頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目標は、頭頸部扁平上皮がんまたはHNSCC細胞株からがん幹細胞を単離することです。この方法は、腫瘍の放射線抵抗性を克服するために化学療法をどのように使用するかについてのがん治療分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マーカーの組み合わせを使用して、HNSCC細胞株のがん幹細胞で高い特異性を達成できることです。

技術者のPrescillia Battiston-Montagneと、私の研究室の博士号を持つMarion Gilorminiが行います。Hoechst色素排出アッセイによりがん幹様細胞のサイド集団を選択するには、まず、1本の円錐形チューブHoechstおよび1本のHoechstおよびベラパミルを標識する。次に、HNSCC細胞培養物を滅菌PBSで洗浄し、続いて1ミリリットルのTripsyn EDTAを添加します。

摂氏37度で3分後、新鮮な細胞培養培地で反応を停止し、細胞をカウントします。培養物を1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞の1倍に希釈し、親細胞株培地を完成させます。次に、HoechstチューブとVerapamilチューブに100マイクロリットルを追加し、Hoechstチューブに4ミリリットルの細胞を追加します。

次に、10マイクロリットルの5ミリモルベラパミル塩酸塩溶液をヘキストおよびベラパミルサンプルに穏やかに混合し、続いて1回あたり5マイクロリットルのヘキストストを10〜6番目の細胞に両方のチューブに混合します。次に、サンプルをアルミホイルで覆い、摂氏37度に置きます。90分後、15分ごとに穏やかに混合し、チューブを遠心分離し、ペレットを2ミリリットルのPBSに再懸濁します。

センター遠心分離後、ヘキストペレットとベラパミルペレットをPBS中のヨウ化プロピジウム500マイクロリットルに再懸濁し、ヘキストペレットを同じ4ミリリットルに再懸濁します。次に、70ミクロンのセルストレーナーでサンプルをろ過してFACSチューブに入れ、凝集体を取り除き、光から保護された氷の上にサンプルを置きます。次に、Hoechstサンプルをフローサイトメーターにロードし、フローサイトメーターソフトウェアのGlobal Worksheetウィンドウを開きます。

ドットプロットをクリックしてグローバルワークシートにグラフを作成し、右クリックして前方散布図と側面散布図のパラメータを選択します。同じ方法で、サイドスキャッターの高さのドットプロットでサイドスキャッター幅を作成し、次にポリゴンゲートをクリックして2番目のグラフにP1領域を作成し、単一のセルを選択し、ダブレットを判別します。次に、青いHoechstエリアドットプロットで赤いHoechstエリアを作成し、セルを右クリックしてP1集団を強調表示します。

次に、P2領域を作成して、細胞のメイン集団の左側にサイドアームとして表示される細胞の負のHoechst色素側集団を選択し、Hoechstサンプルイベントの10, 000を収集します。サイドポピュレーションを表すP2ゲートが正しく配置されていることを確認するには、10, 000 HoechstおよびVerapamilサンプルイベントも収集します。サイドの母集団が消えるはずです。

次に、Hoechst色素陰性細胞のサイドポピュレーションを、1ミリリットルの完全ながん幹様細胞培地を含む15ミリリットルの円錐管に選別します。ソートの最後に、細胞をスピンダウンし、サイドポピュレーションペレットを1ミリリットルの新鮮な完全な癌幹様細胞培地に再懸濁します。次に、細胞をカウントし、適切な数で新しい細胞培養フラスコに播種します。

ソーティングされたサイドポピュレーション細胞からCD44-high/ALDH-highサブセットを選択するには、まず、示されているように7本の滅菌15ミリリットルコニカルチューブを標識します。次に、選別した細胞を幹細胞培地中の1ミリリットルあたり7細胞の10倍に希釈し、未染色のCD44-APCおよびIGG1-APCチューブに100マイクロリットルの細胞を、ALDHおよびCD44-APCチューブに4ミリリットルの細胞を、すべて氷上で分注します。細胞をスピンダウンし、未染色のCD44-APCおよびIGG1-APCペレットをALDEFLUORキットの100マイクロリットルのバッファー1に再懸濁します。

