大規模な遺伝子ノックダウン中 C.虫堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用

この手順の全体的な目標は、細菌のDS RNA供給ライブラリーを使用してC Eleganceで大規模なRNA干渉スクリーニングを行い、遺伝子発現をノックダウンすることです。これは、まずDS RNAライブラリーから細菌クローンを培養することで達成されます。プラスミドの損失を防ぐ成長条件下では、まず各一次ライブラリープレートを複製し、次に96ウェルの複製ライブラリープレートを使用して、寒天オムニプレート上に細菌の一時的な茎を生成します。

これらのオムニプレートからの細菌は、液体培養で一晩成長した後、ワーム供給プレートの表面に移されます。ライブラリーから抽出された各細菌クローンは、1つのCエルガン遺伝子を標的とする独自のD-S-R-N-Aコードプラスミドを保有しています。2番目のステップは、同期されたワームを供給プレートに配置することです。

次に、ワームを摂氏20度の加湿チャンバーで数日間育てます。線虫が細菌を食べると、誘導されたDS RNAが動物の腸内に放出され、そこで周囲の組織に広がり、全身性のノックダウン効果を引き起こします。最後のステップは、遺伝子特異的なノックダウンによって引き起こされる表現型の影響について、給餌された動物を調べることです。

これらの表現型アッセイは、研究中の生物学的プロセスに重要な遺伝子を同定するために使用されます。この手法は、線虫の生殖腺へのダブレット鎖RNAのマイクロインジェクションなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、ハイスループットであることです。給餌ライブラリを使用すると、わずか数週間でほぼすべてのシーエルギンの遺伝子の生物学的機能を調べることができます。

多くの研究室は、ほとんどの遺伝子とCエレガンスがハプロで十分であるため、このノックダウンアプローチに苦労してきました。したがって、RNAノックダウンは遺伝子発現を50%以上減少させる必要があります機能表現型の喪失を引き起こします。堅牢な遺伝子ノックダウンを確実にするためには、線虫に供給されたすべての細菌が二本鎖RNAプラスミドを発現することが重要です。

プラスミド損失を決定する手順を開始するには、関連する各ステップで説明されているように細菌の小さなサンプルを取り出し、それを450マイクロリットルの滅菌水に加えます。この希釈したサンプルの100マイクロリットルを使用して、滅菌水を使用してさらに段階希釈を作成します。希釈液間で溶液を完全に混合します。

各希釈液の100マイクロリットルをLBおよびLB AMPプレートに広げ、翌日に摂氏37度で一晩インキュベートし、100〜500個の細菌コロニーを含むLBプレートを特定します。このプレートと、同じ希釈のバクテリアを含む対応するlbアンペアプレートのコロニーの数を数えます。この式を使用してプラスミド損失を決定します。

プラスミドを含まない細菌の割合は、LBプレート上のコロニー数からLBアンププレート上のコロニー数を差し引き、LBプレート上のコロニー数で割って100を掛けることで、高濃度の炭酸セリン中の細菌を増殖させることにより、プラスミドの損失を防止し、効果的なノックダウンを行う。動物に給餌する前にプラスミドの損失を確認し、プラスミドの損失が15%未満の場合にのみ続行しますこの手順は、摂氏マイナスの80°C冷凍庫から重複するライブラリプレートを取り外すことから開始します。培養物がまだ凍結している間にホイルシールをはがします。

プレートのプラスチックカバーを元に戻し、複製したライブラリプレートを水平な面にセットして、室温で30分以内に解凍します。頬側96ピンリプリケーターを滅菌します。それをエタノール浴に入れ、次にエタノールを燃焼させます。

パンとバーナーを使用してピンをコーティングします。炎が消えるのを待ってから、繰り返します。清潔なレプリケーターのピンは、蒸留水ですすいでから、毎回使用する前に滅菌する必要があります。

滅菌したレプリケーターを解凍した複製プレートのウェルに入れ、それを使用して培養物を穏やかに攪拌します。少量の培養物がレプリケーターのピンに付着します。複製プレートのウェルからリプリケーターを慎重に取り外し、オムニプレートの表面にそっとピンで留めます。

寒天表面に穴を開けないように注意してください。レプリケーターをオムニプレートの表面に3〜4秒間放置して、レプリケーターのピンからの細菌が寒天表面に移るようにします。固体培地でのプラスミドの損失を防ぐために、ateには1ミリリットルあたり2ミリグラムが含まれています。

