Name: 誘導および定量化細胞老化するテクニック (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学ぶ細胞老化の誘導とマーカー定量法。ガンマ線照射やSA-β-gal染色など多様な手法を用いて、細胞および個体の老化を調節する生物学的要因を解明し、がん研究や加齢研究に応用できます。

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この研究は、米国立衛生研究所の学内研究プログラム、アメリカ国立老化研究所によってサポートされていました。著者らはまた、批判的に原稿を読み取るための老化とKotb Abdelmohsenに関する多くの有用な議論のためにマイリアム・ゴロスプとKotb Abdelmohsenに感謝したいです。我々はまた、批判的に原稿を読み取るため、特にダグラス・ドルズン私たちの研究室のメンバーに感謝します。

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<li>Tominaga-Yamanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+coordinately+represses+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype.</a> Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).</li>
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<li>Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+control+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA control of cellular senescence.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).</li>
<li>Bhaumik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-146a%2Fb+negatively+modulate+the+senescence-associated+inflammatory+mediators+IL-6+and+IL-8%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8.</a> Aging. 1 (4), 402-411 (2009).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-SCARS%3A+distinct+nuclear+structures+that+sustain+damage-induced+senescence+growth+arrest+and+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion.</a> J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).</li>
<li>Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cell+and+organ+senescence+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Assessing cell and organ senescence biomarkers.</a> Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).</li>
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<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin-mediated+increase+in+DICER1+regulates+microRNA+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence.</a> Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).</li>
<li>Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+as+a+Tool+to+Target+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin as a Tool to Target Aging.</a> Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).</li>
<li>Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin%3A+from+mechanisms+of+action+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin: from mechanisms of action to therapies.</a> Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).</li>
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<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+detection+of+senescence-associated+beta+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase.</a> Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).</li>
<li>Redon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+detection+in+peripheral+blood+lymphocytes%2C+splenocytes%2C+bone+marrow%2C+xenografts%2C+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin.</a> Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Kennedy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+mouse+cells+fail+to+overtly+regulate+the+HIRA+histone+chaperone+and+do+not+form+robust+Senescence+Associated+Heterochromatin+Foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci.</a> Cell Div. 5, 16(2010).</li>
</ol>

著者は、開示することは何もありません。

ここでは、ヒト二倍体線維芽細胞を使用して複製し、DNA損傷誘発性老化のための方法を記載しています。加えて、種々の老化関連タンパク質のタンパク質およびmRNAレベルを定量するための技術が含まれ、ならびにSA-β-galのため及びDNA損傷マーカーγ-H2AXの染色します。多くの注意点は、インビボ 20 に老化を特徴付けるために存在するが、これらのプロトコルは、広く、in vitroおよびin vivoの両方老化表現型を評価するために使用することができます。他の細胞は、それらが老化細胞でない場合でも、老化マーカーを発現することができます。例えば、そのような破骨細胞およびマクロファージのような細胞は、β-gal活性32,33のより高いレベルを有します。また、多くの癌細胞は、P16のINK4A 34をアップレギュレートされています。細胞は、DNA損傷（ 例えば、γ...

