Name: 大規模な遺伝子ノックダウン中 C.虫堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T19:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 38 s
Description: 学ぶ C. elegansにおける大規模RNAiスクリーニングのための改良dsRNA摂食プロトコル。プラスミド保持を最適化し、堅牢な遺伝子ノックダウンと再現性のある表現型解析を実現する方法です。

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この作品は、健康MH097163の国立研究所からの資金によって支えられている。いくつかの株は、研究基盤プログラムのNIHのオフィス（P40-OD010440）によって資金を供給されるCGC、提供された。

<ol><li>Mello, C. C., Conte, D. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+C.+elegans%3A+soaking+in+the+genome+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+RNA+silencing+from+C.+elegans+tissues+does+not+require+the+RNA+channel+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+of+C.+elegans+using+the+hypersensitive+rrf-3+strain+reveals+novel+gene+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions.</a> PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).</li>
<li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li>
<li>Sieburth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genes+required+for+synapse+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genes required for synapse structure and function.</a> Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), (2001).</li>
<li>Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype%2C+ploidy%2C+and+gene+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Karyotype, ploidy, and gene dosage.</a> WormBook. , 1-9 (2005).</li>
<li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).</li>
<li>Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+synaptic+transmission+by+EGL-30+Gqalpha+and+EGL-8+PLCbeta%3A+DAG+binding+to+UNC-13+is+required+to+stimulate+acetylcholine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release.</a> Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).</li>
<li>Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Galphaq+regulates+egg-laying+behavior+via+a+PLCbeta-independent+and+serotonin-dependent+signaling+pathway+and+likely+functions+both+in+the+nervous+system+and+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle.</a> Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).</li>
<li>Lickteig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurotransmitter+vesicles+by+the+homeodomain+protein+UNC-4+and+its+transcriptional+corepressor+UNC-37%2Fgroucho+in+Caenorhabditis+elegans+cholinergic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons.</a> J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).</li>
<li>Terami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+organization%2C+expression%2C+and+analysis+of+the+troponin+C+gene+pat-10+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).</li>
<li>Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+collagen+SQT-3+has+complex+and+essential+functions+in+nematode+collagen+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly.</a> Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).</li>
<li>Brundage, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+C.+elegans+Gqalpha+gene+disrupt+movement%2C+egg+laying%2C+and+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability.</a> Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).</li>
<li>Gönczy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).</li>
<li>Miller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+unc-4+gene+encodes+a+homeodomain+protein+that+determines+the+pattern+of+synaptic+input+to+specific+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons.</a> Nature. 355, 841-845 (1992).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+Caenorhabditis+elegans+unc-4+gene+alter+the+synaptic+input+to+ventral+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons.</a> Nature. 355, 838-841 (1992).</li>
<li>Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+and+inducible+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+Wormgate+and+the+ORFeome%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome.</a> Gene. 359, 26-34 (2005).</li>
<li>Wani, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+dopamine+receptor+signaling+is+modulated+by+the+R7+RGS+protein+EAT-16+and+the+R7+binding+protein+RSBP-1+in+Caenoerhabditis+elegans+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons.</a> PLoS One. 7 (5), e37831(2012).</li>
<li>Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+to+identify+postembryonic+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3442(2012).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

我々はC.大規模スクリーニングを行うために、市販のdsRNAを送りライブラリを使用してプロトコルを記載した虫 。我々は、ライブラリを複製し、それを効果的に使用するようにすべての手順を説明します。我々は、このアプローチは、動物の異なる組織における異なる生物学的過程に関与する遺伝子を同定することができることを実証している。我々はここで説明した表現型が（UNC、EGL、およびDPY）は容易に観察可能であるが、このプロトコルは、ほとんどすべての生物学的プロセスに必要とされる遺伝子を検索するために適合させることができる。例えば、我々は、ウォーム25における神経伝達に必要な遺伝子を同定するためにこのプロトコルを使用している。動物はdsRNAを発現菌に供給した後（典型的には、P0画面、F1スクリーンのための6-7日間、3日間）は、それらが給電プレートから除去し、任意の行動表現型について試験することができる。 プラスミド損失： 我々は減少し、ノックダウン効率が中に観察されたことがわかった大規...

