定量ゾルゲル由来のタンパク質マイクロアレイを開発するためのガイド材料スクリーニングアプローチ

本手順の全般的な目的は、マイクロアレイ作製に向けた新しいゾル-ゲルベースの材料を同定し、それらをナノボリューム酵素アッセイに使用することである。これは、まず、印刷プロセス中にマイクロアレイ印刷ピン内でのゲル化を避けるために、十分に長いゾル状態維持時間を有する材料を同定することで達成される。第二のステップは、長いゾル状態維持時間を有する材料について、マイクロアレイとしての印刷再現性、耐亀裂性、密着品質、好ましくない相分離の有無、そして最終的に、封入された酵素の高い活性を評価することである。

次に、最適化された材料を用いて目的の酵素をマイクロアレイとしてプリントし、アッセイ溶液をスポットして測定可能な酵素反応を生成できるかを確認します。最終ステップでは、目的の酵素を用いて高い再現性を持つアッセイを提供し、定量的なデータを生成できるかについて材料を評価します。これにより、アレイ作製に用いる最終的な材料を選定します。

最終的に、ソールゲル由来のタンパク質マイクロアレイを用いて、酵素活性を低下させる低分子化合物を同定します。プレートベースのスクリーニングなどの既存の手法に対するこの方法の主な利点は、少量の試薬を用いて、大量の材料を系統的にかつ非常に迅速にスクリーニングできることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、プリンティングピン内部で材料がゲル化することがあるため、苦労することがあります。

これらが適切に洗浄されない場合、汚れが残り、それが非印刷材料として解釈される可能性があります。まず、付随するテキストプロトコルに従って、多数の添加剤溶液を調製します。多くの溶液はあらかじめ調製し、適切な条件下で1ヶ月またはそれ以上の期間保存可能ですが、一部の溶液は実験当日に調製する必要があります。

ケイ酸ナトリウムベースのSOSは使用直前に混合し、必ず氷上で保持してください。水を加えてから1時間以内にSOSを使用する必要があります。待機時間が長くなると、DATION時間が短縮し、不均一になるためです。次に、付随するテキストプロトコルの指示に従い、バッファー、salansポリマー、およびorgans lanesの様々な組み合わせを調製し、2.5時間以上の拡張時間を持ち、プリント可能な材料として使用できる組み合わせを特定します。

いくつかの組み合わせが特定されたら、印刷チャンバー内の湿度を80〜90%に設定します。湿度を80%未満にすると、プリンターでの堆積量が少ないため、サンプルの蒸発や印刷の不整合が生じる可能性があります。準備が整ったら、Chip Writer Proプログラムを使用して印刷するアレイパターンを配置します。XY方向の移動速度を10 millimeters per secondに、Z方向のサンプル接近速度を2 millimeters per secondに設定し、前述で特定したsaw gelの組み合わせを用いて、サンプルロード時間を2.5 secondに設定します。

事前スクリーニングプロセスで特定した対応するポリマー、オルガノレーン、および低分子添加剤を混合し、ベース材料を25 µL準備します。pH 8.0の50 mM HEPESを384ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに分注します。次に、直径100 µmの4本のスロット付きシースピンを、2回蒸留水中で超音波処理します。

15分後、窒素気流で乾燥させます。次に、パイプクリーナーを使用してピンホルダー内部の残留水分を取り除き、コンタクトピン印刷ロボットのプリントヘッドに慎重にピンを配置します。残留水分を取り除かないと、ピンがホルダー内で自由に動かず、スポットの欠損につながる可能性があります。

その後、プリンティングの直前に、各SA 25 µLをウェルに加えます。ピペットで混合する場合は、ピペッティングを50回繰り返し、溶液を混ぜ合わせます。この際、溶液に混入する空気量は最小限に抑えてください。

気泡が混入すると、ピン内にサンプルを完全に充填することができません。次に、ピンをサンプルの中に下げて充填します。ピンへの充填が完了したら、プリンティングプロセスを開始し、スライドの表面にサンプルをプリントします。

次のソースプレートに塩を加える前に、プリンティング工程を一時停止させます。工程を停止させた状態で、マグネットを用いてプリンティングピンを取り出し、プリントヘッド内に水分が蓄積するのを防ぐため、プリントヘッドにパイプクリーナーを挿入します。その後、プリンティングピンを二回蒸留水で洗浄し、きれいな二回蒸留水中で30秒間超音波洗浄します。

次に、窒素気流でプリンティングピンを乾燥させ、ピンをプリントヘッドに戻します。ソースプレートに残りのすべてのサンプルについて、混合、プリント、洗浄を繰り返します。1枚のスライドに、直径100 µmのスポットを最大12,000個まで配置することが可能です。プリント終了後、湿度80〜90%のプリントチャンバー内で、アレイを最低30分から最大24時間熟成させます。

