複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

このビデオ記事では、化学的にブロックされた抗体マイクロアレイを使用して、肝細胞がん患者の血清サンプル中の20種類の糖タンパク質の糖鎖化プロファイルを取得する手順を説明しています。患者の血清サンプルを適用すると、サンプルからの糖タンパク質が抗体によって捕捉されます。次に、ビオチン化糖鎖結合タンパク質を添加して糖鎖を検出し、ジコンジュゲートノイトラバインを添加してビオチン化レクチンを標識します。

次に、マイクロアレイスライドをスキャンして検出し、得られたデータの蛍光分析により、サンプルタンパク質のグリコシル化プロファイルを明らかにします。この手法には、HPLCなどの既存の方法に比べていくつかの利点があります。この方法により、個々の糖タンパク質を天然の状態で検出できます。

複数のタンパク質のグリコシル化変化を同時にスクリーニングすることは、より迅速かつ容易です。さて、病気、特にがんや肝臓がんのバイオマーカーは、私たちが最も注意深く調べてきたものですが、しばしばグリコシル化されていることがわかりました。また、私たちが発見した特定の糖鎖形態を検出する能力は、バイオマーカーの感度と特異性において、バイオマーカーの性能を大幅に向上させます。

したがって、この測定は、HCCの複数の血清タンパク質のグリコシル化変化に関する洞察を提供することができます。また、膵臓がん、糖尿病、アルツハイマー病などの他のがんや疾患における病理学研究やバイオマーカーの発見にも適用できます。手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるChen Luです。

このプロトコルは、まず0.8ミリリットルのマイクロ遠心チューブで抗体マイクロアレイを調製し、氷上でマイクロアレイ印刷に使用されるすべての抗体を0.5ミリグラム/ミリリットルの濃度に希釈し、ここでは最低40ミリリットルのPBSで、26種類の抗体をポジティブコントロールとして使用します。また、PBS中に同量のビオチン化BSAを1ミリリットルあたり0.5ミリグラム調製します。ピペッターを使用して、各抗体の40ミリリットルを氷上の384ウェルソースプレートに分注します。

次に、マイクロアレイ制御ソフトウェアで、各抗体の位置を指定します。次に、プレートをソースとしてマイクロアレイにロードします。次に、20パスマイクロアレイスライドをターゲットとしてマイクロアレイにロードします。

マイクロアレイをセットして、27個の抗体と制御タンパク質が9×9のパターンで三重にスポットされた48個の同一のsubarアレイを印刷します。マイクロアレイを起動して、抗体マイクロアレイスライドを印刷します。抗体マイクロアレイスライドを回収し、乾燥剤入りのスライドカセットに保管します。

カセットをビニール袋に密封して、保管中のタンパク質の変性やスライド上の水分を防ぎます。密封されたマイクロアレイスライドは、使用するまで摂氏4度で保管してください。この手順の最も困難で重要な側面は、ケミカルブロッキングステップです。

成功を確実にするためには、十分な量の抗体がマイクロアレイライトに印刷されていることが重要です。実験の直前に、常に新鮮なナトリウムIDEとアグロ酸ハイドロサイトを準備してください。また、酸化処理は必ず4°Cで光を避けて行ってください。

マイクロアレイスライドを冷蔵庫から取り出し、室温で30分間平衡化します。ストレージボックスからスライドを取り出します。スライドをPBSを含む洗面器に0.1%tween 20で短時間沈めます。

次に、スライドを 15 ミリモル酢酸ナトリウムバッファーに 0.1% tween で 10 分間浸します。次に、15ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝液にヨウ素酸あたり150ミリモルの新鮮なナトリウムを調製し、スライド洗面器に移します 冷蔵庫で保管し、使用するまで光を避けます。スライドを酢酸ナトリウムバッファーから取り出し、抗体面を上にして新鮮な純度ナトリウムを含む洗面器に入れます。

光を避けるために洗面器をアルミホイルで覆います。次に、スライド洗面器を摂氏4度に置き、2時間静かに振る。洗面器からスライドを取り出し、酢酸ナトリウム緩衝液で5分間3回短時間すすぎます。

スライドを、新たに調製した10ミリリットルの10ミリリットルのヒドログルタミン酸ブロッキング溶液で、インキュベーションチャンバー内で室温で2時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。スライドをチャンバーから取り出し、0.1%トゥイーンのPBSで3分間洗浄します。次に、スライド洗浄槽で、マイクロアレイスライドをPBS中の1%BSA300ミリリットル、0.5%トゥイーンで室温で1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。

PBSでスライドを0.1%tweenで3分間3回すすぎます。スライドをスライドラックに置き、Gの1、200倍で2分間回転させ、次にマイクロアレイスライドを乾燥させます。各スバー配列を分離するために、ワックスグリッドがスライドに刻印されています。

