誘導および定量化細胞老化するテクニック

これらの技術の全体的な目標は、細胞老化の誘導、モニタリング、および定量化を可能にするツールボックスを提供することです。これらの方法は、細胞老化の同定と定量化、および細胞および生物の老化を調節する生物学的因子に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、さまざまなモデル、組織、および細胞タイプの細胞老化を監視するためのさまざまな方法を網羅

まず、目的の早期継代増殖細胞を、分析に適したディッシュにまばらな密度でプレーティングします。そして、組織培養インキュベーターで細胞を一晩培養します。細胞が50〜60%コンフルエントになったら、増殖培地を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄します。

2回目の洗浄後、細胞をPBSの薄層で覆います。そして、細胞を10グレードのガンマ線量に1回さらします。PBSを成長培地と交換します。

そして細胞をインキュベーターに戻します。48〜72時間ごとに培地を交換し、光学顕微鏡で形態学的変化を毎日監視します。照射後7〜10日後に、市販の老化関連β-ガラクトシダーゼアッセイキットから得られたすべての試薬を37°Cの水浴で解凍します。

すべての試薬が室温に達したら、製造元の指示に従って固定液と染色液を調製します。そして、室温のPBSで各ウェルをやさしく洗います。老化細胞はよく接着せず、洗浄中に簡単に除去できるため、細胞を注意深くすすぐように注意してください。

各ウェルの細胞をウェルあたり1ミリリットルの固定液で室温で10〜15分間固定します。その後、ウェルごとにPBSによる2ミリリットルの洗浄が2回行われます。次に、各ウェルに1ミリリットルのβ-ガラクトシダーゼ染色溶液を加え、プレートをアルミホイルで覆い、二酸化炭素を含まない摂氏37度のインキュベーターで24〜48時間培養します。

24時間後にセルを確認します。細胞が十分に染色されたら、β-gal溶液を新鮮なPBSに交換し、カメラが取り付けられた光学顕微鏡で10倍以上の対物レンズで培養物を調べます。老化に関連するβ-ガラクトシダーゼ細胞は青色に見えます。

次に、ウェルごとに少なくとも5つのオーバーラップしない画像を取得します。また、老化関連β-ガラクトシダーゼ陽性細胞の総数と画像あたりの細胞の総数を手動でカウントし、ウェルあたりの老化関連β-ガラクトシダーゼ細胞の割合を計算します。ガンマ線照射の10日後、PBSで細胞を3回洗浄します。

最後の洗浄後、PBSを2.5ミリリットルの無血清培地と交換し、6センチメートル皿あたり抗生物質を補充し、細胞を組織培養インキュベーターに一晩戻します。翌朝、メディウムを氷の上の円錐形のチューブに移します。そして、新鮮なPBSで細胞を2回洗います。

次に、トリプシンをかけて細胞を数えます。次に、細胞培養プレートから採取した上清を遠心分離します。次に、0.45マイクロメートルのシリンジストレーナーでろ過し、ELISAによる分析まで、摂氏80度で500マイクロリットルのアリコートで培地を凍結します。

老化の増加は、複製的およびDNA損傷による老化を伴って、β-gal染色に関連します。老化細胞の平坦な形状が拡大していることに注目してください。これは、増殖する線維芽細胞の紡錘体のような外観と比較してです。この実験では、増殖する若いまたは複製的な老化細胞を、書面によるプロトコルに記載されているように固定しました。

また、DNA二本鎖切断およびDAPIのバイオマーカーに対する抗体で染色します。DNA二本鎖切断フォシの数が明らかに増加し、老化細胞で観察されます。老化に関連する分泌表現型因子のRT-qPCR解析により、ガンマ線照射により低通過ヒト二倍体線維芽細胞の老化がmRNAレベルで増加したことが明らかになりました。

これは、ガンマ線を照射した細胞培養上清のELISAによってさらに確認されます。一度習得すれば、DNA損傷誘導とSAベータガル染色は、約30分のハンズオン時間で完了することができます。SASPタンパク質レベルを定量するためのコンディション培地は、約30分で調製できます。

この手順を試行する際は、老化マーカーの定量に進む前に、細胞培養で形態学的変化を経ているそれらを監視することを覚えておくことが重要です。その開発後、これらの技術は、老化と癌の分野の研究者がさまざまな組織、細胞培養、およびモデル生物の老化を研究するための道を開きました。このビデオを見れば、細胞老化を誘導、モニタリング、定量化する方法について十分に理解できるはずです。