Name: アストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析グルタミン酸クリアランスの時間経過の導出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぶアストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析により、マウス海馬におけるグルタミン酸クリアランスの時間経過を正確に推定する方法。この手法はシナプス伝達と神経生理学研究に有用である。

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この作品は、神経疾患の国立研究所と脳卒中学内研究プログラム（NS002986）によってサポートされていました。 AS原稿を書いて、デコンボリューション解析を実施しました。 JSDは、デコンボリューション解析の最初のバージョンを開発し、テキストについてコメント。

<ol><li>Ventura, R., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+relationships+between+hippocampal+synapses+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes.</a> J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).</li>
<li>Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+perisynaptic+astroglia+during+synaptogenesis+in+the+mature+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus.</a> Glia. 55, 13-23 (2007).</li>
<li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li>
<li>Herman, M. A., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glutamate+concentration+in+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice.</a> J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).</li>
<li>Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+independent+hippocampal+synapses+is+controlled+by+glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake.</a> Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).</li>
<li>Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+synapse+independence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An evaluation of synapse independence.</a> J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).</li>
<li>Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+glutamate+diffusion+in+the+hippocampus%3A+ultrastructural+constraints%2C+uptake%2C+and+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation.</a> J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).</li>
<li>Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+coupling+in+a+neuronal+glutamate+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flux coupling in a neuronal glutamate transporter.</a> Nature. 383, 634-637 (1038).</li>
<li>Eliasof, S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+cell+glutamate+transporter+is+coupled+to+an+anionic+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).</li>
<li>Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+fluxes+associated+with+excitatory+amino+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport.</a> Neuron. 15, 721-728 (1995).</li>
<li>Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+and+microscopic+properties+of+a+cloned+glutamate+transporter%2Fchloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel.</a> J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).</li>
<li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li>
<li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes%3A+transmitter+uptake+gets+faster+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).</li>
<li>Scimemi, A., Tian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transporters+regulate+glutamate+clearance%2C+NMDA+receptor+activation%2C+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).</li>
<li>Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+enhances+glutamate+uptake+via+glutamate+transporters+in+rat+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells.</a> Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).</li>
<li>Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+uptake+of+glutamate+and+aspartate+into+glial+cells+isolated+from+the+salamander+%28Ambystoma%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina.</a> J. Physiol. 436, 169-193 (1991).</li>
<li>Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+coupled+and+uncoupled+currents+during+glutamate+uptake+by+GLT-1+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters.</a> J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+does+not+overwhelm+transporters+on+hippocampal+astrocytes+during+high-frequency+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation.</a> J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).</li>
<li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li>
<li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li>
<li>Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid%CE%B21-42+slows+clearance+of+synaptically-released+glutamate+by+mislocalizing+astrocytic+GLT-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1.</a> J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).</li>
</ol>

著者らは、利害の対立を宣言しません。

ここでは、アストロサイトから電気生理学的記録を取得するための実験的なアプローチ、アストロサイトおよびアストロサイトのトランスポーター電流からグルタミン酸クリアランスの経時変化を導出する数学的方法ではグルタミン酸トランスポーター電流を分離する分析プロトコルを記述します。 分析の成功は、アストロサイトからのトランスと電流を記述するために使用されるフ​​ィッティングアルゴリズムの精度に高品質のパッチクランプ記録を得る能力に依存する。デコンボリューション解析は、以下の2つの仮定に依存している。（1）現在、実験的に記録されたトランスポーターにグルタミン酸クリアランスの経時変化を歪める複数のプロセスを線形システムとして表すことができる。絶対的ではあるが形状トランスポーター電流が非線形システム（原則グルタミン酸結合と輸送の両方が飽和を受けることができる）、実験的証拠インディカであることが要因の多く彼らの線形領域が広いことをTES。したがって、輸送電流のとグルタミン酸クリアランスの時間経過は、刺激の強さ、放出確率、及びグルタミン酸濃度13,14,18の広い範...

