Name: 定量ゾルゲル由来のタンパク質マイクロアレイを開発するためのガイド材料スクリーニングアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶゾルゲル由来のタンパク質マイクロアレイ開発のための材料スクリーニング手法。ピンプリント法を用いてアセチルコリンエステラーゼやマルチキナーゼマイクロアレイを作成し、低試薬量で迅速に小分子スクリーニングを行う方法です。

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著者らは、タンパク質マイクロアレイの開発の支援のためにマリアモントン、ジュリーLebert、ジェサミンリトル、新Ge及びローラLautensに感謝します。また、作者はこの仕事に資金を供給するための自​​然科学とカナダの工学研究会（NSERC）に感謝。また、作者はこの仕事をサポートするためのイノベーションとオンタリオ州イノベーショントラストのためカナダ財団に感謝します。 JDBは、バイオ分析化学とBiointerfacesにおけるカナダリサーチチェアを保持しています。

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<li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+enzyme+reaction+microarrays+based+on+pin-printing+of+sol-gel+derived+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials.</a> Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).</li>
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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここで説明する方法は、急速な材料の多数をスクリーニングすることなく、最適な材料を識別するための時間および費用対効果を生成する手順、コンタクトプリンタで印刷可能なゾル - ゲル由来の材料を識別するために最も適しとして選択した。 〜20,000電位の材料の合計から、単独でゲル化時間に基づいて、印刷に適していた200〜物質を同定することが可能であった。これは、大幅に後続の印刷試験のために準備する必要な材料の数を減少させた。これらの印刷可能な材料は、次いで、768スライド用材料の組み合わせの合計4摺動面上に印刷した。平均して、一つの材料の50スポット/複製は、サンプルローディング、スポット堆積とピンクリーニングを含む2〜3分で印刷することができます。これらのうち、155の材料、または約20％であり、溶液の取り込みごとのスポットの最大数を印刷するために許可され、再現性のスポットサイズを生じた。なお、4 SLとIDE面は、順番に、より良い印刷物テスト：アミン&gt;エポキシ&gt;アルデヒド&gt; PMMAを、PMMAスライドを任意の材料のために有用な配列を生成しなかった。これは、おそらく表面コーティングの極性に起因するものであった。前述の摺動面を比較すると、より極性アミンとエポキシが良いPMMAスライドに比べ、水性ゾルに適していた。さらに、テスト表面の、アミン被覆スライドは、債券へのアニオン性のゾルを堆積するための潜在的な、正に帯電した表面を提供する。私たちは、疑う、スライドとゾルの間の界面におけるシリカナノ粒子は、表面に沿って対話します。エポキシおよびアルデヒド摺動面の両方が同じ初期電荷ベースの相互作用を欠いている。最適なスポット堆積を確保するためにそれは非常なArrayitなどのサプライヤーからプレコートスライドを使用することをお勧めします。社内のコーティングが悪いスポット再現性13とにつながる矛盾したサーフェスを生成、いくつかのケースでは、定量化の確率につながる可能性があります題。等しく重要なのは18、温度と湿度は、材料の&quot;適性&quot;を影響します。温度に関連する影響に関する詳細な研究が行われなかったものの、印刷が常に（23±3℃）を室温で行った。湿度（80％以上）は、小さな堆積量（nlの0.7から2.3）および蒸発による不規則な形状の堆積を防止するために、印刷チャンバ内に制御した。 材料画面はアセチルコリンエステラーゼおよびキナーゼ、タンパク質の両方のタイプのために働いた材料の小さなセットを同定したの印刷用に特別に最適なゾル - ゲル由来材料を特定の方に導かれていたが。実際、キナーゼマイクロアレイの製造のために識別された材料の両方がSS + PVA +グリセロールに基づいていた、両方の材料はまたマイクロアレイのAChEのために選択材料26内に同定された。これらの &quot;最適な&quot;材料はさらにproteを開発するための一般的な出発点を提供することがありますでドープされたゾル - ゲルベースの​​マイクロアレイ、およびこれらの組成物を中心とした小さな画面では、マイクロアレイの製造のためのより良い材料を識別することができる。注意すべき第二の点は、使用する酵素の重要性である。アセチルコリンエステラーゼ（むしろ堅牢な酵素）の場合には、アッセイ互換として識別原稿66の材料26（又は約40％）が捕捉されたアセチルコリンエステラーゼの活性を保持していた。しかし、より繊細69アッセイ互換組成物のわずか2キナーゼ、または材料の約3％のために、すべてのキナーゼの活性を保持することができた。