老化がん細胞を定量化するための感度の高い方法

この手順の全体的な目的は、細胞老化を迅速かつ感度の高い方法で定量化することです。ここでは、潜在的な化学療法剤のスクリーニングにおける本手法の有用性を実証します。まず、細胞老化を誘導します。

化学療法剤であるdoxorubicinをがん細胞に添加します。次に、細胞内リソソームの酸性pHを中和するためにBain A oneを適用します。その後、細胞透過性のβ-ガラクトース基質であるC 12 FDGを添加し、細胞内に取り込ませます。

C 12 FDGが加水分解されると蛍光を発します。β-GCSEは老化細胞のリソソームに濃縮されているため、老化細胞は非老化細胞よりも強い蛍光を示します。蛍光強度の差を定量化するために、細胞をフローサイトメーターで解析し、得られたデータの解析によって、異なる処理条件下における老化がん細胞の割合を定量化することが可能です。

β-ガラクトシダーゼ染色などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、老化細胞を迅速かつ感度良く定量できる点にあります。実際、一般的に用いられているβ-ガラクトシダーゼアッセイによる老化細胞の定量に困難を感じたことが、本手法を考案するきっかけとなりました。本手法はがん細胞の老化検出に用いていますが、正常細胞にも適用可能です。

この手法は、化学療法剤ががん細胞にsse（小胞外分泌）を誘導し、それが悪性度を促進するかどうかなど、がん研究分野における迅速な疑問への回答に役立ちます。したがって、本技術は最終的にがんの新しい治療法の開発に寄与する可能性があります。化学薬品用フード内で、C 12 FDG粉末をDMSOに溶解して最終濃度を20 millimolarとし、0.5 milliliterのエッペンドルフチューブに分注して-80 °Cで保存します。

DMSOは適切な安全条件下で使用してください。また、CIN A 1粉末をDMSOに溶解し、最終濃度を0.1 mMに調製します。この溶液を0.5 mLマイクロ遠心チューブに分注し、-20 °Cで保存します。

注意：CINは適切な安全上の予防措置を講じて使用してください。この手順は、接着細胞および浮遊細胞のいずれを用いてでも実施可能です。ここでは、ヒト骨髄腫細胞株RPMI 8 2 2 6を用いて手順を実演します。

これらの細胞は浮遊状態で増殖します。RPMI 8 2 2 6細胞を、10%FBSおよび1%抗生物質を含む培地を用いて、37 °C、5% CO2条件下で培養します。実験実施の24時間前に、細胞増殖曲線の対数増殖期にある状態で使用できるよう、6ウェルプレートに細胞を播種してください。老化細胞の割合を決定する実験では、未処理かつSA-β-gal染色なしの細胞、C 12 FDGで染色した未処理細胞、およびC 12 FTGで染色した処理済み細胞の3つの細胞サンプルが必要となります。

がん細胞のフローサイトメトリーによる細胞老化を誘導する場合、各条件につき最低5 × 10⁵個の細胞が必要です。化学療法剤であるドキソルビシンを添加する際、薬剤濃度および処理時間は細胞株に合わせて調整してください。本手法はrpmi 8 2 2 6細胞で検証済みです。

1 mLあたり10個の細胞（計6サンプル）を15 nanomolarのドキソルビシンで48時間処理することで、細胞老化を誘導できます。陰性対照として未処理のサンプルを含めることを忘れず、37 °C、5% carbon dioxideの条件下でインキュベートしてください。化学療法剤による処理は、細胞アポトーシスを引き起こす可能性があります。

したがって、2日後に、血球計数器と顕微鏡を用いてトリパンブルー排除法により細胞生存率を確認します。生存率が70%未満の場合は、後の解析に死細胞が影響を与えないよう、Milton Eのdead cell removal kitなどの適切なキットを使用して死細胞を除去してください。それ以外の場合は、細胞を300 Gで5分間遠心分離して培養液を除去します。