カルボニックセリン。レプリケーターを取り外し、少量の細菌培養物が寒天に吸収されるのを待ちます。両方のプレートが複製された後。

オムニプレートを逆さにしたオムニプレートを、翌朝37°Cで15〜18時間インキュベートします。これらのオムニプレートは、96の井戸液体培養物に接種するために使用することも、摂氏4度で最大7日間保存することもできます。ワームを給餌するための細菌は、リピートピペッターと50ミリリットルのコンビチップを使用してオムニプレートからの細菌を使用して液体培養物として調製され、各2ミリリットルに1ミリリットルの細菌増殖培地を分注します。

96ウェルプレートのディープウェルは、リプリケーターを滅菌し、細菌コロニーを含むオムニプレートの表面に置き、ピンが96の細菌コロニーのそれぞれに接触していることを確認します。レプリケーターをオムニプレートの表面からディープウェルプレートに慎重に移動し、成長培地に浸るまでピンがディープウェルの側面をこすらないようにします。細菌を増殖培地に取り除きます。

リプリケーターをディープウェルプレートの内壁に沿って正方形にゆっくりと動かします。井戸を飛沫させたり、交差汚染したりしないように注意してください。各96ウェル深井戸培養プレートには、2つのコントロールを含める必要があります。

予想されるノックダウンに対するポジティブコントロールとしてDS RNAを発現する細菌、表現型、およびネガティブコントロールとして空のDS RNAベクターを含む細菌。滅菌接種ループを使用して、ポジティブコントロールプレートから単一のウェル分離コロニーを取り出し、プレートと呼ばれる深いウェルの空のウェルに接種します。接種された井戸の位置を記録します。

ネガティブコントロールについても繰り返します。ディープウェルプレートを650RPMのフラットポジションで、マイクロシェーカーで摂氏37度で一晩振とうします。培養物を一晩インキュベートした後、96ディープウェルプレートからの細菌は12に移されます。

ウェルフィーディングプレートの移送は、一度に4つのウェルで行うことができます。12チャンネルマルチチャンネルピペットの3チャンネルごとにピペットチップを置きます。ディープウェルプレートから150マイクロリットルの細菌培養物を取り出し、12ウェルフィーディングプレートの4つのウェルの表面に排出します。

移動中に寒天の表面を突き刺さないことが重要です。これは、線虫が穴を掘り、DS RNA発現細菌を食べないようにするためです。4つのウェルの各セットが移された後、4つのピペットチップを4つの新しい滅菌ピペットチップと交換し、フィーディングプレートの次の4つのウェルに播種し、播種されたプレートを室温で一晩中直立させて保存し、バクテリアが寒天に吸収できるようにします。L 1を移送する前に、捕捉されたCエルガン幼虫をDS RNA栄養プレートに載せて給餌スクリーニングを行いました。

以前に調製されたL 1の停止された幼虫の濃度を決定する必要があります。捕獲されたL oneの幼虫が入った三角フラスコを混合して、動物を分配します。次に、10マイクロリットルのアリコートを取り外し、シートを外した6センチメートルのNGMプレートにドロップワイズに置きます。

プレートの中央に4〜5滴で。すべてのメディアがピペットから排出されていることを確認してください。ピペットチップの端を使用して、ウォーム懸濁液の点を広げて、プレートの直径にまたがる液体の単一の連続した線を形成します。

解剖顕微鏡を使用して、液体のラインの一方の端から始まり、液体がプレートに吸収されて動物が分散する前にもう一方の端まで続くすべての動物をカウントします。これには、動物を見逃さないように、解剖スコープの焦点を絶えず合わせ直す必要がある場合があります。3つの別々の10マイクロリットルアリコートに対してこのカウント手順を繰り返して、ワーム懸濁液のマイクロリットルあたりの平均ワーム数を決定し、この数を直接三角フラスコに記録します。

給餌スクリーニングを開始するには、L one停止幼虫の懸濁液と滅菌水を使用して、ミリリットルあたり2000匹のワームを含む溶液を調製します。各12ウェルフィーディングプレートは、動物の均一な分布を確保し、ピペッティングのために動物を滅菌リザーバーに移すために、このワーム懸濁液を120マイクロリットル完全に混合する必要があります。3つの位置にチップが設けられたマルチチャンネルピペットを使用して、10マイクロリットルのワーム溶液を供給プレートの細菌芝生に直接移します。

ワームが寒天に潜り込み、D-S-R-N-A発現細菌を食べないように、寒天の表面を突き刺さないように注意してください。ワーム溶液を2列の供給プレートごとに移した後、ワームが落ち着くと、リザーバー内のワーム溶液を穏やかにスロッシュして再混合します。すべての給餌プレートにワームが付着したら、ワーム懸濁液がプレートに吸収された翌日に、プレートを20°Cインキュベーターの加湿ボックスに直立させて保管し、プレートを反転させて20°Cでヒュミドールに戻します。