アストロサイトは、星型の形態と神経網全体に拡張し、隣接したシナプスの接点1,2達する細かい膜突起と脳の中で最も豊富な種類の細胞の一つである。アストロ&#39;細胞膜が密グルタミン酸トランスポーター分子3が満載されています。生理学的条件下で、グルタミン酸輸送体は急速に膜の細胞側にグルタミン酸を結合し、細胞の細胞質に転送する。そうすることによって、輸送体は、細胞外空間4におけるグルタミン酸の低い基底濃度を維持する。シナプスの興奮に隣接細かいアストロサイトのプロセスにおけるグルタミン酸トランスポーターは、理想的に、それが離れてシナプス間隙から拡散するようにシナプスのイベントの際に放出グルタミン酸をバインドするために配置されている。そうすることにより、輸送体はまた興奮性信号の空間的な広がりを低減し、周囲と余分シナプス地域に向けて、隣接するシナプスへのグルタミン酸スピルオーバー制限5-7脳内の。 グルタミン酸輸送は、化学量論的に3のNa +と1 H +彼らの電気化学的勾配に沿って1の逆輸送への動きK + 8に結合された起電プロセスです。 （チオシアン酸）&gt; NO 3 - - （硝酸塩）≈のClO 4 - （過塩素酸）&gt; I - &gt; Brの- &gt; Cl -の&gt; F -はなく、グルタミン酸輸送はSCNに対して透過性（ただし、化学量論的に結合されていない）のアニオン性コンダクタンスに関連付けられています（メタンスルホン酸）とC 6 H 11 O 7 - - （グルコン）9-11 CH 3 SO 3へ。両方の電流（化学量論的および非化学量論的）Dodt照明やacutで赤外微分干渉コントラスト（DIC-IR）の下で視覚的に識別、星状細胞から全細胞パッチクランプ記録を取得することによって記録することができる電子脳スライス12。膜を通過するグルタミン酸トランスポートに関連付けられた現在の化学量論的成分がCH 3 SO 3を用いて単離することができる- 、またはC 6 H 11 O 7 -ベース内のソリューションとアストロ13,14上のフラッシュアンケージンググルタミン酸によって誘発することができ、または近隣のシナプスからのグルタミン酸放出を活性化することによって、どちらか電気12またはターゲットoptogeneticコントロール付き。 現在のトランスポーターの化学量論的成分の時間経過は、によって、星状細胞膜（ すなわちグルタミン酸クリアランス）、グルタミン酸トランスポーターの動態、アストロサイトの受動的膜特性、時およびシナプスの刺激時のグルタミン酸濃度プロファイルの寿命によって形作られているアクティブシナプス13渡るグルタミン酸放出のシンクロニシティ。ここでは、完全な詳細に説明します：（1）実験グラムApproachは、例えば実験的製剤として急性マウス海馬スライスを使用して星状細胞から全細胞パッチクランプ記録からグルタミン酸トランス電流の化学量論的成分を単離するステップと、（2）分析的アプローチは、これらの記録から13グルタミン酸クリアランスの経時変化を導出するために、 14。これらの方法は、中枢神経系の任意の領域におけるアストロサイトからのグルタミン酸トランス電流を記録して分析するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>CGP52432</td><td>トクリス</td><td>1246</td><td></td></tr><tr><td>(R,S)-CPP</td><td>トクリス</td><td>173</td><td></td></tr><tr><td>DPCPX</td><td>トクリス</td><td>439</td><td></td></tr><tr><td>LY341495二ナトリウム塩</td><td>トクリス</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>MSOP</td><td>トクリス</td><td>803</td><td></td></tr><tr><td>NBQX 二ナトリウム塩</td><td>トクリス</td><td>1044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-TBOA</td><td>Tocis</td><td>1223</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>MNI-L-グルタミン酸</td><td>Tocris</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A10438</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>マトリックス電極</td><td>Frederick Haer Company</td><td>MX21AES(JD3)</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細血管</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>デュアルステージガラスマイクロピペットプーラー</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 インスタント接着剤</td><td>Ted Pella</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Xe lamp</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>FlashMic</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

アストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析グルタミン酸クリアランスの時間経過の導出

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

脳内のグルタミン酸トランスポーターの最高密度はアストロサイトに含まれています。グルタミン酸トランスポーターのカップル3のNa +と1 Hの共同輸送+と1のK +の逆輸送と膜を横切ってグルタミン酸の動き。輸送プロセスによって生成された化学量論的な電流は、星状細胞からの全細胞パッチクランプ記録を監視することができる。記録された電流の時間経過は、星状細胞がさらされるグルタミン酸濃度プロファイル、グルタミン酸輸送体の速度論、及び星状膠細胞膜の受動的電気緊張特性の経時変化によって成形される。ここでは、アストロサイトにおけるグルタミン酸トランスポーター電流を記録し、アストロサイトトランス電流の波形を整形する他のすべての要素からグルタミン酸クリアランスの経時変化を単離することができる実験·分析方法が記載されている。ここで説明する方法は、寿命、oを推定することができるfの健康と病気の間に、中枢神経系の任意の領域におけるアストロサイトの膜にグルタミン酸フラッシュuncagedとシナプスリリース。

分析的アプローチの成功は非常に中枢神経系の任意の領域におけるアストロサイトからトランスポーター電流の高品質の電気生理学的記録を取得するに依存し、ここで説明。急性マウス海馬スライスでは、アストロサイトは容易にため、その小さな細胞体（Ø= 10μm）の著名な核（ 図1）のDodt照明や​​IR-DICの下で識別することができます。細胞内液、（ 図1）にアレクサ594（50μM）のような蛍光体を追加するときに、その特徴的な星型の形態は、共焦点落射蛍光、または二光子レーザー走査顕微鏡で理解することができる。電気生理学的レベルでは、星状細胞は、低入力抵抗、過分極膜電位（〜-90 mVの）および活動電位を生成することができないことを特徴とする。アストロサイトは、隣接するニューロンの電気的またはoptogenetic刺激とCAのUV光分解に応じて電流を発生MNI-L-グルタミン酸のようなGED化合物。 星状細胞輸送電流はセシウム+またはK +ベースの内部溶液を用いて記録することができる...

私たちは、アストロサイトにおけるグルタミン酸トランスポーター電流の電気生理学的記録から、アストロサイトの膜にグルタミン酸の寿命を推定するための分析方法について説明します。

