Name: 大規模な遺伝子ノックダウン中 C.虫堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T19:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 38 s
Description: 学ぶ C. elegansにおける大規模RNAiスクリーニングのための改良dsRNA摂食プロトコル。プラスミド保持を最適化し、堅牢な遺伝子ノックダウンと再現性のある表現型解析を実現する方法です。

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この作品は、健康MH097163の国立研究所からの資金によって支えられている。いくつかの株は、研究基盤プログラムのNIHのオフィス（P40-OD010440）によって資金を供給されるCGC、提供された。

<ol><li>Mello, C. C., Conte, D. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+C.+elegans%3A+soaking+in+the+genome+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+RNA+silencing+from+C.+elegans+tissues+does+not+require+the+RNA+channel+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+of+C.+elegans+using+the+hypersensitive+rrf-3+strain+reveals+novel+gene+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions.</a> PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).</li>
<li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li>
<li>Sieburth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genes+required+for+synapse+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genes required for synapse structure and function.</a> Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), (2001).</li>
<li>Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype%2C+ploidy%2C+and+gene+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Karyotype, ploidy, and gene dosage.</a> WormBook. , 1-9 (2005).</li>
<li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).</li>
<li>Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+synaptic+transmission+by+EGL-30+Gqalpha+and+EGL-8+PLCbeta%3A+DAG+binding+to+UNC-13+is+required+to+stimulate+acetylcholine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release.</a> Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).</li>
<li>Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Galphaq+regulates+egg-laying+behavior+via+a+PLCbeta-independent+and+serotonin-dependent+signaling+pathway+and+likely+functions+both+in+the+nervous+system+and+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle.</a> Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).</li>
<li>Lickteig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurotransmitter+vesicles+by+the+homeodomain+protein+UNC-4+and+its+transcriptional+corepressor+UNC-37%2Fgroucho+in+Caenorhabditis+elegans+cholinergic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons.</a> J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).</li>
<li>Terami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+organization%2C+expression%2C+and+analysis+of+the+troponin+C+gene+pat-10+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).</li>
<li>Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+collagen+SQT-3+has+complex+and+essential+functions+in+nematode+collagen+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly.</a> Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).</li>
<li>Brundage, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+C.+elegans+Gqalpha+gene+disrupt+movement%2C+egg+laying%2C+and+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability.</a> Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).</li>
<li>Gönczy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).</li>
<li>Miller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+unc-4+gene+encodes+a+homeodomain+protein+that+determines+the+pattern+of+synaptic+input+to+specific+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons.</a> Nature. 355, 841-845 (1992).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+Caenorhabditis+elegans+unc-4+gene+alter+the+synaptic+input+to+ventral+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons.</a> Nature. 355, 838-841 (1992).</li>
<li>Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+and+inducible+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+Wormgate+and+the+ORFeome%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome.</a> Gene. 359, 26-34 (2005).</li>
<li>Wani, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+dopamine+receptor+signaling+is+modulated+by+the+R7+RGS+protein+EAT-16+and+the+R7+binding+protein+RSBP-1+in+Caenoerhabditis+elegans+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons.</a> PLoS One. 7 (5), e37831(2012).</li>
<li>Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+to+identify+postembryonic+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3442(2012).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

我々はC.大規模スクリーニングを行うために、市販のdsRNAを送りライブラリを使用してプロトコルを記載した虫 。我々は、ライブラリを複製し、それを効果的に使用するようにすべての手順を説明します。我々は、このアプローチは、動物の異なる組織における異なる生物学的過程に関与する遺伝子を同定することができることを実証している。我々はここで説明した表現型が（UNC、EGL、およびDPY）は容易に観察可能であるが、このプロトコルは、ほとんどすべての生物学的プロセスに必要とされる遺伝子を検索するために適合させることができる。例えば、我々は、ウォーム25における神経伝達に必要な遺伝子を同定するためにこのプロトコルを使用している。動物はdsRNAを発現菌に供給した後（典型的には、P0画面、F1スクリーンのための6-7日間、3日間）は、それらが給電プレートから除去し、任意の行動表現型について試験することができる。 プラスミド損失： 我々は減少し、ノックダウン効率が中に観察されたことがわかった大規...