異なる酵素の十分な数が決定的な文を作るために研究されていないが、比較的不安定な酵素で、その最適化アレイ製造表示されmutliplexedマイクロアレイの製造を可能にするために広範囲のタンパク質を捕捉することができる材料の同定につながる可能性がある。 選択されたタンパク質の独立した、印刷可能な材料を識別するための主要なカットオフ率は、長いの必要だった素材ゲル化時間（&gt; 2.5時間）。 SS系ゾル - ゲル材料を開発するとき、それは、イオン交換、濾過後に、ゾルはpH約4であることを確実にするために非常に重要である。低い初期pHのゾル酵素活性に影響を与えることができるよりも低い中性pH、を持つ材料になることがあります。19 SSにダウエックス量（イオン交換樹脂）の調整は、ゾルの最終pHを変えることができます。樹脂の新しいバッチを調製する際SSへの樹脂の比率は、プロトコルのセクション2の手順に従って、pH約4でゾルを生成するように調整する必要がある。 生体分子捕捉用DGS系ゾルを使用した場合と同様に、結晶DGSの調製は、多くの場合、材料破壊に関連付けられたエラーの原因である。 、ここでは詳細には細心の注意が報告されていないがpolyglyceratedシリカを生産する合成中の水の存在を避けるために特に必要で、結晶DGSの合成中に注意する必要がむしろ単量DGSよりTES。また、DGSの吸湿性の性質のために、結晶試料は合成後6ヶ月以内に乾燥して使用格納する必要がある。 6ヶ月以上前の結晶DGSも酸性環境における超音波処理で（せいで部分的に凝縮ポリグリセリルシリケート材料に）完全に溶解しないことがあります。不完全DGSの溶解は、未知と制御不能シリカ含有量、したがって、より少ない堅牢な材料とゾルを生成します。 コンタクトプリントで注意すべき重要な点は、ピンの品質です。破損したり、誤っピン（ 図9）が印刷されている物質の独立した再現可能な配列を作り出すことは決してありません。それは、壊れたり、詰まっピンが使用されていないことを確認するために解剖顕微鏡を用いてピンの品質をチェックすることをお勧めします。慎重な取り扱いにはピンの長寿命を保証します。ピンの自由な移動も重要である。水分が頭とピン、ピンの間にプリントヘッドの中に閉じ込めている場合で座席は正しく、したがって、材料の堆積の欠如、その結果、表面に適切な接触をすることはありませんではないでしょう。 結論として、我々は、高濃度ドープされたタンパク質ピン印刷されたマイクロアレイを開発するための詳細な多段スクリーニング法を提供している。スクリーニングは、より集中スクリーニング続い資材の印刷は、与えられた測定法との互換性と酵素活性を保持することができる物質を同定することを可能にする材料特性の最適化（ゲル化時間と印刷適性）が含まれます。この誘導物質のスクリーニング手法は、効率的な高密度マイクロアレイの製造にかかる時間とコストを削減するために追加のマイクロアレイフォーマットに適用することができる。

マイクロアレイは増加アッセイのスループットのための方法として、科学界で人気を得ています。マイクロアレイ技術の開発は、1990年代半ばにおける遺伝子発現1を評価するので、マイクロアレイは、タンパク質-タンパク質およびタンパク質-小分子相互作用を識別するために、独特の特性を有する新しい材料を見つけるためのハイスループットアッセイの開発に使用することを見出した。 2-5最近では、マイクロアレイは、適切な蛍光を用いたマイクロアレイ自体の酵素活性及び阻害の容易な測定を可能にする、特定の材料がタンパク質が捕捉される範囲内の三次元マイクロアレイ素子の製造、機能性タンパク質を固定化するために使用されることを特徴とする請求開発されている基質代謝回転に結合されているアッセイ5-10重要なことに、このようなマイクロアレイは非常に並列接続された方法で一緒に画面サンプルとコントロールに必要なすべてのコンポーネントを含むように設計することができる。5,8 &lt;/ P&gt; タンパク質マイクロアレイの初期の例は、典型的には、共有結合、11アフィニティキャプチャ3と物理吸着などの固体支持体上へのタンパク質固定化のための標準的な方法を用いて調製した。12バイオ固定するこれらの方法は、増加した試料濃度とするために必要な加速反応速度を可能にする一方でアッセイ小型化が、彼らはそれぞれの欠点に苦しむ。一般的に、すべての活性部位へのアクセスを妨げて、表面の化学修飾にネイティブ機能により生体分子の減少を引き起こすか、または非特異的な固定化のために不適切な姿勢。生体分子堆積の増加にもかかわらず、低いアッセイ感度、おそらく人工的に表面に生体分子をバインドする必要があるため、発生する応答でこのように、すべてのメソッドの結果。 機能的な生体分子マイクロアレイの生産のための新たなアプローチは、タンパク質ドープのピンプリンティングを介して行われます通常はどちらか官能ガラススライドまたはマイクロウェルプレートの個々のウェルである固体支持体上にシリカゾル、。ならびに13をロードする高タンパク質を考慮して、3次元マトリクス内に閉じ込める生体分子ゲル、複数の構成要素の挟み込み内ゾル-ゲルプロセス自体は室温で水性環境で行われ、それが印刷された液体前駆体であり、同じマイクロアレイ素子。ゾルゲル由来材料の裁縫13,14は、同様に異なるバッファの使用（pH、イオン強度）を介して水性成分を変更することにより、異なるシリカ前駆体の注意深い選択によって行われ、包含することができるの最適な材料を達成するために種々の添加剤（ポリマー、小分子）の特定の性質が捕捉される生体分子に依存する。