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

本実験の全体的な目的は、興奮性シナプスから放出された後のアストロサイト細胞膜からのグルタミン酸除去の時間経過を推定することです。このプロセスの最初のステップは、広スペクトルのグルタミン酸トランスポーター拮抗薬であるTBOAを、飽和下濃度で添加しない条件下および添加した条件下で、急性脳切片中のアストロサイトからシナプス活性化によるグルタミン酸輸送の発生を記録することです。2番目のステップでは、記録内容を解析し、誘発反応のあらゆる他の成分から、シナプス活性化されたグルタミン酸トランスポーター電流を分離します。次に、TBOA存在下で記録されたトランスポーター電流を解析し、制御条件下で記録された輸送発生からフィルター成分を差し引くことで、フィルターのタイムコースを推定します。これにより、アストロサイト膜からのグルタミン酸除去のタイムコースが得られます。結果は、マウス海馬のアストロサイトが、細胞外空間からシナプス放出されたグルタミン酸を除去するのにわずか数ミリ秒しか要しないことを示しています。この手法は、生理学的および病理学的条件下における異なる脳領域でのアストロサイトの取り込み能の変化を検出するための感度の高いツールとなります。例えば、蛍光グルタミン酸インジケーター上での急速に解離するグルタミン酸受容体拮抗薬の置換解析や、拡散反応のコンピューターシミュレーションに基づく他の手法に対する本手法の主な利点は、高い時間分解能でアストロサイトからのグルタミン酸除去を直接的に実験的に読み出せる点にあります。本手法を用いることで、脳内におけるシナプス伝達の空間的および時間的なダイナミクスを理解することが可能になります。これにより、アルツハイマー病などの特定の神経疾患で起こりうるグルタミン酸、拡散、および取り込みの病態生理学的変化を解釈するのに役立ちます。まず、メスを用いて解剖したマウス脳に5か所の切開を加え、この手順を開始します。最初に、嗅球と前頭前皮質を除去します。次に、小脳を除去します。続いて、左右の側頭葉を除去してください。その後、正中矢状断により左右の大脳半球を分離します。次に、各脳切片の側面を冷やしたVibramベースプレートに接着します。脳の背側がVibramブレードに向き、腹側がブレードから離れたアガロースブロックに接するように配置してください。その後、Vibramベースプレートを解剖チャンバーに固定します。スライス厚を250 µmに設定し、スライス前にブレードの幅を調整します。ブレードが皮質と海馬を通過したら、メスを使用して中脳から皮質海馬を切り離します。その後、スライスを34 °Cで30分間保持し、34 °Cの浸漬チャンバーにスライスを配置します。本手順の電気生理学的記録に使用する前に、室温で30分間冷却させ、スライスを記録チャンバーに移します。ドット照明またはI-R-D-I-Cの下でスライスを視覚的に確認してください。アストロサイトは、シナプス刺激に適した小さな細胞体と明瞭な核によって識別できます。パッチクランプを行う予定のアストロサイトから約100 µm離れた位置に、バイポーラステンレス電極を配置します。アストロサイトをパッチし、非常に緩やかな吸引を行うことでホールセル構成に移行させます。その後、10〜20秒ごとに単一刺激とペア刺激を交互に与え、シナプス活性化に伴う輸送現象の促進部分を分離します。まず、制御条件下および10 µMの広スペクトラムグルタミン酸輸送体アンタゴニスト（TBOA）存在下で、対刺激（paired stimulations）を用いて得られた少なくとも20回のスイープを平均します。次に、制御条件下および10 µM TBOA存在下で、単一刺激（single stimulations）を用いて得られた同数のスイープを平均し、対刺激で得られた平均トレースから単一刺激で得られた平均トレースを差し引きます。このステップにより、STO幾何学的形状および2番目の刺激によって誘発された持続性カリウム電流を単離することができます。次に、ペアパルスとして与えたPUL間隔と一致する時間分だけ、単回刺激で得られた平均トレースをシフトさせ、先に得られた2回目刺激への平均応答から、この時間シフトさせた単回刺激の平均応答を差し引きます。この手順により、2回目刺激によって誘発されたトランスポーター電流の促進成分が分離されます。ほとんどの場合、この操作によって持続性カリウム電流は完全に除去されます。この場合、FSTCの単離は完了しており、デコンボリューション解析に進んでアストロサイトからのグルタミン酸除去のタイムコースを求めることができます。しかし、場合によっては、小さな持続性カリウム電流が依然として存在し、さらなる解析が必要なことがあります。操作後に残存している持続性カリウム電流の振幅を測定してください。前述の解析では、この式におけるaに測定された持続性カリウム電流の振幅を設定することで、単一指数関数の振幅を持続性カリウム電流の振幅にスケールさせています。しかし、立ち上がり時定数は、持続性カリウム電流を単離して行った別の実験で推定された立ち上がりの平均値を表しています。薬理学的に高飽和濃度のTBOAを用いることで、得られた単一指数関数をFSTCおよび持続性カリウム電流から差し引きます。FSTCの単離を完了させるため、フラッシュ活性化輸送の発生を単離します。コントロール条件下および10 µM TBOA存在下において、光路が開いた状態で得られた少なくとも20回のスイープを平均化し、同様にコントロール条件下および10 µM TBOA存在下で光路が閉じられた状態で得られた同数のスイープを平均化します。その後、光路が開いた状態で得られた平均トレースから、光路が遮断された状態で得られた平均トレースを差し引きます。このステップでは、刺激アーチファクトを除去し、FTCを単離します。このステップでは、コントロール条件下および10 µM TBOAで記録された輸送電流（FSTCまたはFTC）を多項指数関数でフィッティングします。また、この関数に従って単一指数関数的に減衰し、10 µM TBOAで記録された輸送電流の減衰相を最も適切に記述する、瞬時に立ち上がる関数を作成します。次に、10 µM TBOAで記録された輸送電流のフィッティングから単一指数関数を導出し、フィルターを作成します。その後、コントロール条件下での輸送電流のフィッティングからフィルターを導出します。グルタミン酸除去の全体的な時間経過を定量的に推定するには、この手順を行う際に波形のOIDを算出してください。輸送現象が、フィルターが線形領域で動作し、輸送に対して線形歪みのみを導入する実験条件下で記録されていることを確認することが重要です。これについては、輸送電流の大きさを変化させる操作を確認することで行うことができます。スタンプコースを変更しないでください。このビデオを視聴することで、アストロサイトの記録を用いて、脳内におけるグルタミン酸、拡散、および取り込みに関する情報を抽出する方法について、十分に理解できるはずです。