Cの歴史的には、遺伝子スクリーニングエレガンスは、DNA内にランダム突然変異を作成するために、例えば、エチルメタンスルホネートなどの化学変異原で動物を処理することによって行われている。変異誘発された動物の子孫またはgrandprogenyは、その展示を希望する異常な表現型を分離している。表現型を引き起こす原因となる変異は、次いで、労働集約的なマッピング手順を介して、または変異型ワームの全ゲノムを配列決定することによって同定される。そこに、彼らは両方のゲイン関数のと機能喪失型の表現型を引き起こすことができるワームゲノム内の恒久的な損傷を作成するような化学的突然変異誘発画面を実行するには多くの利点がありますが、マッピング手順が遅く、高価である。 二本鎖RNA干渉（dsRNAi）の重要な生物学的過程に関与する遺伝子を同定するための代替手段を提供する。この方法では、内因性遺伝子のコード配列に一致するdsRNAはウォームに導入される。dsRNAはガイドが破壊1のためにそれらを標的化、マッチング内因性mRNAを見つけて結合するように機能する小さな（21〜22ヌクレオチド）RNAを生成するために、 生体内で処理される。この手順は、比較的迅速であるが、dsRNAがmRNAのではなく、DNAを標的とするため、唯一の還元の機能表現型は、このアプローチを使用して観察される。 動物へのdsRNAの導入は、dsRNAの3匹の動物を浸漬することにより、またはdsRNA 4を発現する動物の細菌を供給することにより、2のdsRNAの直接注射により達成することができる。これらの送達方法はそれぞれの動物のほとんどの細胞は、SID-1は、dsRNA 5のインポートが可能な膜貫通チャネルを表現するなどの全身のノックダウン効果を引き起こす。当初の時点で、個々の遺伝子の発現のいずれかをノックダウンする逆遺伝学的アプローチとして用い、2つの給電ライブラリーの開発は、現在、大規模な遺伝子スクリーニングを可能にする。市販のdsRNAはライブラリはBAが含まれているすべてのCの 55パーセント以上87パーセントのどちらかを表現cterialクローン虫の遺伝子6、7。 残念ながら、大規模なdsRNAi送り画面は、多くの場合、変数のノックダウン効率8月10日になる。 RNAiによるノックダウンの絶対レベルは容易に測定されていないが、大規模な画面で観察減少ノックダウン効率は、RNAiによる分解を免れる残留遺伝子特異的なmRNAによって引き起こされている必要があります。これは、順番に、これらの画面で動物に供給される細菌からのdsRNAのプラスミドの損失の直接の結果であってもよい。ノックダウン効果を給餌した動物11を制御するために比較した場合、（もしあれば）は、この考えを支持する、動物は、細菌の50％のみが標的遺伝子に対するdsRNAを発現する細菌の混合物を供給し、劇的に減少を示す。 Cのほとんどの遺伝子としてdsRNAi画面を実行するときに遺伝子ノックダウンの程度は重大な関心事になるエレガンス haplosufficientであり、したがって、遺伝子発現は少なくとも50％のtだけ小さくしなければならないO機能喪失は12を表現型の原因。 我々は、大規模なスクリーニングを行うために以前に公開された給餌プロトコルを使用し、他の8〜10によって報告された同一の変数ノックダウン効果を見出した。考えられる原因の検索では、画面内の動物に与えた細菌の60％近くは、dsRNAのプラスミドを失っていたことがわかった。当社は、飛躍的に低減または排除するプラスミドの損失を大幅ノックダウン効率を改善し、ライブラリの重複やスクリーニングプロトコルを開発した。このプロトコルは、C.大規模スクリーニングを実施するのに適しているエレガンスとは、市販のdsRNAライブラリーのどれかをスクリーニングするために使用することができる。このプロトコルを使用して、我々は、画面中、動物に供給された細菌の本質的に100％がdsRNAをコードするプラスミドを保持し、試験した全ての組織における機能の表現型の堅牢で高度に浸透損失を引き起こすことを発見。