10 ピンプリンティングを介してゾル - ゲル由来のタンパク質マイクロアレイの開発に関連する潜在的な制限があるピンでゲル化することなく、印刷または一度表面に印刷望ましくない特性（クラッキング再生不可能なスポットサイズ、接着不良、アッセイ成分との非互換性、貧しいタンパク質活性）を示すことができ、ゾル-ゲルベース複合材料を識別する必要があります。5同時これらのすべてのパラメータの最適化は、材料は、デノボ設計、またはシリアル方式でゆっくりと調べることができ、請求のアプローチを排除。一方、多くの千又は材料の数万のランダムスクリーニングも、時間も費用効果が高い。 本稿では、ランダムな材料の多数をスクリーニングすることなく、タンパク質マイクロアレイの製造に適した材料の迅速な同定を可能に向けスクリーニング手法を説明する。誘導アプローチを用いて、マイクロアレイ印刷に適した材料は、第一の最適なゾル - ゲル誘導さ、材質を識別するための小規模な一連の画面に続いて、同定さ割れや与えられたアッセイと互換性のあるなしで、再現性よく印刷することができるほかの組み合わせ。最後に、最適な材料は、最終的な小分子のスクリーニングアッセイにおける酵素活性および性能の維持に基づいて識別される。このように、最適な材料は、わずか数百アッセイ手順を使用して、何千もの候補の中から識別することができます。我々は、高密度のアセチルコリンエステラーゼ及びマルチキナーゼマイクロアレイの両方を製造するためのこのアプローチは、小分子のスクリーニングのためのそのようなマイクロアレイの使用を示す。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>試薬/材料</td></tr><tr><td>ポリ(ビニルアルコール)(PVA)</td><td>Sigma-Alderich</td><td></td><td>360627 80%加水分解、Mw 600</td></tr>ポリエチレン<tr><td>グリコール600(PEG)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>87333</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン(PEI)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>482595</td><td>50 wt%水溶液</td></tr><tr><td>カルボキシエチルシラントリオール(Si-COOH)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIC2263.0</td><td>25% in water</td></tr><tr><td>N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIT8189.0</td><td>エタノール</td></tr><tr><td>ビス[(3-メチルジメトキシシリル)プロピル]ポリプロピレンオキシド(MDSPPO)</td>50%) <td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1660.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>メチルトリメトキシシラン(MTMS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIM6560.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bis(triethoxysiyly)エタン(Bis-TEOS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1817.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIA0610.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Alderich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-ソルビトール</td><td>Sigma-Alderich</td><td>240850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-(+)-トレハロース二水和物</td><td>Sigma-Alderich</td><td>T9531</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ-アルデリッヒ</td><td>X-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N&epsilon;</スパン>-アセチル-L-リジン</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A4021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>Sigma-Alderich</td><td>154563</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ・アルデリッヒ</td><td>H3375</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、1.0 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC24350-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>塩酸、1.0 