Cの歴史的には、遺伝子スクリーニングエレガンスは、DNA内にランダム突然変異を作成するために、例えば、エチルメタンスルホネートなどの化学変異原で動物を処理することによって行われている。変異誘発された動物の子孫またはgrandprogenyは、その展示を希望する異常な表現型を分離している。表現型を引き起こす原因となる変異は、次いで、労働集約的なマッピング手順を介して、または変異型ワームの全ゲノムを配列決定することによって同定される。そこに、彼らは両方のゲイン関数のと機能喪失型の表現型を引き起こすことができるワームゲノム内の恒久的な損傷を作成するような化学的突然変異誘発画面を実行するには多くの利点がありますが、マッピング手順が遅く、高価である。 二本鎖RNA干渉（dsRNAi）の重要な生物学的過程に関与する遺伝子を同定するための代替手段を提供する。この方法では、内因性遺伝子のコード配列に一致するdsRNAはウォームに導入される。dsRNAはガイドが破壊1のためにそれらを標的化、マッチング内因性mRNAを見つけて結合するように機能する小さな（21〜22ヌクレオチド）RNAを生成するために、 生体内で処理される。この手順は、比較的迅速であるが、dsRNAがmRNAのではなく、DNAを標的とするため、唯一の還元の機能表現型は、このアプローチを使用して観察される。 動物へのdsRNAの導入は、dsRNAの3匹の動物を浸漬することにより、またはdsRNA 4を発現する動物の細菌を供給することにより、2のdsRNAの直接注射により達成することができる。これらの送達方法はそれぞれの動物のほとんどの細胞は、SID-1は、dsRNA 5のインポートが可能な膜貫通チャネルを表現するなどの全身のノックダウン効果を引き起こす。当初の時点で、個々の遺伝子の発現のいずれかをノックダウンする逆遺伝学的アプローチとして用い、2つの給電ライブラリーの開発は、現在、大規模な遺伝子スクリーニングを可能にする。市販のdsRNAはライブラリはBAが含まれているすべてのCの 55パーセント以上87パーセントのどちらかを表現cterialクローン虫の遺伝子6、7。 残念ながら、大規模なdsRNAi送り画面は、多くの場合、変数のノックダウン効率8月10日になる。 RNAiによるノックダウンの絶対レベルは容易に測定されていないが、大規模な画面で観察減少ノックダウン効率は、RNAiによる分解を免れる残留遺伝子特異的なmRNAによって引き起こされている必要があります。これは、順番に、これらの画面で動物に供給される細菌からのdsRNAのプラスミドの損失の直接の結果であってもよい。ノックダウン効果を給餌した動物11を制御するために比較した場合、（もしあれば）は、この考えを支持する、動物は、細菌の50％のみが標的遺伝子に対するdsRNAを発現する細菌の混合物を供給し、劇的に減少を示す。 Cのほとんどの遺伝子としてdsRNAi画面を実行するときに遺伝子ノックダウンの程度は重大な関心事になるエレガンス haplosufficientであり、したがって、遺伝子発現は少なくとも50％のtだけ小さくしなければならないO機能喪失は12を表現型の原因。 我々は、大規模なスクリーニングを行うために以前に公開された給餌プロトコルを使用し、他の8〜10によって報告された同一の変数ノックダウン効果を見出した。考えられる原因の検索では、画面内の動物に与えた細菌の60％近くは、dsRNAのプラスミドを失っていたことがわかった。当社は、飛躍的に低減または排除するプラスミドの損失を大幅ノックダウン効率を改善し、ライブラリの重複やスクリーニングプロトコルを開発した。このプロトコルは、C.大規模スクリーニングを実施するのに適しているエレガンスとは、市販のdsRNAライブラリーのどれかをスクリーニングするために使用することができる。このプロトコルを使用して、我々は、画面中、動物に供給された細菌の本質的に100％がdsRNAをコードするプラスミドを保持し、試験した全ての組織における機能の表現型の堅牢で高度に浸透損失を引き起こすことを発見。

