老化がん細胞を定量化するための感度の高い方法
2013年8月2日
老化は防止または腫瘍形成は議論の余地があるかどうかを促進。化学療法薬は老化するがん細胞を誘導することができるので、老化を研究する新しい治療法を提案するために不可欠である。ただし、標準化され広く使用されたβ-ガラクトシダーゼアッセイは、大きな欠点を提示します。我々はここで老化を定量化するための迅速かつ高感度フローサイトメトリーベースのアッセイを提案する。
この手順の全体的な目標は、細胞老化を迅速かつ高感度な方法で定量化することです。ここでは、潜在的な化学療法薬のスクリーニングにおけるこの方法の有用性を示します。最初に細胞老化を誘導します。
化学療法薬のドキソルビシンががん細胞に追加されます。次に、Bain Aを塗布して、細胞性リソソームの酸性pHを中和します。次に、細胞の取り込み時に細胞透過性ベータガラクト基質C 12 FDGを添加します。
C 12 FDGは加水分解され、蛍光を発します。β GCSEは老化細胞のリソソームに富んでいるため、非老化細胞よりも蛍光が高くなります。蛍光の違いを定量化するために、細胞をフローサイトメーターで分析し、得られたデータを分析し、さまざまな治療条件下での老化がん細胞の割合を定量化することができます。
この手法がベータガラクトースのような既存の方法よりも優れている主な利点は、老化細胞の迅速かつ高感度な定量を容易にすることです。実際、この方法のアイデアは、一般的に使用されるベータガラクトースアセイを使用して老化細胞を定量化するのが困難になったときに最初に追加します。この手法はがん細胞の老化検出に利用されていますが、正常細胞にも応用できます。
この方法は、化学療法薬ががん細胞をsseに誘導し、悪性腫瘍を促進する可能性があるかどうかなど、がん分野での迅速な質問に答えるのに役立ちます。したがって、この技術は最終的に癌の新しい治療法を通知するのに役立つ可能性があります。化学フュームフードで作業し、C 12 FDG粉末をDMSOに最終濃度20ミリモルアリコートまで0.5ミリリットルのeinorチューブに溶解し、摂氏マイナス80度で保存しました。
DMSOは適切な安全条件で使用し、溶解させる必要があります。DMSO中のCIN A1粉末を最終濃度0.1まで。Millimolar Eloquaは、0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに溶液を注入し、マイナス20°Cで保存します。
CINは適切な安全対策を講じて使用する必要があることに注意してください。この手順は、接着細胞または非接着細胞のいずれかを使用して実行できます。ここでは、ヒト骨髄腫細胞株RPMI 8 2 2 6を用いて手順を実証する。
これらの細胞は懸濁液中で増殖し、実験を行う24時間前に摂氏37度および5%二酸化炭素で10%FBSおよび1%抗生物質を含む培地でRPMI 8 2 2 6細胞を培養し、細胞増殖曲線の対数段階になるように6つのウェルプレートに細胞を播種する。老化細胞の割合を決定する実験の時点では、3つの細胞サンプルが必要になります。未処理および非ST染色細胞、C 12 FDGで染色した未処理細胞、およびC 12 FTGで染色した処理細胞。
各条件について、がん細胞のフローサイトメトリー誘発老化には、最低でも10倍から5分の5の細胞が必要です。化学療法薬のドキソルビシンを追加することで、薬物の濃度と治療期間を細胞タイプに適合させる必要があります。rpmi 8 2 2 6セルでテスト済み。
老化は、1ミリリットルあたり6個の細胞のうち10分の1を15ナノモルのドキソルビシンで48時間処理することで誘発できます。ネガティブコントロールとして未処理のサンプルを摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートすることを忘れないでください。化学療法薬による治療は、細胞アポトーシスを引き起こす可能性があります。
したがって、2日後、血液、サイトメーター、顕微鏡を用いたトライアンブルーの排除により、細胞の生存率を確認してください。生存率が70%未満の場合は、Milton Eの死細胞除去キットなどの適切なキットを使用して死細胞を取り出し、死細胞がその後の分析に偏りを与えないようにします。そうでない場合は、細胞を300 GSで5分間回転させて、培地を取り出します。
その後、100アノムまたはシンを含有するプレウォームフレッシュ培地で上清を除去した後、リソソームの酸性pHを中和するものは、37°Cで1時間インキュベートし、5%二酸化炭素でβガラクトを基質C12FDGに溶解します。中程度から最終濃度は2ミリモルです。ベイルマイシンとのインキュベーションに続いて。
C 12 FDGを細胞および培地に直接添加し、最終濃度33にします。マイクロモルは、摂氏37度と5%の二酸化炭素で2時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を300Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。
スピン後、前回と同様にPBSをスピンダウンし、2回目の洗浄後に上清を除去して、細胞を2回洗浄します。Resusは、細胞ペレットを500マイクロリットルの冷たいPBSに懸濁し、その後、老化細胞の集団をさらに特徴付けるためにco免疫標識を行います。フローサイトメトリーの経験がない場合、この手順の最も難しい側面はフローサイトメトリー分析の実行です。
成功を確実にするために、適切なコントロールを必ず含め、必要に応じて経験の浅い人に支援を求めてください。最初のサンプルを実行する前に、前方散乱チャネルまたはFSC対側方散乱チャネルSSCを表示する2つのパラメータグラフィックを準備します。次に、ラベル付けされていないセルを含む最初のサンプルを実行します。
光電子増倍管またはPMTをセットし、サンプル調製ゲート中に現れた可能性のある死細胞や細胞の破片を除外して、関心領域を定義します。この関心領域は、C 12 FDGの蛍光をx軸の対数スケールとY軸のイベント数にFL 1として表示する1パラメータヒストグラムにあります。イベントの合計数は、解析されたセルの数を表します。