N/0.1 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC15300-2/LC152220-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Alderich</td><td>M8266</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ジグリセロールシラン(DGS)</td><td></td><td></td><td>実験室で調製された</td></tr><tr><td>ケイ酸ナトリウム溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SS338-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100 イオンエクスチャンス樹脂</td><td>Sigma-Alderich</td><td>217492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヨウ化アセチルチオコリン</td><td>Sigma-Alderich</td><td>1480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アセチルコリンエステラーゼ Electrophorus electricus (電気ウナギ)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>C2888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY FL L-Cystine</td><td>Invitrogen</td><td>B-20340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond リン酸化タンパク質/リン酸化ペプチドマイクロアレイ染色キット</td><td>Invitrogen</td><td>P33706</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アデノシン5'三リン酸二ナトリウム塩(ATP)溶液</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A6559</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MAPキナーゼ2(MAPK2)</td><td>EMDミリポア</td><td>454850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p38&alpha;/SAPK2a (T106M), アクティブ</td><td>EMD Millipore</td><td>14-687M</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>上皮成長因子(EGFR)</td><td>EMD Millipore Millipore</td><td></td><td>Millipore Millipore</td></tr><tr><td>Glycogen synthase kinase 3&beta;(GSK-3&beta;)</td><td>EMDミリポア</td><td>14-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Myelin basic protein (MBP)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Substrate for MAPK2 and p38&alpha;, Millipore</td></tr><tr><td>GSM</td><td>EMD Millipore</td><td>12-533</td><td>Substrate for GSK-3&betaから</td></tr>寄贈。<tr><td>Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)</td><td>EMD Millipore</td><td>12-440</td><td>EGFR</td></tr><tr><td>ステルスピン</td>用基板 <td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ステルスピン</td><td>ArrayIt</td><td>SMP7</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アミンコーティングスライド</td><td>ArrayIt</td><td>SMM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アルデヒド被覆スライド</td><td>ArrayIt</td><td>SMA2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>エクスポシーコーティングスライド</td><td>ArrayIt</td><td>SME2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ポリメタクリレートメチル(PMMA)コーティングスライド</td><td>Exakt Technologies Inc.