ワックスインプリンターを摂氏70度で5分間予熱した後、抗体側をワックスに向けて、ブロックされたマイクロアレイスライドをワックスインプリンターにロードします。ハンドルをそっと引いて、ワックスをスライドに均等に刻印します。この分析法は、単一のサンプルに対する糖プロファイリングアッセイ、または複数のサンプル中の単一の糖エピトープの測定に使用できます。

ここでは、グリコプロファイリングアッセイのデモを行います。マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバのそれぞれであるミリリットルあたり0.1%トゥイーン0.1%ブリッジ35および100マイクログラムを含むPBSの360マイクロリットルに40マイクロリットルの血清を希釈することから始めます。この容量は、6マイクロリットルの希釈血清溶液を各サブアレイに塗布するのに十分です。

希釈したサンプルまたはコントロールの6マイクロリットルをスライドの各サブアレイに慎重に塗布します。スライドを加湿カセットに入れ、濡れたペーパータオルで室温で1時間インキュベートします。スライドをPBSで0.1%tweenで3分間3回すすぎます。

次に、スライドをGの1200倍で2分間回転させて乾燥させます。ビオチン化糖鎖結合タンパク質を 10 ミリグラム/ミリリットルで 20 マイクロリットル、PBS tween に 0.8 ミリリットルの氷上に調製します。希釈したビオチン化レクチンを6マイクロリットルにスライドの各サブアレイにアプスし、湿らせたスライドボックス内で濡れたペーパータオルで室温で1時間インキュベートします。

前回と同様に0.1%tweenでPBSで3回すすいだ後、遠心分離機で1200倍Gで回転させて2分間乾燥させます。氷上の0.8ミリリットルのマイクロフージチューブにPBS 0.1%tweenで中性travainとラベル付けされた1ミリリットルあたり10ミリグラムのDITE 5 49の400マイクロリットルを準備します。リピートピペッターを使用して、6マイクロリットルのDITE 5 49標識中性プラスチックを各サブアレイに塗布し、加湿スライドカセット内のスライドを室温でインキュベーション後1時間インキュベートします。

スライドをPBS 0.1%tweenで3分間3回すすぎます。スライドを遠心分離機で1200倍Gで2分間回転させて乾燥させます。蛍光マイクロアレイスキャナーを使用して、10mmの分解能でスライドをスキャンします。

レーザーとPMTの設定は、飽和が観察されないようにしながら、できるだけ強くする必要があります。配列Pro3.2で画像を開きます。抗体スポットの位置を示すアレイマップに従って、アレイテンプレートを設定します。

各テンプレート円を画像内の対応するスポットに慎重に位置合わせし、各スポットの強度をExcelファイルに抽出してさらに分析します。20種類の血清糖タンパク質およびビオチンに対する26種類の抗体を持つ48個の同一のsubarアレイを含む抗体マイクロアレイです。BSAは、ブロッキング手順の重要性を調べるために、このビデオで説明されているように設計および製造されました。

糖タンパク質プロファイリングの解析では、2つの同一のマイクロアレイスライドが生成されました。1つは化学的にブロックされず、もう1つはコントロールサンプルをカラム1と3のカラムにSubarアレイに適用し、プールしたHCC血清サンプルをSubarアレイに適用しました。2列目と4列目 22.

次に、異なる糖鎖に特異的なビオチン化レクチンを、これらのsubarアレイの画像に示すように、各サブアレイに適用しました。コントロールカラムで抗体を捕捉するように結合したレクチンは、ブロックされていないマイクロアレイの血清ロードカラムと区別がつかない高いバックグラウンドを提供します。しかし、化学的にブロックされた抗体マイクロアレイスライドで同じ実験を行ったところ、コントロールカラムでは抗体を捕捉するための結合がなかったか、非常に低く、血清負荷カラムでは抗原結合が高かった。

これらの結果は、化学的ブロッキング手順が抗体上の糖鎖の測定にとって重要なステップであることを示しています 捕捉された糖タンパク質 プロトコルに従うことにより、HCC血清中の22の糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを一度習得すると取得できます。この手法は、適切に実行すれば8時間で実行できます。抗体は、修飾されると、抗原やその他の特性に対する親和性を失う可能性があります。

ですから、このことを念頭に置いて、この手順に続いて、異なる抗体源でいくつかの異なる抗体を使用することが重要です。同じマイクロレイスライドを使用して各タンパク質濃度を検出するなどの他の測定は、グリコシル化の変化がタンパク質発現レベルの変化によるものなのか、それとも個々のタンパク質のグリコシル化の変化のみによるものなのかなどの追加の質問に答えるために実行できます。血清サンプルを含む病原体の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には常に保護手袋などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。