<table><tr><tbody><td colspan="4">試薬/材料</strong</td></tr><tr><td>>96ウェルファルコンフラットボトムプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>353072</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>接着ホイル</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>2923-0100</td><td></td></tr>ヌ<tr><td>ンクオムニプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>267060</td><td></td></tr><tr><td>2.0ml深さ96ウェルポリプロピレンマスターブロック</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>5678-0285</td><td>ディープ</td></tr><tr><td>ウェルプレート用オート</td>クレーブ可能な蓋 <td>USA Scientific</td><td>5665-6101</td><td></td></tr><tr><td>50 ml combitips</td><td>USA Scientific</td><td>4796-5000</td><td>個別包装</td></tr><tr><td>リザーバー</td><td>USA Scientific</td><td>2977-8500</td><td>オートクレーブ可能</td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7512</td><td>個別包装</td></tr><tr><td>dsRNA供給ライブラリ</td><td>OpenBiosystems</td><td>RCE1181</td><td>店舗 -80 &deg;C</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td></td><td></td>は<td>、分娩に 2-4 週間かかります <a href="http://www.biochemicaldirect.com" target="_blank">www.biochemicaldirect.com</a></td></tr><tr><td>Bacteriolgical 寒天 超高純度グレード A </td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>ウォームプレート</td></tr><tr>用<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Brayer</td><td>ローラーUSAサイエンティフィック</td><td>9127-2940</td><td></td></tr><tr><td>B&#8211;kel 96ピンレプリケーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-450-9</td><td>オートクレーブマイクロ</td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>1231A93</td><td>3 mm 軌道</td></tr><tr><td>12 チャンネルマルチチャンネルピペット (0.5-10 &mu;l)</td><td>USA Scientific</td><td>7112-0510</td><td></td></tr><tr><td>12チャンネルマルチチャンネルピペット(30-300 &mu;l)</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>7112-3300</td><td></td></tr><tr><td>リピータープラス手動ピペ</td><td>ッターUSAサイエンティフィック</td><td>4026-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; c.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsrna摂食ライブラリの使用

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

dsRNAを発現するワーム細菌を供給することにより、RNA干渉は、C.での遺伝子機能を評価するための有用なツールであった虫 。少数の遺伝子がノックダウンの標的とされるときにこの戦略はうまく機能するが、大規模な給電スクリーンはそれらの有用性を制限する、可変ノックダウン効率を示している。我々は、以前に公表されたRNAiノックダウンプロトコルを解体させ、ノックダウンの主な原因は、動物に与え細菌からのdsRNAをコードするプラスミドの喪失に起因し得ることを見出した。これらの観​​察に基づいて、我々は非常に効率的な、ハイスループットノックダウンを達成するために、プラスミド損失を低減または排除するのdsRNA給餌プロトコルを開発した。我々は、このプロトコルはCのダウン、堅牢で再現性のあるノックを生成することを実証ニューロンを含む複数の組織タイプで遺伝子を、 線虫 、および大規模なスクリーニングにおいて効率的なノックダウンを可能にする。このプロトコルは、市販のdsRNA送りを使用していますライブラリとライブラリを複製したdsRNAの画面を実行するために必要なすべての手順を説明します。プロトコルは任意の高度な機器の使用を必要としないので、任意C.によって行うことができるラボエレガンス 。

P0ノックダウン表現型は、細菌を表現するdsRNA動物の飼育、2〜3日後に表示されるようになります。いくつかの初期の表現型は、幼虫の逮捕と致死性が含まれており、すべての給紙のウエル2〜3％で観察されるべきである。これらの同じ表現型はまた、F1世代の動物で観察されるであろう。孵化に失敗し、F1の卵の存在は、他の一般的なF1の表現型であり、一緒に、これらの3表現型は、F1の画面ですべてのウェルの約10％で観察されます。 我々は、P0とF1の表現型の両方の組織型の種々の発現のためのいくつかの遺伝子のノックダウン効果を調べるためにここに記載されたプロトコールを使用した。我々はまた、神経組織内のノックダウン効果をテストしたかったので、我々はえり-1を使用し、私達のスクリーンでのLIN-15B変異体。 えり-1およびLIN-15Bの変異は、RRF-3に変異を有するとともに、RNAiは8,13,14に対する感受性を引き起こした突然変異についてスクリーニングで同定され...

dsRNAは、Cで供給しながら、 エレガンスは、大規模な送り画面の現在のプロトコルは、可変ノックダウン効率をもたらす遺伝子機能を評価するための強力なツールである。我々は、遺伝子発現の非常に有効かつ再現性のノックダウンをもたらす大規模なRNAi送り画面を実行するための改良されたプロトコルを記載している。

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; C.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