次に、上清を除去した後、リソソームの酸性pHを中和するために100 nMのcin, Aを含む予熱した新鮮な培地で、37°C、5% CO₂条件下で1時間インキュベートします。β-ガラクトシダーゼ基質であるC12 FDGを予熱した新鮮な培地に溶解し、最終濃度を2 mMにします。その後、beilmycinを用いてインキュベートします。

C 12 FDGを最終濃度33 µMになるように細胞および培地に直接添加し、37 °C、5% CO2条件下で2時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を4 °Cで300 ×g、5分間遠心分離します。

遠心分離後、PBSで細胞を2回洗浄し、毎回同様に遠心分離を行い、2回目の洗浄後に上清を除去します。細胞ペレットを500 µLの冷PBSに再懸濁し、共免疫染色を行って細胞老化細胞集団をさらに特性解析します。フローサイトメトリーの経験がない場合、この手順で最も困難な点はフローサイトメトリー解析の実施になります。

確実に成功させるために、適切なコントロールを含めるようにし、必要に応じて経験のない担当者にサポートを求めてください。最初のサンプルを測定する前に、前方散乱光（FSC）対側方散乱光（SSC）を表示する2パラメータプロットを準備します。その後、未標識細胞を含む最初のサンプルを測定してください。

光電子増倍管（PMT）を設定し、サンプル調製時に発生した可能性のある死細胞や細胞 debris を除外して、関心領域（ROI）を定義します。この関心領域は、X軸の対数スケールに FL1 として C 12 FDG の蛍光強度を、Y軸にイベント数を表示した 1 パラメーターのヒストグラムで設定します。総イベント数は、解析された細胞数に相当します。

ラベルのない細胞がx軸のログスケールの最初の10倍（first decade）に表示されるようにPMTを調整します。必要に応じて、ラベルのない細胞をフローサイトメーターで測定し、細胞の自家蛍光を確認してください。未処理の細胞を含む2番目のサンプルを測定し、FL1を表示する1パラメータヒストグラム上で、弱くラベルされた細胞集団の後方にカーソルを配置します。

このしきい値により、淡く染色された非老化細胞と、強く染色された老化細胞を判別することが可能になります。処理済みの細胞を含む3番目のサンプルを測定してください。強く染色された老化細胞は、前のステップで決定したしきい値よりも高い値として現れます。

必要に応じて、輝度の高いイベント数を全イベント数で除して、老化細胞の割合を算出してください。また、化学療法処置によって誘導された老化を評価するために、平均蛍光強度を用いてβ-ガラクトシダーゼの活性を推定することも可能です。市販の多発性骨髄腫細胞株RRPI 8226を、化学療法剤であるドキソルビシンで2日間処理し、本ビデオで説明した老化アッセイに供しました。これらのヒストグラムは、左側に未処理細胞、右側に処理済み細胞の蛍光を示しています。

領域Vに、老化細胞を示す明るく標識された細胞集団が現れます。並行して、同一の細胞サンプルをβ-ガラクトシダーゼアッセイを用いて染色しました。この代表的な画像では、完全に青色に染まった細胞と部分的に青色に染まった細胞が示されており、真に青色の老化細胞を判別することの困難さが分かります。老化細胞の割合の決定におけるC 12 FDGの特異性を説明するため、細胞にさまざまな濃度のドキソルビシンも投与しました。

老化細胞の割合は、ブライトイベント（bright events）の数を全イベント数で除して決定した。ドキソルビシンの投与量が 5、25、および 50 nanomolar の場合、老化細胞の割合はそれぞれ 0.8%、15.78%、および 26.31%であった。これは、C 12 FTG ラベル化が老化細胞に特異的であることを示している。

このビデオを視聴することで、フローサイトメトリーを用いて老化細胞を定量化する方法や、老化細胞を特性解析するために免疫標識などの手法をどのように実施すべきかについて、十分に理解できるはずです。DMSOやがん細胞を取り扱う際は非常に危険を伴う可能性があることを忘れないでください。本手順を実施する際は、常に十分な予防措置を講じてください。