deriving-time-course-glutamate-clearance-with-deconvolution-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は内部全反射し、落射蛍光顕微鏡を用いて培養アストロサイトにおける膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くで測定する方法について説明します。...

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

隔離された海馬から急性脳スライスだけでなく、アストロサイトとニューロンの同時電気生理学的記録の準備...

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

このビデオは、マウスの脳スライスの単一の皮質線条体シナプスにおけるグルタミン酸の放出とクリアランスの評価を示しています。電気刺激は、シナプスでのグルタミン酸の放出を促進します。放出されたグルタミン酸は、センサータンパク質の蛍光を変化させ、時間の経過とともに崩壊し、放出効率とクリアランス効率を示します。...

マウス脳スライスにおける単一ニューロンシナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスの解析

ここでは、アストロサイトのGタンパク質共役受容体の可塑性の研究のためのニューロンにおいて恒常的な可塑性を誘導するために使用されるプロトコルの適合を記載している。最近、幼若マウスにおけるIのmGluRアストロサイトのグループ内の変化を調べるために使用される、この方法は、 インサイチューおよびインビボで 、成体マウスからの組織において、種々の星状細胞GPCRのスケーリングを測定し、星状細胞受容体の感受性のより良い理解を得るために適用することができる神経活動の変化に。...

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

ここでは、トニックおよび酵素結合微小電極アレイ（MEA）を使用して、in vivoで相性の細胞外グルタミン酸変化を測定の空間的及び時間的に正確な方法のセットアップ、ソフトウェアナビゲーション、およびデータ分析を記載しています。...

アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して

この報告では、原形質膜で発現されるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を決定するために設計された2つのビオチン化に基づく方法を提示する。...

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

我々は、単一のコルチコストリアタールグルタミン酸シナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスのバランスを、成体マウスからの急性スライスにおける評価するプロトコルを提示する。このプロトコルは、グルタミン酸検出用の蛍光センサ...

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

ここでは、マウスアストロサイトにおけるオルガネラの細胞内輸送と血漿膜タンパク質の取引を可視化するインビトロライブイメージング法について述べる。このプロトコルはまた、貨物輸送の旅程と運動学を決定するための画像分析方法論を提示する。...

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

このプロトコルは、ウイルスの送達、視球体の着床、光血栓誘導、アストロサイトおよびニューロン活動の同時記録、アストロサイトのオプトジェネティック刺激を含む統合的な手法を提供します。この統合手法は、虚血性脳卒中の急性期から慢性期にわたり、アストロサイトとニューロンの関係を同時に調査することを目的としています。...

振る舞うマウスの神経細胞およびアストロサイト活動の光血栓性脳卒中モデリングおよび in vivo 光学記録のための統合手法

この資料では詳細に子宮内で大脳皮質およびマウスのE14.5における海馬をエレクトロポためのプロトコルについて説明します。また、このこれらの2つの脳領域で樹状突起と棘を研究する貴重な方法であることを示している。...

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

学ぶアストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析により、マウス海馬におけるグルタミン酸クリアランスの時間経過を正確に推定する方法。この手法はシナプス伝達と神経生理学研究に有用である。

アストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析グルタミン酸クリアランスの時間経過の導出

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