ラベル付けされていないセルが最初の 10 年間に x 軸の対数スケールに表示されるように PMT を設定します。必要に応じて、非標識細胞をフロー中に流して細胞の自家蛍光を測定します。サイトメーターは、未処理の細胞を含む2番目のサンプルを1つのパラメータヒストグラムで実行し、FLを表示し、カーソルを薄暗くラベル付けされた集団の後に置きます。
この閾値により、薄暗く標識された非老化細胞と、明るく標識された老化細胞との間の識別が可能になります。処理した細胞を含む3番目のサンプルを実行します。明るく標識された老化細胞は、前のステップで決定された閾値を超えて現れます。
必要に応じて、明るいイベントの数をイベントの総数で割ることにより、老化細胞の割合を評価します。βガラクトターゼの活性は、化学療法手順によって誘発される老化を評価するために、平均蛍光強度を使用して推定することもできます。市販の多発性骨髄腫細胞株R RRP I 8 2 2 6を、このビデオで説明したように、化学療法薬および老化アッセイであるドキソルビシンで2日間処理しました。これらのヒストグラムは、左側に未処理の細胞、右側に処理された細胞の蛍光を示しています。
老化細胞を表す明るく標識された細胞の集団が領域 V.In 平行に現れ、同じ細胞サンプルをβガラクトサーゼアッセイを用いて染色した。この代表的な写真では、完全に青い細胞と部分的に青い細胞が示されており、真に青い老化細胞を区別することの難しさを示しています。老化細胞の割合の決定におけるC 12 FDGの特異性を説明するために、細胞をさまざまな濃度のドキソルビシンでも処理しました。
老化細胞の割合は、明るいイベントの数を除算することによって決定されました。イベントの総数によると、老化細胞の割合は、5、25、50ナノモルのドキソルビシンの用量でそれぞれ0.8%、15.78%、26.31%でした。これは、C 12 FTG標識が老化細胞に特異的であることを示しています。
このビデオを見た後、老化細胞を定量化する方法を十分に理解しているはずです 老化細胞を定量する方法 フローサイトメトリーによって連続して行うかどうか 老化細胞を特徴付けるために免疫標識のような方法が実行される手順に従います。DMSOやがん細胞を扱う作業は非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行するときは、常に予防措置を講じる必要があります。
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概要
この研究は、標準的なβ-ガラクトシダーゼアッセイの限界に対処し、細胞老化を定量化するための迅速で感度の高いフローサイトメトリベースの検定法を提示します。この方法は、がん細胞に老化を誘導するために化学療法薬ドキソルビシンを使用しています。
主要な研究要素
科学分野
- 細胞生物学
- がん研究
- 薬理学
背景
- 腫瘍形成における老化の役割は議論されています。
- 化学療法薬はがん細胞に老化を誘導できます。
- 現在、老化を測定するアッセイには重大な欠点があります。
- フローサイトメトリはより正確な定量化の潜在的な解決策を提供します。
研究の目的
- 細胞老化を定量化する新しいアッセイを開発すること。
- 老化を誘導する化学療法薬の効果を評価すること。
- 既存の方法よりも感度の高い迅速な代替手段を提供すること。
使用された方法
- ドキソルビシンによる細胞老化の誘導。
- Bain Aによる細胞リソソームの酸性pHの中和。
- 細胞内取り込み測定のためのベータガラクト基質C 12 FDGの使用。
- 老化の定量化のためのフローサイトメトリ。
主な結果
- 新しいアッセイはがん細胞の老化を効果的に定量化します。
- ドキソルビシンは研究で実証されているように、老化を成功裏に誘導します。
- フローサイトメトリは従来の方法と比較して迅速で感度の高い結果を提供します。
- この方法は他の潜在的な化学療法薬のスクリーニングに適用できます。
結論
- フローサイトメトリベースのアッセイは老化の研究のための有望なツールです。
- この方法は新しいがん治療の開発を強化できる可能性があります。
- 様々な文脈での応用を探るためにさらなる研究が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying senescent cancer cells is critical for evaluating chemotherapeutic efficacy and understanding treatment-induced phenotypic shifts that may influence tumor progression or therapeutic resistance. This flow cytometry-based method provides a rapid, sensitive readout to support target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. By enabling high-throughput assessment of senescence induction, it informs go/no-go decisions and portfolio prioritization in preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying senescence as a functional readout of chemotherapeutic mechanism of action.
- Operational Value: Enables rapid screening of compound libraries to identify senescence-inducing agents with improved predictive confidence.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by distinguishing senescence from apoptosis or proliferation in treated cancer cell populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence data to establish dose-response relationships for senescence-inducing compounds.