</td><td>41500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.2-&mu;mシリンジフィルター</td><td>PALL Life Sciences</td><td>4612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Virtekコンタクト</td><td>プリンターBioRad</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Novaray Fluorescence Slide Imager</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>卓上型マイクロアレイ遠心分離機</td><td>ArrayIt</td><td>MHC110V</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MilliQ Synthesis A10</td><td>Millipore</td><td></td><td>実験に必要なすべての水をろ過するために使用されます</td></tr></tbody></table>

定量ゾルゲル由来のタンパク質マイクロアレイを開発するためのガイド材料スクリーニングアプローチ

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

マイクロアレイは、新素材や小分子薬物リードの発見のためのハイスループットアッセイの開発に使用することを見出した。本明細書で我々は3次元タンパク質マイクロアレイを製造するのに適しているゾル - ゲル系材料を識別するための誘導物質のスクリーニング手法を説明する。アプローチは、最初にマイクロアレイとして印刷することができる材料を識別する最大の酵素活性の保持に基づいて、特定の酵素アッセイと互換性のあるもの、および、最適な材料で上まで迫るを識別することによって、材料の数を絞り込む。このアプローチは、2つの異なる酵素アッセイに適したマイクロアレイ、アセチルコリンエステラーゼを使用して1つおよび癌に関与する4つの主要なキナーゼのセットを使用して、他の開発に適用される。それぞれの場合には、定量的な小分子のスクリーニングアッセイおよび用量依存的な阻害剤の応答曲線の製造に使用することができるマイクロアレイを製造することが可能であった。重要なのは、能力は、多くの仲間をスクリーニングするリアルでは、最高の酵素活性のマイクロアレイの生産と保持の両方を最適材料の種類についての情報を生成した。素材データは、最適な、高密度のゾル - ゲル派生マイクロアレイを調整するために必要な基本的な材料の要件への洞察を提供します。

材料画面用の誘導因子分析を行うことにより、我々は、約20,000から印刷に適したゲル化時間を有し、数百に試験した材料の数を最小限に抑えることができた。の厳格なガイドラインが必要な材料ゲル化時間を適用することにより、2.5時間以上が、印刷ピンを詰まらせたり、再生不可能な配列を生成する可能性が高い材料は印刷されませんでした。十分な（&gt; 2.5時間）ゲル化時間を有すると同定印刷可能な材料は、4つの異なる官能化ガラススライドの表面に印刷した。秩序 &quot;印刷可能&quot;と見なされるべきでは、ピンの取り込み体積あたりのスポット数は最大（SMP3を= 200）を印刷しなければならなかった。スポットは、 図2に示すように、割れまたは望ましくない相分離が単純な明視野顕微鏡を用いて発生していないことを確認するために、スポット形態について評価した。 同定され印刷可能な素材のこの段階から、マイクロアレイはアセチルコリンエステラーゼを製造し、キナーゼは、バッファリングされた水性成分に組み込む。アッセイ手順（潜在的なオーバープリントと洗濯や染色工程を含む）との互換性があった材料はネガティブコントロール（NCにマイクロアレイスポットの保持（無割れ、斑点や珍しい蛍光パターンの損失）及び陽性コントロール（PC）を観察することによって同定された等の画像を通して観察は1より大きい）比。これは材料の約50％であったとして、3以上のPC / NC比は、タンパク質の活性を保持して最適な材料を定義するために使用された。この方法によって、&gt; 3 PC / NC基準を満たしキナーゼを含むAChEの2物質を含む26ゾル-ゲル由来材料。 図3と図4は、最適のAChE及びキナーゼの同定のための5誘導物質画面ステップのグラフィカル内訳を示すそれぞれマイクロアレイ、。 アッセイもZ &#39;スコアの世代を通じて検証することができます17 </sup&gt;これは、最高のPC / NC比が製造された材料を使用して行われました。 図5は Z &#39;プロットは200箇所、100 PCとAChEのアレイ上指示薬色素と基板をオーバープリントした後100 NCから生成された信号を比較することによって得を示しています。アセチルコリンエステラーゼとキナーゼアレイは優れたアッセイを示す0.60と0.67のそれぞれのZ &#39;スコアをもたらした。しかしながら、アッセイの検証前に、オン·アレイ酵素、染料、基板と補因子の濃度が他の場所で詳細に説明するように、各成分の濃度の範囲をオーバープリントし、最も高い信号を生成した濃度を選択することによって最適化されなければならなかったことに留意すべきである5 アッセイを検証するために、定量的な阻害データが重複し、重複プロット（ 図6A）および阻害曲線（ 図6B及び図6C）を生成するために使用で行われる結果と、既知および未知のAChE阻害剤を用いて得られた。