半世紀以上前に、ヘイフリックらは、培養液中で増殖する方法を非形質転換細胞述べたが、時間が1しか有限期間のため。ヒト線維芽細胞の長期培養は、細胞が増殖を停止させました。しかし、彼らは代謝的に活性であったが、これは細胞の老化と呼ばれていました。老化は、腫瘍形成を阻害するために有益であることができるが、老化2、3で発生再生能力の損失に寄与すると考えられているとしても、有害であることができます。老化細胞は、4歳の人間と胚発生、創傷治癒、組織修復、および年齢に関連した炎症2を含む生物学的プロセスの数に関与しているとして、組織に蓄積することが示されています。 培養中の細胞の継続的な継代は、リンクされている複製老化を誘導し、テロメア損耗とゲノム不安定性へ。 DNA損傷および癌遺伝子を含む種々の細胞ストレスも、老化3を引き起こす可能性があります。テロメア損耗以外の要因による老化は、多くの場合、ストレス誘導や早期老化と呼ばれ、一般のp16 INK4A / RB経路5に依存しています。増殖し、非形質転換細胞は、典型的には、形状のスピンドルに見えるが、老化細胞は、平坦な、大型形態および増加老化関連βガラクトシダーゼ活性（SA-β-GAL）（ 図1および2）を含む特定の特性を有するものとして同定することができます。老化細胞はまた、γ-H2AX（ 図3）6、及び、潜在的に、老化関連ヘテロ病巣（SAHF）（ 図4）7を含む、DNA損傷マーカーを蓄積します。老化細胞は、Pを含む細胞周期調節因子の高いレベルを持っています<html> 16（P16 INK4A）および/またはp21およびp53の（ 図5）8、9。また、最近のデータは、老化細胞は、炎症性サイトカインおよびケモカインの数を分泌することによって、非自律的な効果を有し得ることを示した老化関連分泌表現型（SASP）10と呼ばれます。このSASP現象は、一般に、細胞型への細胞タイプによって異なる場合があるが、それはインターロイキン6（IL-6）の増加によって実証される、IL-8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、増殖 - 調整された癌遺伝子α（GRO-α）、およびGRO-β、とりわけ（ 図6）。老化を誘導する特定のストレスまたは損傷はまた、分泌表現型11、12、13に影響を与え得ます。 SASPは、ELISA法またはサイトカイン/タンパク質アレイを用いて、分泌タンパク質のレベルを測定することによって検出することができますS = &quot;外部参照&quot;&gt; 10、14。転写後機構がSASPタンパク質レベル11、15、16、17を調節することができるが、mRNAレベルの変化はまた、多くの場合に検出することができます。これらの変更は、一般的に、より敏感とタンパク質レベルの測定より定量化するのが容易です。他の老化マーカーはまた、永続的なDNA損傷核フォーカス、老化（DNA-SCARS）18補強クロマチン変化と呼ばれるDNAセグメント、および様々な他のマーカー3、19、20を含め、評価することができます。 ここでは、SA-β-Galを、γ-H2AX、SAHF、およびタンパク質および老化のmRNAを含む、培養中の細胞に老化を誘導し、また老化のいくつかのマーカーを測定するための一般的な技術を記述しますNCE関連分子。

<table><tbody><tr><td>16% Tris-glycine gels</td><td>Invitrogen</td><td>XP00160BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol ChCl3</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 568 ヤギ抗マウス抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11031</td><td>1:300</td></tr><tr><td>希釈 Cell Lifters</td><td>Corning Inc.</td><td>3008</td><td>Cell scraper</td></tr><tr><td>ECL anti-mouse HRP linked antibody</td><td>Amersham</td><td>NA931V</td><td></td></tr><tr><td>ECL Plus Western Blotting Substrate</td><td>Pierce</td><td>32132</td><td>ECL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>MP01306</td><td>5 mg/mL in dH2O</td></tr><tr><td>GAPDH 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32233</td><td>1:1,000 - 5,000 希釈</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>ヒストン H3 ジメチル K9 モノクローナル抗体</td><td>Abcam</td><td>1220</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>ヒト IL-6 Quantikine ELISA アッセイ</td><td>R&Dシステム</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>ヒトIL-8 Quantikine ELISAアッセイ</td><td>R&Dシステム</td><td>D8000C</td><td></td></tr><tr><td>ヒト GROa Quantikine ELISA アッセイ</td><td>R&Dシステム</td><td>ズDRG00</td><td></td></tr><tr><td>N-N-ジメチルホルムアミド&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td>DMF</td></tr><tr><td>p16 モノクローナル抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>51-1325gr</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>p21 モノクローナル抗体</td><td>Millipore</td><td>05-345</td><td>1:750 希釈</td></tr><tr><td>p53 モノクローナル抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>1:500 希釈 クローン DO-1</td></tr><tr><td>phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9719</td><td>1:2,000希釈</td></tr><tr><td>POWERSYBR-グリーンPCRマスターミックス&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>染色済み分子量マーカー</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>PVDF メンブレン&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>老化 &β;-ガラクトシダーゼ染色キット</td><td>Cell Signaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion/Life Tech</td><td>10296028</td><td></td></tr></tbody></table>

