アストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析グルタミン酸クリアランスの時間経過の導出

実験の全体的な目標は、興奮性シナプスから放出された後のアストロサイト膜からのグルタミン酸クリアランスの時間経過を推定することです。このプロセスの最初のステップは、広域スペクトルのグルタミン酸トランスポーター拮抗薬であるTBOAのサブ飽和濃度の存在下と存在下で、急性脳スライスのアストロサイトからシナプス活性化グルタミン酸輸送の発生を記録することです。2番目のステップは、記録を分析して、シナプス的に活性化されたグルタミン酸トランスポーター電流を誘発応答の他のすべての成分から分離することです。

次に、制御された条件で記録された輸送発生からフィルターを関与させることにより、TBOAの存在下で記録されたトランスポーター電流を分析することにより、フィルターの時間経過を推定します。アストロサイト膜からのグルタミン酸クリアランスの時間経過が得られます。その結果、マウス海馬では、アストロサイトがシナプス的に放出されたグルタミン酸を細胞外空間ベースから除去するのにわずか数ミリ秒しかかからないことが示されました。

このアプローチは、生理学的および病理学的条件の間のさまざまな脳領域におけるアストロサイト吸収能力の変化を検出するための高感度ツールを提供します。このアプローチの主な利点は、例えば、蛍光グルタミン酸インジケーター上の急速に解離するグルタミン酸受容体アンタゴニストの置換解析や拡散反応コンピュータシミュレーションに基づく他の方法と比較して、アストロサイトからのグルタミン酸クリアランスの高い時間分解能、直接的な実験的読み出しを提供することです。この方法により、脳内のシナプス伝達の空間的および時間的ダイナミクスを理解することができます。

これは、アルツハイマー病などの特定の神経障害で発生する可能性のあるグルタミン酸、拡散、および取り込みの病態生理学的変化を解釈するのに役立ちます。この手順は、解剖したマウスの脳にメスで5つの切り傷をつくことから始めます。まず、嗅球と前頭皮質を取り除きます。

次に、小脳を取り除きます。次に、左右の側頭葉を取り外してください。次に、矢状切断の中に2つの脳半球を分離します。

次に、各脳部分の側面を冷たいビブラムベースプレートに接着します。脳の背側はビブラムブレードに面し、脳の腹側はビブラートブレードから離れた寒天ブロックに接触している必要があります。次に、ビブラートベースプレートを解剖チャンバーに固定します。

スライスの厚さを250マイクロメートルに設定し、ブレードの幅を調整してからスライスします。刃が皮質と海馬を通過したら、メスを使って中脳から皮質海馬を切り取ります。その後、スライスを摂氏34度に30分間保持した後、スライスを摂氏34度の浸漬チャンバーに入れます。

この手順の電気生理学的記録に使用する前に、室温まで30分間冷却し、スライスを記録チャンバーに移します。ドット照明またはI-R-D-I-Cの下でスライスを目視検査します。アストロサイトは、その小さな細胞体とシナプス刺激のための顕著な核によって識別できます。

パッチを適用する予定のアストロサイトから約100マイクロメートル離れた場所にバイポーラステンレス鋼電極を配置します。アストロサイトにパッチを当て、非常に穏やかな吸引を適用して細胞全体の構成を壊します。次に、10〜20秒ごとに単一刺激と対刺激を交互に使用して、シナプス的に活性化された輸送発生の促進された部分を分離します。

まず、制御された条件で、10マイクロモルの広域スペクトルグルタミン酸トランスポーター拮抗薬の存在下で、ペアの刺激で少なくとも20回のスイープが得られた。次に、TBOAは、制御条件で単一の刺激で得られた同一数のスイープを平均化し、10マイクロモルのTBOAでは、ペアの刺激で得られた平均トレースから単一の刺激で得られた平均トレースを差し引きます。このステップにより、STO幾何学的および第2の刺激によって誘発される持続的なカリウム電流を分離することができる。

次にシフトすると、対になったパルスを送達するために使用されるPUL間隔と一致する時間間隔で単一の刺激で得られた平均トレースから、以前に得られた第2の刺激に対する平均応答から、単一の刺激で得られた時間シフトされた平均応答を差し引く。このステップは、第2の刺激によって誘発されるトランスポーター電流の促進された部分を分離する。ほとんどの場合、このステップにより、持続するカリウム電流が完全に除去されます。

この場合、FSTCの単離は完了し、デコンボリューション解析を進めて、アストロサイトからのグルタミン酸クリアランスの時間経過に到達できます。ただし、場合によっては、小さな持続的なカリウム電流がまだ存在し、さらなる分析が必要です。実行後に残る持続カリウム電流の振幅を測定します。

前述の分析では、測定された持続カリウム電流の振幅をこの式で として設定することにより、モノ指数関数の振幅を残留持続カリウム電流の振幅にスケーリングします。しかし、立ち上がり時間定数は、持続的なカリウム電流が分離された別の実験で推定された上昇の平均値を表しています。薬理学的には、高飽和濃度のTBOAを使用し、FSTCと持続カリウム電流から得られたモノ指数関数を差し引きます。

FSTCの分離を完了するには。フラッシュがアクティブ化されたトランスポートの発生を分離します。制御条件で光路を開いた状態で得られた少なくとも20回の掃引を平均し、次に10マイクロモルTBOAで得られた少なくとも20回の掃引を平均し、次に制御条件で光路を閉じた状態で得られた同数の掃引を平均し、10マイクロモルTBOAでは、光路を開いた状態で得られた平均トレースから、光路をブロックして得られた平均トレースを差し引きます。

このステップでは、刺激アーチファクトを除去し、FTCを分離し、制御条件および10マイクロモルTBOAで記録されたFSTCまたはFTCのいずれかの輸送電流に適合し、それらを多指数関数で適合させ、この機能に従ってモノ指数関数的に崩壊する瞬間的に上昇する関数を作成し、10マイクロモルTBOAで記録されたトランスポーター電流の崩壊段階を最もよく表します。次に、10マイクロモルTBOAに記録されたトランスポーター電流の適合からモノ指数関数を委譲して、フィルターを導き出します。次に、制御された条件でトランスポーター電流の適合からフィルターを委譲します。

グルタミン酸クリアランスの全体的な時間経過を定量的に推定するには、この手順を試行しながら波形のOIDを計算します。トランスポートの発生が、フィルターが線形領域で動作し、トランスポートの線形歪みのみを導入する実験条件下で記録されることを確認することが重要です。これらからの電流波は、輸送電流のサイズを変更する操作を確認することで実行できます。

スタンプコースを変更しないでください。このビデオを見れば、アストロサイト記録を使用してグルタミン酸、脳内での拡散、取り込みに関する情報を抽出する方法についてよく理解できるはずです。