アストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析グルタミン酸クリアランスの時間経過の導出

本実験の全体的な目的は、興奮性シナプスから放出された後のアストロサイト細胞膜からのグルタミン酸除去の時間経過を推定することです。このプロセスの最初のステップは、広スペクトルのグルタミン酸トランスポーター拮抗薬であるTBOAを、飽和下濃度で添加しない条件下および添加した条件下で、急性脳切片中のアストロサイトからシナプス活性化によるグルタミン酸輸送の発生を記録することです。2番目のステップでは、記録内容を解析し、誘発反応のあらゆる他の成分から、シナプス活性化されたグルタミン酸トランスポーター電流を分離します。

次に、TBOA存在下で記録されたトランスポーター電流を解析し、制御条件下で記録された輸送発生からフィルター成分を差し引くことで、フィルターのタイムコースを推定します。これにより、アストロサイト膜からのグルタミン酸除去のタイムコースが得られます。結果は、マウス海馬のアストロサイトが、細胞外空間からシナプス放出されたグルタミン酸を除去するのにわずか数ミリ秒しか要しないことを示しています。

この手法は、生理学的および病理学的条件下における異なる脳領域でのアストロサイトの取り込み能の変化を検出するための感度の高いツールとなります。例えば、蛍光グルタミン酸インジケーター上での急速に解離するグルタミン酸受容体拮抗薬の置換解析や、拡散反応のコンピューターシミュレーションに基づく他の手法に対する本手法の主な利点は、高い時間分解能でアストロサイトからのグルタミン酸除去を直接的に実験的に読み出せる点にあります。本手法を用いることで、脳内におけるシナプス伝達の空間的および時間的なダイナミクスを理解することが可能になります。

これにより、アルツハイマー病などの特定の神経疾患で起こりうるグルタミン酸、拡散、および取り込みの病態生理学的変化を解釈するのに役立ちます。まず、メスを用いて解剖したマウス脳に5か所の切開を加え、この手順を開始します。最初に、嗅球と前頭前皮質を除去します。

次に、小脳を除去します。続いて、左右の側頭葉を除去してください。その後、正中矢状断により左右の大脳半球を分離します。

次に、各脳切片の側面を冷やしたVibramベースプレートに接着します。脳の背側がVibramブレードに向き、腹側がブレードから離れたアガロースブロックに接するように配置してください。その後、Vibramベースプレートを解剖チャンバーに固定します。

スライス厚を250 µmに設定し、スライス前にブレードの幅を調整します。ブレードが皮質と海馬を通過したら、メスを使用して中脳から皮質海馬を切り離します。その後、スライスを34 °Cで30分間保持し、34 °Cの浸漬チャンバーにスライスを配置します。

本手順の電気生理学的記録に使用する前に、室温で30分間冷却させ、スライスを記録チャンバーに移します。ドット照明またはI-R-D-I-Cの下でスライスを視覚的に確認してください。アストロサイトは、シナプス刺激に適した小さな細胞体と明瞭な核によって識別できます。

パッチクランプを行う予定のアストロサイトから約100 µm離れた位置に、バイポーラステンレス電極を配置します。アストロサイトをパッチし、非常に緩やかな吸引を行うことでホールセル構成に移行させます。その後、10〜20秒ごとに単一刺激とペア刺激を交互に与え、シナプス活性化に伴う輸送現象の促進部分を分離します。

まず、制御条件下および10 µMの広スペクトラムグルタミン酸輸送体アンタゴニスト（TBOA）存在下で、対刺激（paired stimulations）を用いて得られた少なくとも20回のスイープを平均します。次に、制御条件下および10 µM TBOA存在下で、単一刺激（single stimulations）を用いて得られた同数のスイープを平均し、対刺激で得られた平均トレースから単一刺激で得られた平均トレースを差し引きます。このステップにより、STO幾何学的形状および2番目の刺激によって誘発された持続性カリウム電流を単離することができます。

次に、ペアパルスとして与えたPUL間隔と一致する時間分だけ、単回刺激で得られた平均トレースをシフトさせ、先に得られた2回目刺激への平均応答から、この時間シフトさせた単回刺激の平均応答を差し引きます。この手順により、2回目刺激によって誘発されたトランスポーター電流の促進成分が分離されます。ほとんどの場合、この操作によって持続性カリウム電流は完全に除去されます。

この場合、FSTCの単離は完了しており、デコンボリューション解析に進んでアストロサイトからのグルタミン酸除去のタイムコースを求めることができます。しかし、場合によっては、小さな持続性カリウム電流が依然として存在し、さらなる解析が必要なことがあります。操作後に残存している持続性カリウム電流の振幅を測定してください。

前述の解析では、この式におけるaに測定された持続性カリウム電流の振幅を設定することで、単一指数関数の振幅を持続性カリウム電流の振幅にスケールさせています。しかし、立ち上がり時定数は、持続性カリウム電流を単離して行った別の実験で推定された立ち上がりの平均値を表しています。薬理学的に高飽和濃度のTBOAを用いることで、得られた単一指数関数をFSTCおよび持続性カリウム電流から差し引きます。

FSTCの単離を完了させるため、フラッシュ活性化輸送の発生を単離します。コントロール条件下および10 µM TBOA存在下において、光路が開いた状態で得られた少なくとも20回のスイープを平均化し、同様にコントロール条件下および10 µM TBOA存在下で光路が閉じられた状態で得られた同数のスイープを平均化します。その後、光路が開いた状態で得られた平均トレースから、光路が遮断された状態で得られた平均トレースを差し引きます。

このステップでは、刺激アーチファクトを除去し、FTCを単離します。このステップでは、コントロール条件下および10 µM TBOAで記録された輸送電流（FSTCまたはFTC）を多項指数関数でフィッティングします。また、この関数に従って単一指数関数的に減衰し、10 µM TBOAで記録された輸送電流の減衰相を最も適切に記述する、瞬時に立ち上がる関数を作成します。次に、10 µM TBOAで記録された輸送電流のフィッティングから単一指数関数を導出し、フィルターを作成します。その後、コントロール条件下での輸送電流のフィッティングからフィルターを導出します。

グルタミン酸除去の全体的な時間経過を定量的に推定するには、この手順を行う際に波形のOIDを算出してください。輸送現象が、フィルターが線形領域で動作し、輸送に対して線形歪みのみを導入する実験条件下で記録されていることを確認することが重要です。これについては、輸送電流の大きさを変化させる操作を確認することで行うことができます。

スタンプコースを変更しないでください。このビデオを視聴することで、アストロサイトの記録を用いて、脳内におけるグルタミン酸、拡散、および取り込みに関する情報を抽出する方法について、十分に理解できるはずです。