&lt;第染料と基板との既知の阻害剤又は阻害剤なしのいずれかを含む制御次いで混合物で知られている生物学的に活性な小分子阻害剤の混合物と重ねてプリントされた強い&gt;スポットが含まれていた。重複したプロットは、酵素活性を評価するために生成され、25％未満の酵素活性をもたらした任意の混合物が阻害について陽性とみなした。このような混合物から個々の化合物は、次いで阻害の原因特定の小分子（単数または複数）を識別するために、二重に試験した。一旦、識別されたこれらの小分子は、IC 50値および阻害定数を決定するために定量的な阻害曲線を生成するために使用された。 同様の定性的な結果が共通のキナーゼ阻害剤、スタウロスポリンによるマルチキナーゼアレイを用いて得られた。 図7Aおよび7Bは、マルチキナーゼを重ね刷りし、染色した後マイクロアレイ画像を表示し、その信号強度を示す（ - ATP）、ポジティブコントロール（+ ATP）と既知の阻害剤（+ ATP + INH）の配列は、ネガティブコントロールのために期待されている。マイクロアレイから定量的阻害データを取得する能力を実証するために、濃度依存的な阻害アッセイは、単一のキナーゼを行った。 図8A及び図8Bに示すように、信号強度が阻害剤濃度が増加するにつれて減少し、応答がp38α/MBPキナーゼ/基質システムの予想濃度依存的阻害曲線に従う。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> 図1。ガイド付きの材料スクリーニングアプローチのための一般的な回路図は 、 各ブロックには、順番に画面のステップを表しています。左側の数字は、分析のために調製材料の総数を表す。 2.5時間（ゲル化時間を有する材料未満で2.5時間arを超えるゲル化時間を用いてe）は取り消し線で示すように、各ステージを通過し、材料画面中に繰り越さ材料の数が右側の数字で示されている。 *最適な相分離未満の材料を表します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> 図2。スクリーン印刷適性の工程において材料の様々な故障モードを示す光学像は &quot;良い&quot;材料（第2行3列目）の画像は、比較のために示されている。参照8、著作権2013年米国化学会から許可を得て転載。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> 図3。ゾル-ゲル由来のAChEマイクロアレイを製造するための最適な材料を識別するための指向性材料スクリーニングアプローチは、パーマを得て転載文献5、著作権2013年アメリカ化学会からission。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> 図4。ゾル-ゲル由来キナーゼマイクロアレイを製造するための最適な材料の識別のためのアプローチをスクリーニング監督材料。参照8、著作権2013年のアメリカの化学会から許可を得て転載。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> 図5。 （A）HC（明るい緑色）とLC（ライトグリーン）スポット（黒緑パレットがプレゼンテーションを明確にするために擬似カラーとして適用された）を示すのAChEマイクロアレイの部と、（B）箱入りエリアの拡大図は、スポットを強調する形態およびアラインメント;及び（C）Z &#39;プロットの実線は平均値を示す<html>破線は3SDに対応しながら、複製します。文献5、著作権2013年米国化学会から許可を得て転載。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> 図6。 （A）は、ヒガンバナ科アルカロイドの合成類似のオン配列スクリーニングのためのプロットを重複し、（B）を同定可能性阻害剤のIC 50プロットは、化合物1〜25からの平均の1標準偏差を表すエラーバー付き（C）化合物2、としてマーク複製する。代表的なスポットが阻害剤濃度に比例した信号の差を説明するために示されている。文献5、著作権2013年米国化学会から許可を得て転載。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 NT &quot;のfo：キープtogether.withinページ=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> 図7。オン·アレイは、捕捉用1.4SS/1.0PVAを使用して、4つのキナーゼアッセイおよびアミン誘導体化されたスライド上に印刷しました。（A）キナーゼ、それぞれの基質と同時捕捉さを有するスポットを緩衝液で重ねてプリントされたマイクロアレイの断面の画像（NC、一番上の行）、またはATP（PC、中段）またはATP +スタウロスポリン（下段）を含む溶液。 （B）との間の信号強度を比較する棒グラフを抑制し、25から平均値の1標準偏差を表すバックグラウンド信号と誤差棒の減算後の制約のない反応は、レプリケート。参照8、著作権2013年米国化学会から許可を得て転載。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> 図8。 Inhibiti。p38a/MBPマイクロアレイ上でアッセイ（A）スタウロスポリンの濃度を変化させたoverspotted代表的なスポットを示したマイクロアレイの切片として（;合成画像は、明確にするために示されている画像は、同じスライドの単一のスキャンによって得た）を示した。 （B）IC 50曲線を分析配列画像から生成される。 100mMので得られた強度は、すべての画像から差し引いた他のすべての強度は、100％活性の値に10nMので得​​られた強度を設定することによって正規化した。参照8、著作権2013年米国化学会から許可を得て転載。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> 図9。様々な欠陥を示す接触ピン印刷に使用微視的ステルスピンの画像：（A）目詰まり、（B）曲がった。