- Operational Value: Delivers reproducible, high-sensitivity measurements compatible with flow cytometry platforms for scalable assay implementation.
- Scientific Value: Permits multiplexing with immunolabeling to correlate senescence with specific cellular markers or pathways.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro senescence induction to potential in vivo treatment outcomes, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates longitudinal monitoring of senescence dynamics across treatment durations and dosing regimens.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying the proportion of senescent cells under varying therapeutic conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the oncology discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy assessment, providing a quantitative senescence readout that informs mechanistic understanding and compound selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring senescence induction as a downstream effect of chemotherapeutic exposure.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for evaluating compound libraries in a standardized, sensitive format.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts and percentage calculations enabling statistical comparison of treatment conditions.
- Translational Research: Connects cellular senescence data to potential therapeutic outcomes, supporting biomarker-driven decision making.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable flow cytometry workflow applicable across cancer models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in phenotypic responses to treatment.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput compared to traditional β-galactosidase assays, accelerating screening timelines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of senescence-inducing compounds, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of drug candidates based on quantifiable senescence induction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, compensation, and gating strategies for accurate fluorescence quantification.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate fluorescence detection channels and software for histogram analysis.
- Necessitates standardized cell preparation and staining protocols to ensure assay consistency across experiments and users.
- Involves optimization of drug concentration and exposure time for senescence induction across different cancer cell lines.
- Requires inclusion of viability controls to exclude apoptotic or necrotic cells that may confound senescence measurements.