使用直前に、1 mMのアセチルコリンヨウ化物 25 µLと、5 mM BODIPY-FL-cysteineおよびpH 7.0の25 mM Tris（4% glycerol含有）0.14 µLを384ウェルマイクロタイタープレートのウェル内で混合し、ポジティブコントロールを50 µL調製します。気泡が発生しないよう、ピペットでゆっくりと吸い上げと排出を繰り返して混合してください。次に、使用直前にネガティブコントロールを調製します。5 mM BODIPY-FL-cysteine 0.14 µLを、pH 7.0の25 mM Tris（4% glycerol含有）49.86 µLに加え、384ウェルマイクロタイタープレートの別のウェルで穏やかに混合します。前節で説明した手順と同様の手法を用いて、これらのコントロールをエージング済みマイクロアレイ上にプリントします。ただし、直径100 µmのピンではなく、直径235 µmのスロットチップピンを使用してください。

これにより、溶液が以前にスポットされた箇所を完全に覆うことができます。アセチルコリンの自動加水分解のため、スポットしたアレイを室温、湿度80〜90%で1時間静置して熟成させます。インキュベーション時間が長すぎると、酵素活性の亢進により偽陽性が生じる可能性があります。

alpha innotech novo array imagerの電源が入っていることを確認し、アセチルコリンエステラーゼマイクロアレイの測定用に、励起フィルターとして478 ± 17 nm、蛍光フィルターとして538 ± 21 nmのフィルターを装着します。次に、スポット面を上にしてスライドをスライドホルダーにセットします。オートエクスポージャーを用い、最低分解能4 µmで、マイクロस्ライドの両端に少なくとも1つずつプレビューセクションが含まれるようにプレビューセクション数を設定してください。

パラメータが適切であると確認できたら、スライド画像を撮影し、TIFFファイルとして保存します。次に、取得したスライド画像をImageJ 64で開きます。楕円選択ツールをクリックし、各スポットを選択してください。

観察されたスポットよりもわずかに大きい領域を選択します。Image Jによる主観性を排除するため、スポット間でのサイズを統一してください。次に、[Analyze]タブにある[Measure]オプションを使用して、各スポットの信号強度を測定します。25個の同様のポジティブコントロールスポットの平均強度を求め、それを25個の同様のネガティブコントロールスポットの平均強度で除することで、個々の材料組成におけるポジティブコントロール対ネガティブコントロール比を算出します。

本手法を用いて作製されたマイクロアレイのダイナミックレンジの例をここに示します。ハイコントロールでは明るい緑色の領域が見られ、一方でローコントロールではスポットが大幅に暗くなっています。Image J 64で測定した輝度では、ハイコントロールの平均は約22,000相対蛍光単位であり、ローコントロールの平均は8,000に近い値でした。

点線は平均値から3標準偏差離れた範囲を示しています。ここでは、化合物1および化合物2として同定されたアメラルシエールアルカロイドの合成アナログのオーナアレイスクリーニングにおけるマイクロアレイの例を示します。両軸は、蛍光シグナルによって決定された酵素のパーセンテージを表しています。

二連（duplicate）において、ドットが対角線に近いほど、アッセイの再現性が高いことを示しています。ここでは、2種類の異なる潜在的阻害剤のIC 50プロットを示しています。化合物1のIC 50値は16 micromolarであったのに対し、化合物2のIC 50値は21 micromolarでした。阻害剤濃度に比例した信号強度の違いを説明するため、代表的なスポットを上に表示しています。

ここに示されているアレイは、4種類の異なるキナーゼ（P 38 map kinase、EGFR、GSK）を用いてプリントされ、さらにバッファーのみ、ATPを含むバッファー、および酵素活性阻害剤であるstaurosporinとATPを含むバッファーでオーバープリントされました。結果として得られた蛍光強度の記述に基づくと、キナーゼ阻害剤であるstaurosporinによる有意な影響が認められます。本実験で使用したstaurosporinの濃度において最も顕著な差が見られたのは、P 38のスポットでした。

ここでは、さまざまな濃度のstor sporinをオーバースポットしたP 30 8:00 AM BPマイクロアレイの代表的なスポットを示します。記載の通り、この分子のIC 50は1 micromolarと決定され、習得後は右側のグラフに示されるように表示されます。本手順に従って適切に実施すれば、この手法は数時間で完了させることができます。

診断や低分子化合物の探索に関連するさらなる疑問を解決するために、免疫測定法やタンパク質相互作用解析などの他の手法を用いることも可能です。