製造の新たなピン印刷法を用いてゾル - ゲル由来のタンパク質ドープされたマイクロアレイを開発するための誘導物質のスクリーニング手法が記載されている。この方法は、費用対効果の高い小分子のスクリーニングのために使用されるアセチルコリンエステラーゼ及びマルチキナーゼマイクロアレイの開発により実証されている。

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

本手順の全般的な目的は、マイクロアレイ作製に向けた新しいゾル-ゲルベースの材料を同定し、それらをナノボリューム酵素アッセイに使用することである。これは、まず、印刷プロセス中にマイクロアレイ印刷ピン内でのゲル化を避けるために、十分に長いゾル状態維持時間を有する材料を同定することで達成される。第二のステップは、長いゾル状態維持時間を有する材料について、マイクロアレイとしての印刷再現性、耐亀裂性、密着品質、好ましくない相分離の有無、そして最終的に、封入された酵素の高い活性を評価することである。次に、最適化された材料を用いて目的の酵素をマイクロアレイとしてプリントし、アッセイ溶液をスポットして測定可能な酵素反応を生成できるかを確認します。最終ステップでは、目的の酵素を用いて高い再現性を持つアッセイを提供し、定量的なデータを生成できるかについて材料を評価します。これにより、アレイ作製に用いる最終的な材料を選定します。最終的に、ソールゲル由来のタンパク質マイクロアレイを用いて、酵素活性を低下させる低分子化合物を同定します。プレートベースのスクリーニングなどの既存の手法に対するこの方法の主な利点は、少量の試薬を用いて、大量の材料を系統的にかつ非常に迅速にスクリーニングできることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、プリンティングピン内部で材料がゲル化することがあるため、苦労することがあります。これらが適切に洗浄されない場合、汚れが残り、それが非印刷材料として解釈される可能性があります。まず、付随するテキストプロトコルに従って、多数の添加剤溶液を調製します。多くの溶液はあらかじめ調製し、適切な条件下で1ヶ月またはそれ以上の期間保存可能ですが、一部の溶液は実験当日に調製する必要があります。ケイ酸ナトリウムベースのSOSは使用直前に混合し、必ず氷上で保持してください。水を加えてから1時間以内にSOSを使用する必要があります。待機時間が長くなると、DATION時間が短縮し、不均一になるためです。次に、付随するテキストプロトコルの指示に従い、バッファー、salansポリマー、およびorgans lanesの様々な組み合わせを調製し、2.5時間以上の拡張時間を持ち、プリント可能な材料として使用できる組み合わせを特定します。いくつかの組み合わせが特定されたら、印刷チャンバー内の湿度を80〜90%に設定します。湿度を80%未満にすると、プリンターでの堆積量が少ないため、サンプルの蒸発や印刷の不整合が生じる可能性があります。準備が整ったら、Chip Writer Proプログラムを使用して印刷するアレイパターンを配置します。XY方向の移動速度を10 millimeters per secondに、Z方向のサンプル接近速度を2 millimeters per secondに設定し、前述で特定したsaw gelの組み合わせを用いて、サンプルロード時間を2.5 secondに設定します。事前スクリーニングプロセスで特定した対応するポリマー、オルガノレーン、および低分子添加剤を混合し、ベース材料を25 µL準備します。pH 8.0の50 mM HEPESを384ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに分注します。次に、直径100 µmの4本のスロット付きシースピンを、2回蒸留水中で超音波処理します。15分後、窒素気流で乾燥させます。次に、パイプクリーナーを使用してピンホルダー内部の残留水分を取り除き、コンタクトピン印刷ロボットのプリントヘッドに慎重にピンを配置します。残留水分を取り除かないと、ピンがホルダー内で自由に動かず、スポットの欠損につながる可能性があります。その後、プリンティングの直前に、各SA 25 µLをウェルに加えます。ピペットで混合する場合は、ピペッティングを50回繰り返し、溶液を混ぜ合わせます。この際、溶液に混入する空気量は最小限に抑えてください。気泡が混入すると、ピン内にサンプルを完全に充填することができません。次に、ピンをサンプルの中に下げて充填します。ピンへの充填が完了したら、プリンティングプロセスを開始し、スライドの表面にサンプルをプリントします。次のソースプレートに塩を加える前に、プリンティング工程を一時停止させます。工程を停止させた状態で、マグネットを用いてプリンティングピンを取り出し、プリントヘッド内に水分が蓄積するのを防ぐため、プリントヘッドにパイプクリーナーを挿入します。その後、プリンティングピンを二回蒸留水で洗浄し、きれいな二回蒸留水中で30秒間超音波洗浄します。