定量ゾルゲル由来のタンパク質マイクロアレイを開発するためのガイド材料スクリーニングアプローチ

この手順の全体的な目標は、マイクロアレイ製造用の新しいソウルゲルベースの材料を特定し、これらをナノボリューム酵素アッセイに使用することです。これは、まず、印刷プロセス中にマイクロアレイ印刷ピンがゲル化するのを防ぐのに十分な長いイオン時間を持つ材料を特定することによって達成されます。第2のステップは、マイクロアレイとして印刷する能力、再現性、クラックに対する耐性、接着品質、望ましくない相分離、そして最終的には閉じ込められた酵素に対する高い活性について、長時間の材料を評価することです。

次に、目的の酵素を最適な材料を使用してマイクロアレイとして印刷し、アッセイ溶液をオーバースポットして測定可能な酵素応答を生成する能力をテストします。最後のステップは、目的の酵素を使用して再現性の高いアッセイを提供し、定量データを生成する能力について材料を評価することです。次に、アレイ製造の最終的な材料が選択されます。

最終的に、ソウルゲル由来のタンパク質マイクロアレイを使用して、酵素活性を低下させる低分子を同定します。プレートベースのスクリーニングなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、少量の試薬を使用して、多数の材料を体系的に非常に迅速にスクリーニングできることです。一般に、この技術に不慣れな個人は、印刷ピン内に材料がゲル化している可能性があるため、苦労します。

これらを適切に洗浄すると、印刷不可能な材料と解釈できるスポットが見落とされます。まず、付属のテキストプロトコルで説明されている多数の添加剤溶液を準備します。多くの溶液は、正しい条件下で最大1か月以上事前に作成して保存できますが、実験当日に作らなければならないものもあります。

ケイ酸ナトリウムベースののこぎりは使用直前に混ぜ、必ず氷の上に置いてください。SOSは、待ち時間が長くなるとDATION時間が減少し、一貫性がなくなるため、水を追加してから1時間以内に使用する必要があります。次に、添付のテキストプロトコールの指示に従って、バッファー、salansポリマー、および臓器レーンのさまざまな組み合わせを調製し、拡張時間が2.5時間を超える印刷可能な材料として使用できる組み合わせを特定します。

いくつかの組み合わせが特定されたら、印刷チャンバー内の湿度を80〜90%に設定します湿度が80%未満の場合、プリンターでの堆積量が少ないため、サンプルが蒸発し、印刷に一貫性が生じる可能性があります。準備ができたら、Chip Writer Proプログラムを使用して印刷するアレイパターンを配置します。XY方向の移動を毎秒10ミリメートルに設定し、Z方向のサンプルアプローチ速度を毎秒2ミリメートルに設定し、前述のソーゲルの組み合わせを使用してサンプルをロードする時間を2.5秒とします。

25マイクロリットルの基材を調製し、対応するポリマー、オルガノレーン、および事前スクリーニングプロセスで同定した低分子添加剤を組み合わせて調製します。pH 8.0 の 50 ミリモル ヒープを 384 ウェル マイクロタイター プレートの個々のウェルに使用。次に、直径100ミクロンのスロット付きシースピンを最大4本まで二重蒸留水で超音波処理します。

15分後、窒素の流れの下で試してみてください。次に、パイプクリーナーでピンホルダー内の残留水分を抜き、コンタクトピン印刷ロボットのプリントヘッドにピンを慎重に配置します。残留水分を取り除かないと、ピンがホルダーと自由に動くのが妨げられ、スポットが見逃される可能性があります。

次に、印刷の直前に、それぞれのSAの25マイクロリットルをウェルに加えます。ピペットで混合する際には、ピペッティングを上下に行うことで溶液を50回繰り返します。溶液に取り込まれる空気の量を最小限に抑えます。

気泡は、ピン内にサンプルが完全にロードされるのを防ぎます。次に、ピンをサンプルに下げてロードします。ピンがロードされたら、印刷プロセスを開始し、サンプルを1つのスライド面に印刷します。

後続のソースプレートに塩を追加する前に、印刷プロセスを一時停止します。さて、プロセスを一時停止した状態で、磁石を使用して印刷ピンを取り外し、プリントヘッドにパイプクリーナーを置いて、プリントヘッドに湿気が蓄積するのを防ぎます。次に、印刷ピンを二重蒸留水ですすぎ、きれいな二重蒸留水で30秒間超音波処理します。

次に、窒素の流れの下で印刷ピンを乾燥させてから、ピンをプリントヘッドに戻します。ソースプレート内に残っているすべてのサンプルの混合、印刷、洗浄を続けます 最大12, 000スポット、直径100ミクロンを1枚のスライドに堆積できます。印刷が終了したら、80〜90%の湿度で印刷チャンバー内でアレイを最低30分、最大24時間エージングします。