この手順の全体的な目的は、細菌DS RNAフィーディングライブラリを用いて遺伝子発現をノックダウンさせ、C. elegansで大規模なRNA干渉スクリーニングを行うことです。これは、まずDS RNAライブラリから細菌クローンを培養することによって達成されます。プラスミドの脱落を防ぐ増殖条件下で、まず各プライマリーライブラリプレートを複製し、次にその96ウェル複製ライブラリプレートを用いて、アガーオムニプレート上に細菌の一時的なストックを作成します。これらのオムニプレートから回収した細菌を液体培地で一晩培養し、その後、線虫の餌用プレートの表面に塗布します。ライブラリーの各細菌クローンは、1つのC. elegans遺伝子をノックダウンさせるための独自のdsRNAコードプラスミドを保持しています。次のステップは、同期させた線虫を餌用プレートに配置することです。次に、線虫を20 °Cの加湿チャンバー内で数日間育成します。線虫が細菌を摂食すると、誘導されたDS RNAが動物の腸管内に放出され、その後周囲の組織に拡散して全身的なノックダウン効果を引き起こします。最終ステップとして、給餌した動物を観察し、遺伝子特異的なノックダウンによって生じた表現型への影響を調べます。これらの表現型解析は、研究対象となっている生物学的プロセスにおいて重要な遺伝子を特定するために用いられます。線虫の生殖腺への二本鎖RNAのマイクロインジェクションなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、ハイスループットであることです。フィーディングライブラリを用いることで、わずか数週間でほぼすべての C. elegans 遺伝子の生物学的機能を解析することが可能です。多くの研究室がこのノックダウン手法に苦労してきました。なぜなら、C. elegansのほとんどの遺伝子はハプロ不十分ではない（ハプロ十分である）ためです。したがって、機能喪失表現型を誘導するためには、RNAノックダウンによって遺伝子発現を50%以上減少させる必要があります。確実な遺伝子ノックダウンを実現するためには、線虫に与えるすべての細菌が二本鎖RNAプラスミドを発現していることが不可欠です。プラスミド脱落を決定する手順を開始するために、各関連ステップに従って少量の細菌サンプルを採取し、450 µLの滅菌水に加えます。この希釈サンプルを100 µL使用し、滅菌水を用いてさらに段階希釈を行います。希釈の合間には、溶液を十分に混合してください。各希釈液100 µLをLBプレートおよびLB AMPプレートに塗布し、37 °Cで一晩培養します。翌日、100個から500個の細菌コロニーが含まれているLBプレートを特定してください。このプレートと、同じ希釈率の細菌を含む対応するLB AMPプレート上のコロニー数を数えます。この式を用いてプラスミド脱落率を決定します。プラスミドを含まない細菌の割合は、LBプレート上のコロニー数からLB ampプレート上のコロニー数を引き、それをLBプレート上のコロニー数で除して100を掛けることで算出します。効果的なノックダウンを実現するため、高濃度のカルボニルセリンを含む培地で細菌を培養し、プラスミドの脱落を防止します。動物への投与前にプラスミドの脱落を確認し、脱落率が15%未満である場合にのみ手順を継続してください。まず、-80°Cのフリーザーからライブラリープレートの複製を取り出すことから始めます。培養物が凍結している間に、アルミホイルのシールを剥がしてください。プレートのプラスチックカバーを戻し、複製ライブラリプレートを水平な場所に置いて、室温で30分以内に解凍します。96ピンレプリケーターを滅菌します。レプリケーターをエタノール浴に浸し、その後エタノールを燃やして滅菌します。ブンゼンバーナーを用いてピンを火にかけ、コーティングを除去します。炎が消えるまで待ち、この操作を繰り返します。清潔なレプリケーターのピンは、使用前に蒸留水で洗浄し、滅菌させてください。滅菌済みのレプリケーターを解凍したデュプリケートプレートのウェルに入れ、培養液を穏やかに撹拌します。少量の培養液がレプリケーターのピンに付着します。レプリケーターをデュプリケートプレートのウェルから慎重に抜き取り、オムニプレートの表面にピンを下にして静かに置きます。寒天表面を突き破らないように注意してください。レプリケーターのピンから細菌が寒天表面に転写されるよう、オムニプレートの表面に3〜4秒間置いてください。固体培地でのプラスミド脱落を防ぐため、プレートには2 mg/mLが含まれています。カーボンセリン。レプリケーターを取り除き、少量の細菌培養液をアガーに吸収させます。両方のプレートの複製が完了した後。翌朝、オムニプレートを倒立させた状態で37 °Cで15〜18時間インキュベートします。