む15 mLコニカルチューブにソートします。必要に応じて、CD44-low/ALDH-low細胞を1 mLの完全細胞培養培地に回収します。2回目のソート後、CD44-high/ALDH-high細胞を適切な細胞培養フラスコに播種し、完全がん幹細胞様細胞培地を用いて細胞培養インキュベーター内で18から24時間培養します。細胞がフラスコの底面に接着したら、培養培地を交換し、フラスコをインキュベーターに戻します。CD44-high/ALDH-high細胞の腫瘍形成能を確認するため、実演した通りにがん幹細胞様単層細胞をトリプシン処理して単一細胞懸濁液を得て、1×10⁶個の細胞を15 mLコニカルチューブに移します。細胞を遠心分離した後、リコンビナントヒト上皮成長因子、ヘパリン、およびB27を添加した低血清培地でペレットを再懸濁し、光学顕微鏡で腫瘍球（tumor sphere）が観察されるまで、細胞培養インキュベーター内の低接着ペトリ皿で細胞を培養します。新しい細胞株で初めてソーティングを行う場合は、in vitroの無血清培地において腫瘍球を形成する能力によって、その細胞株の腫瘍形成能を確認する必要があります。さらに、qPCRによって、CD44-high/ALDH-high細胞でβ-カテニンおよびその他の幹細胞様マーカーが高発現していることが示されるはずです。また、CD44-high/ALDH-high細胞は、CD44-low/ALDH-low細胞と比較して、少量を注入した場合でもin situで腫瘍を形成できるはずです。習熟すれば、適切に実施することで、各細胞分取は5時間以内に完了させることができます。この手順を行う際は、蛍光色素で標識したサンプルを直射日光から保護することが重要です。本手順の後、浸潤・遊走アッセイなどの他の手法を実施することで、転移プロセスにおけるがん幹細胞の関与についてさらなる疑問を明らかにすることができます。この技術の開発により、がん研究分野の研究者がHNSCC（頭頸部扁平上皮がん）における腫瘍脱出のメカニズムを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、マルチパラメトリック・フローサイトメトリー解析およびセルソートを用いて、HNSCC細胞株からがん幹細胞を単離する方法について十分に理解できるはずです。腫瘍細胞やDNAインターカレーション剤の取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施にあたっては、白衣や手袋の着用などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

がん幹細胞の移動を調査するための区分するマイクロ流体デバイスが記載されている。この小説のプラットフォームは、生存細胞の微小環境を作成し、生細胞運動の微視的な可視化を可能にします。非常に運動性のがん細胞は、潜在的に、より効果的な将来の治療法につながる積極的な浸潤の分子メカニズムを研究するために隔離されています。...

区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

このビデオでは、蛍光活性化セルソーターまたはFACSを使用して、頭頸部扁平上皮癌細胞株から癌幹様細胞の亜集団を分離する方法について説明します。細胞の分離された側集団は、さらなるダウンストリーム分析に使用できます。...

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この記事では、初代培養細胞に新たに取得したメラノーマ組織の調製を記述する方法、および腫瘍細胞から赤血球および線維芽細胞の汚染物を除去する。最後に、我々はどのように説明したCD133...

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直接ヒト組織からがん幹細胞（CSCが）の単離は、それらの生物学的特性評価のために必要である。また、難しい手順のトラブルシューティングのヒントを提供しながら、この原稿は、ヒト組織からの前立腺のCSCを単離するための方法論を説明します。...

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

マルチとシングルセルベース球アッセイを用いてヒト卵巣癌細胞における幹細胞特性の評価

膵臓がん幹細胞(CSC)は、アンカレッジ非依存球体培養技術を使用してin...

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

骨肉腫における癌幹細胞（CSCを）の存在は、最近、その病因に関連しています。本稿では、非接着性条件下で増殖するのCSCの能力を用いて、従来の骨肉腫（OS）の人間の生検から得られた初代細胞培養物からのCSCの単離を提示します。...

がんの確立は、ヒト従来の骨肉腫からの幹細胞培養物

蛍光活性化細胞選別によるヒト肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍開始細胞の単離に関する詳細なプロトコルを説明し、ヒト白血病抗原-1(HLA-1)を陰性マーカーとして用い、さらなる検証を行う。これらのHLA-1陰性腫瘍始発細胞の特徴付け。...

肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

頭頸部扁平上皮癌同所性同種モデルマウスを開発するための再現可能な方法をご紹介します。腫瘍免疫の浸潤、リンパ節転移、貧しい分化壊死を含む病気の臨床的病理組織学的機能について示します。担癌マウスでは、嚥下障害、顎の変位、減量など臨床的に関連する症状を起こします。...

腫瘍免疫プロファイル用のマウスおよび治療応答評価における扁平上皮癌細胞の粘膜接種

ヒト原発性前立腺上皮細胞を用いて、スフェロイドベースの標識保持アッセイによる幹様細胞の機能的特徴付けの新規バイオマーカーフリー法を報告する。BrdU、CFSE、またはファーレッド2Dセルラベリングのステップバイステッププロトコルについて説明します。三次元回転楕円体形成;免疫細胞化学による標識保持幹細胞同定;FACS...

3次元スフェロイド培養からの幹様細胞の分離

この実験プロトコルでは、乳がん細胞および組織サンプルからのBCSCの単離、ならびにBCSCの表現型と機能を評価するために使用できるin vitro および in vivo...

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

学ぶ頭頸部扁平上皮癌のがん幹細胞分離法。Hoechst染料排出アッセイとフローサイトメトリーでCD44-high/ALDH-high細胞集団を特定し、化学療法抵抗性のメカニズム解明に貢献する。

頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション

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