誘導および定量化細胞老化するテクニック

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

細胞ストレスやダメージを受けて、増殖細胞は、細胞の老化と呼ばれる長期的な細胞周期停止の状態を開始し、特定のプログラムを、誘導することができます。老化細胞の蓄積は、生物加齢とし、in vitroでの継続的な培養を介して行われます。老化細胞は、胚発生、組織修復及び再生、腫瘍抑制、および老化を含む多くの生物学的プロセスに影響を与えます。老化細胞の顕著な特徴としては、増加した老化関連βガラクトシダーゼ活性（SA-β-GAL）が、これらに限定されません。 p16 INK4A、p53及びp21レベル。 γ-H2AXを含むDNA損傷のより高いレベル、。老化関連ヘテロクロマチン病巣（SAHF）の形成。及び老化関連分泌表現型（SASP）、炎症性サイトカインおよびシグナル伝達分子の数の分泌によって特徴付けられる現象の取得。ここでは、我々は両方の複製のためのプロトコルを記述し、培養細胞におけるDNA損傷誘発性老化。加えて、我々は、SA-β-galを、γ-H2AXおよびSAHF染色を含むいくつかの老化関連マーカーを使用して老化表現型を監視するため、および細胞周期調節およびSASP因子のタンパク質およびmRNAレベルを定量するための技術を強調する。これらの方法には様々なモデルや組織における老化の評価に適用することができます。

図2から6は、SA-β-gal染色からの代表的結果を示します。 γ-H2AXとSAHFのための染色; p16 INK4A、P21、およびp53のタンパク質レベルの評価;そしてmRNAおよび老化関連分子のタンパク質レベル。増加したSA-β-gal染色は、複製およびDNA損傷誘導性の老化で生じます。また、老化で起こる形態学的変化を観察。細胞が増殖し、線維芽細胞のスピンドル外観に比べ拡大して平坦になります。この実験的パラダイムのために、細胞を染色し、RNA /タンパク質は、IR曝露後7 Dを単離しました。より堅牢な結果は、IR暴露（ すなわち 10 d）の後に長く待つことによって発生する可能性があります。条件は各条件と実験のセットアップのために決定する必要があります。これらの結果は、代表的なものであると老化は、他の方法を用いて誘導されたときに、これらのマーカーも検出することができます。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= &qu...

細胞老化、細胞周期停止の不可逆的な状態は、様々な細胞ストレスによって誘導することができます。ここでは、老化のマーカーを評価するために、細胞の老化や方法を誘導するためにプロトコルを記述します。