これらのオムニプレートは、96ウェル液体培養への接種に使用するか、4 °Cで最大7日間保存することができます。線虫への給餌用細菌は、リピートピペッターと50 mLコンビチップを用いてオムニプレートから細菌を回収し、液体培養として調製します。細菌増殖培地1 mLを、各2 mLの容器に分注します。96ウェルプレートのディープウェルを用意し、レプリケーターを滅菌して、細菌コロニーを含むオムニプレートの表面に配置します。この際、ピンが96個すべての細菌コロニーに接触していることを確認してください。レプリケーターをオムニプレートの表面からディープウェルプレートへと慎重に移動させ、ピンが成長培地に浸るまでディープウェルの側壁を擦らないように注意します。その後、細菌を成長培地中に遊離させます。ディープウェルプレートの内壁に沿って、レプリケーターを四角形を描くようにゆっくりと動かします。液が飛散し、ウェル間で相互汚染が起こらないよう注意してください。96ウェルのディープウェル培養プレートごとに、2つのコントロールを含める必要があります。期待されるノックダウンおよび表現型のポジティブコントロールとしてDS RNAを発現する細菌と、ネガティブコントロールとして空のDS RNAベクターを含む細菌を使用します。滅菌済みの白金耳を用い、ポジティブコントロールプレートから単一の独立したコロニーを採取し、ディープウェルプレートの空のウェルに接種します。接種したウェルの位置を記録してください。陰性対照についても同様に繰り返します。ディープウェルプレートをマイクロシェーカーを用い、37 °Cで650 RPMの水平状態で一晩振盪します。培養液を一晩インキュベートした後、96ディープウェルプレートから細菌を12に分注します。供給プレートへの転移は、一度に4ウェルずつ行うことができます。12チャンネルマルチチャンネルピペットの3チャンネルごとにチップを装着します。ディープウェルプレートから150 µLの細菌培養液を採取し、12ウェル供給プレートの4つのウェル表面に分注します。転移の際、アガロースの表面を突き刺さないことが重要です。突き刺すと、線虫が潜り込んでしまい、dsRNAを発現する細菌を摂取しなくなるためです。4ウェル分を転移させるごとに、ピペットチップを4本の新しい滅菌チップに交換し、フィーディングプレートの次の4ウェルに播種します。播種したプレートは、細菌がアガロースに吸収されるよう、室温の暗所で一晩直立状態で保存してください。その後、L1期で停止させたC. elegans幼虫をdsRNAフィーディングプレートに転移させ、フィーディングスクリーニングを行います。あらかじめ調製したL1 arrested larvaeの濃度を決定する必要があります。エルレンマイヤーフラスコを混ぜて、個体を均一に分散させます。その後、10 µLのアリコートを分注し、未播種の状態の6 cm NGMプレートに滴下します。プレートの中央に4〜5滴滴下します。ピペットからすべての培地が排出されたことを確認してください。ピペットチップの先端を使用して、線虫懸濁液の滴を広げ、プレートの直径にわたる一本の連続した液線を作ります。解剖顕微鏡を用いて、液体がプレートに吸収されて動物が分散する前に、液滴の一端から他端まで全ての個体数を計測します。個体を見落とさないよう、解剖顕微鏡の焦点を常に調整し続ける必要がある場合があります。この計数手順を10 µLのアリコート3回分に対して繰り返し、虫懸濁液1 µLあたりの平均個体数を算出し、この数値をエルレンマイヤーフラスコに直接記録します。フィーディングスクリーニングを開始するために、L1期停止幼虫の懸濁液と滅菌水を用いて、1 mLあたり2000匹の虫を含む溶液を調製します。12ウェルフィーディングプレート1枚につき、この虫懸濁液120 µLが必要となります。動物が均一に分散するように十分に混合し、ピペッティング用に滅菌リザーバーに移します。チップを3つおきの位置にセットしたマルチチャンネルピペットを使用し、虫溶液10 µLをフィーディングプレートの細菌ローン上に直接分注します。線虫がアガールの内部に潜り込み、dsRNA発現細菌を摂食しなくなるため、アガールの表面を突き刺さないように注意してください。給餌プレートの2列ごとに線虫懸濁液を移し終えた後、線虫は速やかに沈降するため、リザーバー内の線虫懸濁液をゆっくりと揺らして再懸濁させてください。初期段階で、いくつかのウェルを解剖顕微鏡下で確認し、各ウェルに20から30匹の線虫が入っていることを確認してください。すべての給餌プレートへの分注が完了したら、プレートを直立させた状態で加湿ボックスに入れ、20 °Cのインキュベーターで保管します。翌日、線虫懸濁液がプレートに吸収された後、プレートを反転させ、再び20 °Cの加湿ボックスに戻してください。これらのプレート上の動物は、3日後にP0表現型を、さらに6日後にF1表現型を観察することができます。