1ミリモル、アセチルコリンヨウ化物の25マイクロリットル、および5ミリモルボディpi、FILシステイン、および5ミリモルのボディパイ、FILシステイン、および25ミリモルトリスの0.14マイクロリットルをpH 7.0で組み合わせることにより、使用直前にポジティブコントロールの50マイクロリットルを準備します384ウェルマイクロタイタープレートのウェルで4%グリセロールで溶液を上下にピペットで動かし、泡を作らずに混合します。次に、0.14マイクロリットルの5ミリモルボアイPI FILシステインをpH 7.0の49.86マイクロリットルの25ミリモルトリスと4%グリセロールと組み合わせ、384ウェルマイクロティッタープレートの別のウェルに組み合わせて、使用直前にネガティブコントロールを準備し、それらを穏やかに混合し、前のセクションで説明したのと同じプロセスを使用して、コントロールを老朽化したマイクロアレイに印刷します。ただし、直径 100 ミクロンのピンの代わりに、直径 235 ミクロンのチーフ ピンをスロットしました。

これにより、溶液が以前に堆積したスポットを完全にカバーすることが保証されます。スポットは、アセチルコリンの自動加水分解により、室温で1時間、湿度80〜90%でアレイを老化させます。インキュベーション時間が長くなると、酵素活性が亢進するため、偽陽性が生じる可能性があります。

alpha innotech novoアレイイメージャーがオンになっていて、アセチルコリンエステラーゼマイクロアレイの測定用に、478プラスマイナス17ナノメートル励起および538プラスマイナス21ナノメートルの発光フィルターが装備されていることを確認してください。次に、スポットを上に向けてスライドをスライドホルダーに入れます。プレビューセクションの数を設定して、顕微鏡スライドの両側の少なくとも 1 つが自動露出を使用して 4 マイクロメートル以上の解像度でプレビューされるようにします。

パラメータが適切であると判断されたら、スライド画像を取得し、TIFFファイルとして保存します。次に、取得したスライド画像を画像J64で開く。楕円形選択ツールをクリックして、各スポットを選択します。

観察されたスポットよりわずかに大きい領域を選択し、画像Jの主観性を減らすためにスポット間で一貫したサイズを使用するようにしてください。[分析]タブの下。25個の類似したポジティブコントロールスポットから強度を平均化し、25個の類似したネガティブコントロールスポットの平均強度で割って、個々の材料組成物のポジティブコントロールとネガティブコントロールの比率を求めます。

ここに示されているのは、これらの方法を使用して調製された結果として得られるマイクロアレイのダイナミックレンジの例です。コントロールが高いと明るい緑色の領域になり、コントロールが低いとスポットがかなり暗くなりました。画像J 64によって測定された強度は、高対照群が平均して約22, 000相対蛍光単位であり、低対照群が平均して8, 000に近いことを示している。

点線は、平均からの 3 標準偏差を表します。以下は、化合物1および化合物2として同定されたアメラルシエアルカロイドの合成類似体の名誉アレイスクリーニングのためのマイクロアレイの例です。両方の軸は、蛍光シグナルによって決定される酵素の割合を表します。

重複して、ドットの対角線への近さは、高いアッセイ再現性を表します。2つの異なる潜在的な阻害剤のIC 50プロットをここに示します。化合物1は16マイクロモルのIC50レベルをもたらしたが、化合物2のIC50は21マイクロモルであった代表的なスポットは、阻害剤濃度に比例したシグナルの違いを示すために上に示されている。

ここに示すアレイは、4つの異なるキナーゼ、P 38マップキナーゼ、EGFRおよびGSKで印刷され、A TPを含むバッファーのみのバッファーとA TPおよび酵素活性の阻害剤であるスターロスポリンを含むバッファーでオーバープリントされました。結果は、ここで述べたように、結果として得られる蛍光強度に基づいて、キナーゼ阻害剤starro sporinからの有意な効果を示しています。ここで使用されたストースポリンの濃度で見られた最大の違いは、P 38スポットからのものでした。

ここでは、P 30 8:00 AM BPマイクロアレイの代表的なスポットが示されており、これはさまざまな濃度のストースポリンでオーバースポットされました。示されるように、この分子のIC50は1マイクロモルであると決定され、マスターされると右側のグラフに示されている。この手法は、この手順に従って適切に実行すれば、数時間で実行できます。

イムノアッセイやタンパク質相互作用アッセイなどの他の方法も、診断や低分子の発見に関連する追加の質問に答えるために行うことができます。