<table><tr><tbody><td colspan="4">試薬/材料</strong</td></tr><tr><td>>96ウェルファルコンフラットボトムプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>353072</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>接着ホイル</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>2923-0100</td><td></td></tr>ヌ<tr><td>ンクオムニプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>267060</td><td></td></tr><tr><td>2.0ml深さ96ウェルポリプロピレンマスターブロック</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>5678-0285</td><td>ディープ</td></tr><tr><td>ウェルプレート用オート</td>クレーブ可能な蓋 <td>USA Scientific</td><td>5665-6101</td><td></td></tr><tr><td>50 ml combitips</td><td>USA Scientific</td><td>4796-5000</td><td>個別包装</td></tr><tr><td>リザーバー</td><td>USA Scientific</td><td>2977-8500</td><td>オートクレーブ可能</td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7512</td><td>個別包装</td></tr><tr><td>dsRNA供給ライブラリ</td><td>OpenBiosystems</td><td>RCE1181</td><td>店舗 -80 &deg;C</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td></td><td></td>は<td>、分娩に 2-4 週間かかります <a href="http://www.biochemicaldirect.com" target="_blank">www.biochemicaldirect.com</a></td></tr><tr><td>Bacteriolgical 寒天 超高純度グレード A </td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>ウォームプレート</td></tr><tr>用<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Brayer</td><td>ローラーUSAサイエンティフィック</td><td>9127-2940</td><td></td></tr><tr><td>B&#8211;kel 96ピンレプリケーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-450-9</td><td>オートクレーブマイクロ</td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>1231A93</td><td>3 mm 軌道</td></tr><tr><td>12 チャンネルマルチチャンネルピペット (0.5-10 &mu;l)</td><td>USA Scientific</td><td>7112-0510</td><td></td></tr><tr><td>12チャンネルマルチチャンネルピペット(30-300 &mu;l)</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>7112-3300</td><td></td></tr><tr><td>リピータープラス手動ピペ</td><td>ッターUSAサイエンティフィック</td><td>4026-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; c.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsrna摂食ライブラリの使用

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

dsRNAを発現するワーム細菌を供給することにより、RNA干渉は、C.での遺伝子機能を評価するための有用なツールであった虫 。少数の遺伝子がノックダウンの標的とされるときにこの戦略はうまく機能するが、大規模な給電スクリーンはそれらの有用性を制限する、可変ノックダウン効率を示している。我々は、以前に公表されたRNAiノックダウンプロトコルを解体させ、ノックダウンの主な原因は、動物に与え細菌からのdsRNAをコードするプラスミドの喪失に起因し得ることを見出した。これらの観​​察に基づいて、我々は非常に効率的な、ハイスループットノックダウンを達成するために、プラスミド損失を低減または排除するのdsRNA給餌プロトコルを開発した。我々は、このプロトコルはCのダウン、堅牢で再現性のあるノックを生成することを実証ニューロンを含む複数の組織タイプで遺伝子を、 線虫 、および大規模なスクリーニングにおいて効率的なノックダウンを可能にする。このプロトコルは、市販のdsRNA送りを使用していますライブラリとライブラリを複製したdsRNAの画面を実行するために必要なすべての手順を説明します。プロトコルは任意の高度な機器の使用を必要としないので、任意C.によって行うことができるラボエレガンス 。

P0ノックダウン表現型は、細菌を表現するdsRNA動物の飼育、2〜3日後に表示されるようになります。いくつかの初期の表現型は、幼虫の逮捕と致死性が含まれており、すべての給紙のウエル2〜3％で観察されるべきである。これらの同じ表現型はまた、F1世代の動物で観察されるであろう。孵化に失敗し、F1の卵の存在は、他の一般的なF1の表現型であり、一緒に、これらの3表現型は、F1の画面ですべてのウェルの約10％で観察されます。 我々は、P0とF1の表現型の両方の組織型の種々の発現のためのいくつかの遺伝子のノックダウン効果を調べるためにここに記載されたプロトコールを使用した。我々はまた、神経組織内のノックダウン効果をテストしたかったので、我々はえり-1を使用し、私達のスクリーンでのLIN-15B変異体。 えり-1およびLIN-15Bの変異は、RRF-3に変異を有するとともに、RNAiは8,13,14に対する感受性を引き起こした突然変異についてスクリーニングで同定され...

dsRNAは、Cで供給しながら、 エレガンスは、大規模な送り画面の現在のプロトコルは、可変ノックダウン効率をもたらす遺伝子機能を評価するための強力なツールである。我々は、遺伝子発現の非常に有効かつ再現性のノックダウンをもたらす大規模なRNAi送り画面を実行するための改良されたプロトコルを記載している。

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; C.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