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

これらの技術の全体的な目標は、細胞老化の誘導、モニタリング、および定量化を可能にするツールボックスを提供することです。これらの方法は、細胞老化の同定と定量化、および細胞および生物の老化を調節する生物学的因子に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、さまざまなモデル、組織、および細胞タイプの細胞老化を監視するためのさまざまな方法を網羅していることです。まず、目的の早期継代増殖細胞を、分析に適したディッシュにまばらな密度でプレーティングします。そして、組織培養インキュベーターで細胞を一晩培養します。細胞が50〜60%コンフルエントになったら、増殖培地を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞をPBSの薄層で覆います。そして、細胞を10グレードのガンマ線量に1回さらします。PBSを成長培地と交換します。そして細胞をインキュベーターに戻します。48〜72時間ごとに培地を交換し、光学顕微鏡で形態学的変化を毎日監視します。照射後7〜10日後に、市販の老化関連β-ガラクトシダーゼアッセイキットから得られたすべての試薬を37°Cの水浴で解凍します。すべての試薬が室温に達したら、製造元の指示に従って固定液と染色液を調製します。そして、室温のPBSで各ウェルをやさしく洗います。老化細胞はよく接着せず、洗浄中に簡単に除去できるため、細胞を注意深くすすぐように注意してください。各ウェルの細胞をウェルあたり1ミリリットルの固定液で室温で10〜15分間固定します。その後、ウェルごとにPBSによる2ミリリットルの洗浄が2回行われます。次に、各ウェルに1ミリリットルのβ-ガラクトシダーゼ染色溶液を加え、プレートをアルミホイルで覆い、二酸化炭素を含まない摂氏37度のインキュベーターで24〜48時間培養します。24時間後にセルを確認します。細胞が十分に染色されたら、β-gal溶液を新鮮なPBSに交換し、カメラが取り付けられた光学顕微鏡で10倍以上の対物レンズで培養物を調べます。老化に関連するβ-ガラクトシダーゼ細胞は青色に見えます。次に、ウェルごとに少なくとも5つのオーバーラップしない画像を取得します。また、老化関連β-ガラクトシダーゼ陽性細胞の総数と画像あたりの細胞の総数を手動でカウントし、ウェルあたりの老化関連β-ガラクトシダーゼ細胞の割合を計算します。ガンマ線照射の10日後、PBSで細胞を3回洗浄します。最後の洗浄後、PBSを2.5ミリリットルの無血清培地と交換し、6センチメートル皿あたり抗生物質を補充し、細胞を組織培養インキュベーターに一晩戻します。翌朝、メディウムを氷の上の円錐形のチューブに移します。そして、新鮮なPBSで細胞を2回洗います。次に、トリプシンをかけて細胞を数えます。次に、細胞培養プレートから採取した上清を遠心分離します。次に、0.45マイクロメートルのシリンジストレーナーでろ過し、ELISAによる分析まで、摂氏80度で500マイクロリットルのアリコートで培地を凍結します。老化の増加は、複製的およびDNA損傷による老化を伴って、β-gal染色に関連します。老化細胞の平坦な形状が拡大していることに注目してください。これは、増殖する線維芽細胞の紡錘体のような外観と比較してです。この実験では、増殖する若いまたは複製的な老化細胞を、書面によるプロトコルに記載されているように固定しました。また、DNA二本鎖切断およびDAPIのバイオマーカーに対する抗体で染色します。DNA二本鎖切断フォシの数が明らかに増加し、老化細胞で観察されます。老化に関連する分泌表現型因子のRT-qPCR解析により、ガンマ線照射により低通過ヒト二倍体線維芽細胞の老化がmRNAレベルで増加したことが明らかになりました。これは、ガンマ線を照射した細胞培養上清のELISAによってさらに確認されます。一度習得すれば、DNA損傷誘導とSAベータガル染色は、約30分のハンズオン時間で完了することができます。SASPタンパク質レベルを定量するためのコンディション培地は、約30分で調製できます。この手順を試行する際は、老化マーカーの定量に進む前に、細胞培養で形態学的変化を経ているそれらを監視することを覚えておくことが重要です。その開発後、これらの技術は、老化と癌の分野の研究者がさまざまな組織、細胞培養、およびモデル生物の老化を研究するための道を開きました。このビデオを見れば、細胞老化を誘導、モニタリング、定量化する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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老化がん細胞を定量化するための感度の高い方法

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傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

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セノ治療薬同定のためのSA-β-ガラクトーシダーゼベーススクリーニングアッセイ

このプロトコルは、パルスSILACによる老化細胞および非分裂細胞の代謝標識、非標的質量分析分析、およびタンパク質半減期の合理化された計算のためのワークフローを記述します。...

代謝標識および質量分析による老化および非分裂培養細胞におけるタンパク質代謝回転率の測定

ここでは、単一細胞における複数の老化関連マーカーの可視化および定量化のためのフローサイトメトリーベースの方法を提示する。...

治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

細胞培養またはマウス腫瘍モデルにおける化学療法薬によって誘導された老化癌細胞の蛍光フローサイトメトリー定量のためのプロトコルが提示されます。オプションの手順には、共免疫染色、大規模なバッチまたは時点分析を容易にするためのサンプル固定、およびフローサイトメトリーソーティングによる生細胞濃縮が含まれます。...

フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ

多重免疫蛍光は、単一の組織切片内で複数の抗体マーカーを逐次標識し、組織構造や細胞集団の空間解析を支援します。ここでは、老化に関連する構造的および免疫マーカーの多重検出のためのワークフローを紹介し、手動および自動スライド準備、反復画像診断、デジタル病理ソフトウェアを用いた単細胞解析を含みます。...

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ヒト線維芽細胞における細胞老化の定量的評価のためのLysoTrackerを用いたリソソームプロファイリング

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老化細胞の調整培地を用いたin vitro モデルにおける健康な細胞間コミュニケーション回復のための抗酸化剤の新規結合

学ぶ細胞老化の誘導とマーカー定量法。ガンマ線照射やSA-β-gal染色など多様な手法を用いて、細胞および個体の老化を調節する生物学的要因を解明し、がん研究や加齢研究に応用できます。

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