次に、窒素気流でプリンティングピンを乾燥させ、ピンをプリントヘッドに戻します。ソースプレートに残りのすべてのサンプルについて、混合、プリント、洗浄を繰り返します。1枚のスライドに、直径100 µmのスポットを最大12,000個まで配置することが可能です。プリント終了後、湿度80〜90%のプリントチャンバー内で、アレイを最低30分から最大24時間熟成させます。使用直前に、1 mMのアセチルコリンヨウ化物 25 µLと、5 mM BODIPY-FL-cysteineおよびpH 7.0の25 mM Tris（4% glycerol含有）0.14 µLを384ウェルマイクロタイタープレートのウェル内で混合し、ポジティブコントロールを50 µL調製します。気泡が発生しないよう、ピペットでゆっくりと吸い上げと排出を繰り返して混合してください。次に、使用直前にネガティブコントロールを調製します。5 mM BODIPY-FL-cysteine 0.14 µLを、pH 7.0の25 mM Tris（4% glycerol含有）49.86 µLに加え、384ウェルマイクロタイタープレートの別のウェルで穏やかに混合します。前節で説明した手順と同様の手法を用いて、これらのコントロールをエージング済みマイクロアレイ上にプリントします。ただし、直径100 µmのピンではなく、直径235 µmのスロットチップピンを使用してください。これにより、溶液が以前にスポットされた箇所を完全に覆うことができます。アセチルコリンの自動加水分解のため、スポットしたアレイを室温、湿度80〜90%で1時間静置して熟成させます。インキュベーション時間が長すぎると、酵素活性の亢進により偽陽性が生じる可能性があります。alpha innotech novo array imagerの電源が入っていることを確認し、アセチルコリンエステラーゼマイクロアレイの測定用に、励起フィルターとして478 ± 17 nm、蛍光フィルターとして538 ± 21 nmのフィルターを装着します。次に、スポット面を上にしてスライドをスライドホルダーにセットします。オートエクスポージャーを用い、最低分解能4 µmで、マイクロस्ライドの両端に少なくとも1つずつプレビューセクションが含まれるようにプレビューセクション数を設定してください。パラメータが適切であると確認できたら、スライド画像を撮影し、TIFFファイルとして保存します。次に、取得したスライド画像をImageJ 64で開きます。楕円選択ツールをクリックし、各スポットを選択してください。観察されたスポットよりもわずかに大きい領域を選択します。Image Jによる主観性を排除するため、スポット間でのサイズを統一してください。次に、[Analyze]タブにある[Measure]オプションを使用して、各スポットの信号強度を測定します。25個の同様のポジティブコントロールスポットの平均強度を求め、それを25個の同様のネガティブコントロールスポットの平均強度で除することで、個々の材料組成におけるポジティブコントロール対ネガティブコントロール比を算出します。本手法を用いて作製されたマイクロアレイのダイナミックレンジの例をここに示します。ハイコントロールでは明るい緑色の領域が見られ、一方でローコントロールではスポットが大幅に暗くなっています。Image J 64で測定した輝度では、ハイコントロールの平均は約22,000相対蛍光単位であり、ローコントロールの平均は8,000に近い値でした。点線は平均値から3標準偏差離れた範囲を示しています。ここでは、化合物1および化合物2として同定されたアメラルシエールアルカロイドの合成アナログのオーナアレイスクリーニングにおけるマイクロアレイの例を示します。両軸は、蛍光シグナルによって決定された酵素のパーセンテージを表しています。二連（duplicate）において、ドットが対角線に近いほど、アッセイの再現性が高いことを示しています。ここでは、2種類の異なる潜在的阻害剤のIC 50プロットを示しています。化合物1のIC 50値は16 micromolarであったのに対し、化合物2のIC 50値は21 micromolarでした。阻害剤濃度に比例した信号強度の違いを説明するため、代表的なスポットを上に表示しています。ここに示されているアレイは、4種類の異なるキナーゼ（P 38 map kinase、EGFR、GSK）を用いてプリントされ、さらにバッファーのみ、ATPを含むバッファー、および酵素活性阻害剤であるstaurosporinとATPを含むバッファーでオーバープリントされました。結果として得られた蛍光強度の記述に基づくと、キナーゼ阻害剤であるstaurosporinによる有意な影響が認められます。本実験で使用したstaurosporinの濃度において最も顕著な差が見られたのは、P 38のスポットでした。ここでは、さまざまな濃度のstor sporinをオーバースポットしたP 30 8:00 AM BPマイクロアレイの代表的なスポットを示します。記載の通り、この分子のIC 50は1 micromolarと決定され、習得後は右側のグラフに示されるように表示されます。本手順に従って適切に実施すれば、この手法は数時間で完了させることができます。診断や低分子化合物の探索に関連するさらなる疑問を解決するために、免疫測定法やタンパク質相互作用解析などの他の手法を用いることも可能です。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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