この手順の全体的な目的は、細菌DS RNAフィーディングライブラリを用いて遺伝子発現をノックダウンさせ、C. elegansで大規模なRNA干渉スクリーニングを行うことです。これは、まずDS RNAライブラリから細菌クローンを培養することによって達成されます。プラスミドの脱落を防ぐ増殖条件下で、まず各プライマリーライブラリプレートを複製し、次にその96ウェル複製ライブラリプレートを用いて、アガーオムニプレート上に細菌の一時的なストックを作成します。これらのオムニプレートから回収した細菌を液体培地で一晩培養し、その後、線虫の餌用プレートの表面に塗布します。ライブラリーの各細菌クローンは、1つのC. elegans遺伝子をノックダウンさせるための独自のdsRNAコードプラスミドを保持しています。次のステップは、同期させた線虫を餌用プレートに配置することです。次に、線虫を20 °Cの加湿チャンバー内で数日間育成します。線虫が細菌を摂食すると、誘導されたDS RNAが動物の腸管内に放出され、その後周囲の組織に拡散して全身的なノックダウン効果を引き起こします。最終ステップとして、給餌した動物を観察し、遺伝子特異的なノックダウンによって生じた表現型への影響を調べます。これらの表現型解析は、研究対象となっている生物学的プロセスにおいて重要な遺伝子を特定するために用いられます。線虫の生殖腺への二本鎖RNAのマイクロインジェクションなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、ハイスループットであることです。フィーディングライブラリを用いることで、わずか数週間でほぼすべての C. elegans 遺伝子の生物学的機能を解析することが可能です。多くの研究室がこのノックダウン手法に苦労してきました。なぜなら、C. elegansのほとんどの遺伝子はハプロ不十分ではない（ハプロ十分である）ためです。したがって、機能喪失表現型を誘導するためには、RNAノックダウンによって遺伝子発現を50%以上減少させる必要があります。確実な遺伝子ノックダウンを実現するためには、線虫に与えるすべての細菌が二本鎖RNAプラスミドを発現していることが不可欠です。プラスミド脱落を決定する手順を開始するために、各関連ステップに従って少量の細菌サンプルを採取し、450 µLの滅菌水に加えます。この希釈サンプルを100 µL使用し、滅菌水を用いてさらに段階希釈を行います。希釈の合間には、溶液を十分に混合してください。各希釈液100 µLをLBプレートおよびLB AMPプレートに塗布し、37 °Cで一晩培養します。翌日、100個から500個の細菌コロニーが含まれているLBプレートを特定してください。このプレートと、同じ希釈率の細菌を含む対応するLB AMPプレート上のコロニー数を数えます。この式を用いてプラスミド脱

large-scale-gene-knockdown-c-elegans-using-dsrna-feeding-libraries-to

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、タンパク質の発現と局在の後胚レギュレータを識別するための増感方法について説明します。...

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

我々は、使用してプロトコルを記述する...

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

我々は、標的遺伝子とスコアボディサイズの表現型をノックダウンするのRNAi送り技法を使用する方法を示し...

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

RNAiは、C.エレガンスの研究者が利用できる強力な遺伝ツールです。この動画では、液状培養条件を利用して、プレートフィーディングよりも多くの線虫をRNAiで処理する方法を紹介しています。...

液体培養におけるRNAiフィーディング:C.エレガンスにおける遺伝子発現をノックダウンするためのハイスループット法

出典: アンダーソン、Q.L. 他。 ハイスループット,高含有量,液体ベースの C.エレガンス 病態系 J. Vis. 経験。 (2018年)このビデオでは、 Caenorhabditis elegans...

C.エレガンスノックダウンをスクリーニングするためのマルチウェル液体ベースのアッセイ

ここでは、研究室で（D. maculatus）Dermestes maculatus、中間胚芽カブトムシを飼育するためのプロトコルを提示します。我々はまた、この種における遺伝子機能を研究するために胚の表現型を解析するための胚および親のRNAiのためのプロトコルとメソッドを共有しています。...

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、 Dermestes maculatus

シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス...

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

RNA干渉は、特定の発生段階で遺伝子発現を操作するための広く適用可能で強力な技術です。ここでは、この手法を、遺伝子配列の獲得から、構造や行動に影響を与える遺伝子のノックダウンまで、水生潜用カブトムシ の熱NECTTus...

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

Caenorhabditis elegansは 、健康寿命、寿命、ストレスに対する回復力を調査するための堅牢で低コストの方法を備えた優れたモデルシステムとして機能します。...

Caenorhabditis elegansの寿命と健康寿命を測定するための低コストの方法の調査

メタゲノムライブラリの大規模スクリーン

学ぶ C. elegansにおける大規模RNAiスクリーニングのための改良dsRNA摂食プロトコル。プラスミド保持を最適化し、堅牢な遺伝子ノックダウンと再現性のある表現型解析を実現する方法です。

大規模な遺伝子ノックダウン中

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