これらのプレート上の動物は、Pゼロ表現型の場合は3日後に観察でき、F1表現型の場合は6日後に再び観察できます。ここに記載されているプロトコルは、ノックダウン卵L 30、ダンピー17、PAT 10、および4つの卵L 30および4つの遺伝子が神経系で発現する4つの遺伝子をテストするために使用された。Pat 10は体壁筋に発現し、dumpy 17は表皮細胞に発現します。

Erie one Lin 15 B変異体は、ネガティブコントロールとしてRNAiに対する感度が高いため、スクリーニングで使用されました。線虫には、予想どおりにDS RNAを発現しなかった空のPL 44 40プラスミドを含む細菌を給餌しました。空のプラスミドに含まれる細菌を与えられたRIE one Lin 15 B動物は、形態学的または行動的な欠陥を示さなかった。

この写真は、通常の体の姿勢から証明されるように、自由に動く動物を示しています。黒い矢印は若い成体動物の位置を示しています。白い矢印は、産卵された卵のグループの位置を示しています。

このビデオクリップでは、卵L30は、Gタンパク質サブユニットGαQ.When L one stage Erie one Lin 15 B幼虫に卵L30 DS RNAを発現する細菌を与えられたとき、Gタンパク質サブユニットGαQの海の優雅なオルトログをコードしています。幼虫は成長して成虫になり、移動運動と産卵行動に明らかな欠陥を示しました。3日後、卵L 30に対してDS RNAを与えられた動物の100%が麻痺し、産卵することができなくなりました。

この写真は、すべての動物が麻痺動物に特有の硬直した外観を採用していることを示しています。プレートに産卵がまったくないことにも注意する必要があります。Dumpy 17は、海中でのキューティクル形成に必要なコラーゲンタンパク質をコードしています。

エルガンとダンピー17のヌルミュータントは、野生型の動物よりも背が低く、太っています。この実験では、Dumpy 17 D-S-R-N-Aを与えられたPゼロ動物に形態学的欠陥は観察されませんでした。しかし、この図に示されているF1動物の98%は、だらしない表現型を示しました。

野外にいる成体動物(そのうちの1つが矢印でマークされている)は、黒い矢印でマークされた成体動物よりも背が低く、太っていることに注意してください。パネルAでは、背が低くて太ったPゼロ動物がいないことは、適切な体形態のためには、初期の幼虫期にダンプ17遺伝子機能が必要であることを示しています。Pat 10は、カルシウムに結合する4つのEFハンドモチーフを含む体壁筋トロポニンCAタンパク質をコードしています。

この研究では、Pat 10 DS RNAを与えられたErie one Lin 15 B動物の100%が3日以内に麻痺し、卵を産むことができず、致命的な表現型につながることが観察されました。動物は麻痺しているが、腹側臍帯運動ニューロンで発現し、適切なシナプス入力に必要なホメオドメインタンパク質である4つのコード上の矢印でマークされた頭部近くの細菌の除去によって示されるように、彼らはまだ頭の筋肉を動かして摂食することができることに注意してください。この研究では、4つに対する選択がテスト遺伝子として選択されました。これは、以前のDS RNA供給戦略に耐性があることが証明されているためです。

この研究の結果、ライブラリー調製物から4つのDS RNA発現細菌を与えられた動物の62%が、頭に突っ込まれると正弦波運動で自由に後退する野生型の動物と比較して、移動行動に欠陥を示し、UNCの4つのヌル変異体は後退せず、代わりにしっかりと収縮して背屈筋を引き起こすことが示されました。 これはしばしば非常に極端になり、動物の頭と尾が触れて体をコイル状の位置に置きます。この表は、ノックダウン実験ごとに100匹の動物を調べた4つの遺伝子のそれぞれに対してDSのRNAを与えられたときに、ヌル様表現型を示す動物の割合を示しています。これらの結果は、DS RNAの成功にとってプラスミド保持の重要性を示しています。

干渉スクリーニング 堅牢で浸透性の高い機能喪失表現型は、すべての組織で観察できます。線虫に与えたすべての細菌がDS RNAを発現すると、一度使いこなせば、約2ヶ月で1人で全給餌ライブラリーをスクリーニングすることができます。スループットを向上させるために、各細菌クローンを給餌スクリーンで一度だけテストします。

その後、ライブラリーを最初に通過して同定された遺伝子は、再試験されます。トリプリケートでは、遺伝子が陽性のヒットとして二乗されるためには、すべての再テストで目的の表現型が観察されることを主張します。次に、プラスミドを細菌から精製し、配列決定して、コードされた遺伝子の同一性を確認します。

遺伝子が特定されると、利用可能な場合はL変異体を注文し、目的の表現型についてテストしてから、遺伝子の追加の特性評価を行います。