本プロトコルでは、egg L 30、dumpy 17、PAT 10、およびon fourの4つの遺伝子のノックダウンを検証しました。egg L 30とon fourは神経系で発現しています。Pat 10は体壁筋で発現し、dumpy 17は表皮細胞で発現しています。陰性対照として、RNAiに対する感受性が高まっているErie one Lin 15 B変異体をスクリーニングに使用しました。線虫には、予想通りDS RNAを発現しない空のPL 44 40プラスミドを含む細菌を給餌しました。空のプラスミドを含む細菌を給餌したRIE one Lin 15 B個体には、形態学的または行動学的な欠損は見られませんでした。この写真は、正常な身体姿勢からわかるように、自由に動き回る動物を示しています。黒い矢印は若成体の位置を、白い矢印は産卵された卵の集団の位置を示しています。このビデオクリップでは、線虫の正常な行動を示しています。egl-30は、C. elegansにおけるGタンパク質サブユニットGαqのオーソログをコードしています。L1期のeri-1; lin-15B幼虫にegl-30 dsRNAを発現する細菌を餌として与えると、成長した成虫に運動能および産卵行動の明らかな欠陥が見られました。3日後、egl-30に対するdsRNAを投与された個体の100%が麻痺し、産卵不能となりました。この写真は、すべての個体が麻痺した動物に特有の硬直した外見を呈していることを示しています。プレート上に産卵が全く見られないことも注目すべき点です。Dumpy 17は、海中でクチクラ形成に必要なコラーゲンタンパク質をコードしています。Elganおよびdumpy 17のヌル変異体は、野生型個体よりも体長が短く、太い形態を示します。本実験において、dumpy 17 dsRNAを投与したP0個体には形態的な欠陥は見られませんでした。しかしながら、本図に示すように、F1個体の98%にdumpy表現型が認められました。野外にいる成体（うち1匹を矢印で示している）は、パネルAの黒い矢印で示された成体よりも短く太いことに注意してください。短く太いP0個体が存在しないことは、適切な身体形態の形成には幼虫の初期段階でdumpy 17遺伝子の機能が必要であることを示しています。Pat 10は、カルシウムと結合する4つのEFハンドモチーフを含む体壁筋トロポニンCAタンパク質をコードしています。本研究では、Pat 10 DS RNAを投与したErie one Lin 15 B個体の100%が3日以内に麻痺し、産卵しなくなったため、致死的な表現型を示すことが観察されました。個体は麻痺していますが、矢印で示された頭部付近の細菌の減少からわかるように、摂食のために頭部筋肉を動かすことは可能です。four encodesは、腹側索運動ニューロンで発現し、適切なシナプス入力に必要とされるホメオドメインタンパク質です。本研究でfourをテスト遺伝子として選択したのは、従来のDS RNA投与戦略に対して耐性があることが証明されていたためです。本研究の結果、ライブラリ調製から得られた4種のdsRNA発現細菌を投与した動物の62%に、運動行動の欠陥が認められました。野生型動物は頭部を刺激すると正弦波状の動きで自由に後退しますが、unc-4ヌル変異体は後退せず、代わりに体を強く収縮させて背側屈曲を起こします。この屈曲はしばしば極端になり、動物の頭部と尾部が接触して体が丸まった状態になります。この表は、テストした4つの遺伝子のそれぞれに対するdsRNAを投与した際に、ヌル様表現型を示した動物の割合を示しています。各ノックダウン実験では100匹の動物を調べました。これらの結果は、dsRNAの成功におけるプラスミド保持の重要性を実証しています。干渉スクリーンにより、すべての組織においてロバストかつ浸透性の高い機能喪失表現型を観察することができます。線虫に与えるすべての細菌がdsRNAを発現している場合、習得さえすれば、1人の作業員で約2ヶ月の間にフィーディングライブラリ全体をスクリーニングすることが可能です。スループットを向上させるため、フィーディングスクリーンでは各細菌クローンを1回のみテストします。ライブラリーの一次スクリーニングで同定された遺伝子は、その後再試験にかけられます。当該遺伝子をポジティブヒットとして確定させるには、3連での試験において、すべての再試験で目的の表現型が観察されることを条件としています。その後、細菌からプラスミドを精製し、配列解析を行って、コードされている遺伝子の同一性を確認します。遺伝子が特定されたら、利用可能な場合はL変異体を注文し、遺伝子のさらなる特性解析を行う前に、目的の表現型について検証します。

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