次に、ALDHおよびDEABおよびALDH DEABおよびCD44-APCチューブに5マイクロリットルのALDH阻害剤DEABを追加します。キットから4ミリリットルのバッファー1と20マイクロリットルの試薬を含む4ミリリットルの試薬CにALDHおよびCD44-APCチューブ内の細胞を再懸濁し、直ちにこれらの細胞の100マイクロリットルをALDH、ALDHおよびDEAB、およびALDH DEABおよびCD44-APCチューブに移します。次に、すべてのチューブを摂氏37度の水浴に30分間入れ、光から保護し、15分後にサンプルを穏やかなボルテックスで混合します。

インキュベーションの終了時に、すべてのサンプルを遠心分離し、上清を廃棄します。次に、すべてのチューブを氷の上に置き、ALDHおよびCD44-APCペレットを4ミリリットルの緩衝液Aに再懸濁し、CD44-APCおよびALDH DEABおよびCD44-APCペレットを100マイクロリットルに再懸濁します。IGG1-APCペレットを100マイクロリットルのバッファーBに再懸濁し、未染色のALDHチューブとALDHチューブとDEABチューブを100マイクロリットルのバッファー1に再懸濁します。

10分後、すべてのサンプルを再度スピンダウンし、続いてALDHおよびCD44-APCサンプルを除くすべてのサンプルについて1ミリリットルのバッファー1で洗浄します。2回目の遠心分離後、ALDHおよびCD44-APCサンプルを除くすべてのペレットを1ミリリットルの新鮮なバッファー1に再懸濁します。サンプルは4ミリリットルのバッファー1に再懸濁されます。次に、ALDHおよびCD44-APCチューブをフローサイトメーターにロードし、APC by fitsyドットプロットを作成して、二重染色された集団を視覚化します。

次に、ALDHチューブをロードして、ALDHハイセルのゲートを作成します。陽性細胞は、ALDH および DEAB チューブがロードされると消えるはずです。同じグラフで、CD44-APCチューブとIGG1-APCチューブを使用して2つ目のゲートを作成し、CD44-high細胞を選択します。

IGG1-APCチューブをロードすると、陽性細胞は消えます。次に、ALDH と CD44-APC チューブ、ALDH DEAB チューブと CD44-APC チューブをロードして、CD44-high/ALDH-high セルを含む 3 番目のゲートを作成します。ALDH-CD44チューブを二重染色して、ダブルポジティブ細胞上の最後のゲートを配置します。

次に、CD44-high/ALDH-high細胞を1ミリリットルの完全がん幹様細胞培地を含む15ミリリットルの円錐管に選別し、必要に応じてCD44低/ALDH-低細胞を1ミリリットルの完全細胞培養培地に集めます。2回目のソート後、CD44-high/ALDH-high細胞を、細胞培養インキュベーター内の完全ながん幹様細胞培地を含む適切な細胞培養フラスコに18〜24時間播種します。細胞がフラスコの底に付着したら、培地を交換し、フラスコをインキュベーターに戻します。

CD44-high/ALDH-high細胞の腫瘍電位を確認するために、示されているようにがん幹様単層をトリプシンして単一細胞懸濁液を取得し、6つの細胞に10の15ミリリットルの円錐管に1回移します。細胞をスピンダウンした後、ペレットを組換えヒト上皮成長因子ヘパリンおよびB27を添加した血清低培地に再懸濁し、細胞培養インキュベーター内の低固定ペトリ皿で細胞をインキュベートし、腫瘍球が光学顕微鏡で観察されるまで。新しい細胞株で初めて選別を行う場合、in vitroで無血清培地で腫瘍球を形成する能力から明らかなように、細胞株の腫瘍電位を確認する必要があります。

さらに、QPCRは、CD44-high/ALDH-high細胞によるβ-カテニンおよびその他の幹様細胞マーカーの高発現を示すはずです。CD44-high/ALDH-high細胞は、CD44-low/ALDH-low細胞と比較して、少量で注入された場合、in situで腫瘍を形成することもできるはずです。習得すると、各セルソーティングは適切に実行されれば5時間で完了できるはずです。

この手順を試行する際には、蛍光色素で標識されたサンプルを直接光にさらさないように保護することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、転移過程におけるがん幹細胞の関与に関する追加の質問に答えるために、浸潤移動アッセイなどの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、がん分野の研究者がHNSCCがんにおける腫瘍脱出のメカニズムを探求する道を開きました。

このビデオを見れば、マルチパラメトリック、フローサイトメトリー解析、およびセルソーティングを使用してHNSCC細胞株からがん幹細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。腫瘍細胞の取り扱いやDNA剤の挿入は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に白衣や手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。