非ヒト霊長類の肺脱細胞化と特殊大型臓器バイオリアクターを用いた再細胞化

この手順の全体的な目標は、Reus Maccasの肺から全臓器の生物学的マトリックスを分離し、これらのマトリックスを肺組織工学アプリケーションを調査するための足場として使用することです。これは、まずReuss Macaの肺全体を洗剤、塩、酵素で脱細胞化することによって達成されます。第2ステップは、脱細胞化した肺足場をバイオリアクターに設置し、気道の換気と液体細胞培養培地による肺血管系の灌流の両方を行うことです。

次に、肺足場は、気道を介して幹細胞を、肺血管系を介して内皮細胞とともに座ります。最後のステップは、バイオリアクターによって提供される換気および灌流条件下で肺足場内の細胞を所望の時間培養し、続いて得られた細胞および組織の形態を分析することです。最終的には、幹細胞と内皮細胞を用いた無細胞Maca肺スキャフォールドの再形成により、天然の肺組織の解剖学的および組織学的特徴を模倣した人工組織が得られます。

この方法は、幹細胞または前駆細胞を使用して肺組織を再生できるかどうか、または成熟した肺上皮細胞および内皮細胞と連携して肺組織を再生できるかどうかなど、肺組織工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、患者由来の幹細胞または前駆細胞による無細胞肺マトリックスの化により、肺移植に利用できるドナー肺の数が増加する可能性があるため、末期肺疾患の治療にまで及びます。さらに、患者自身の幹細胞を使用して設計された結果として得られる肺は、免疫拒絶反応に対して耐性がある可能性があります。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、イェール大学のローラ・ニコルソン博士の研究室のメンバーによって以前に公開されたジョーのビデオを見たときでした。ここでは、大型動物のResus Meacモデルのニーズに合わせて、げっ歯類の手順の変更を示します。マカティッシュを扱う際には、感染性暴露事故を防ぐために細心の注意を払う必要があります。

ヒト以外の霊長類組織を取り扱う前に、サージカルマスク、フェイスシールド、サージカルグローブの1層、使い捨てガウン、および肺を解剖トレイに平らに横たわったサージカルグローブの2層目を含む個人用保護具を着用し、適切なサイズのバーブを備えたメスルアーコネクタを使用して肺動脈をカニューレします。カニューレをアルコール滅菌した結束バンドで所定の位置に固定します。プラスチック製の結束バンドを気管の周りに滑り込ませます。

メスのルアーコネクタを気管の開口部に挿入し、コネクタのバーブの周りの結束バンドを締めて、気管をバーブの周りの所定の位置に保持します。ヘパリン1ミリリットルあたり30単位、ニトロプレスナトリウム側1ミリリットルあたり5マイクログラムを含むリン酸塩緩衝生理食塩水またはPBSを注入することにより、肺から閉じ込められた空気を取り除きます。SNPと略すと、溶液を繰り返す前に自然な反動によって溶液を排出することができます。

PBSヘパリンSNP溶液による3回目の気道留置後、さらに2回設置します。気管ルアーカニューレをルアープラグでキャップします。心臓の頂点を切り取り、PBSヘパリンSNPで内心室を洗浄し、残留血液裂傷と両方の心房を除去し、灌流時の肺回路のドレナージを促進します。

PBSヘパリンSNP溶液を充填した60ccシリンジを肺動脈カニューレに取り付け、プランジャーを慎重に取り外して、液体が血管系に流れ込むようにします。気管カニューレからプラグを取り外し、気道内の液体が自然な反動によって排出されるのを待ちます。肺血管系からできるだけ多くの血液が除去されるまで灌流を続けます。

手順の最も難しい側面は、効果的にすすぎ、肺気道を洗浄することです液体では、気道が液体を伝導することを意図していないため、液体の流れはガスに対して阻害されます、時間と患者はこれらの手順を達成するために必要です、我々は、脱細胞化が進行し、細胞の破片が洗い流されるにつれて気道に残っている残りの液体にもかかわらず、プロトコルを続行することをお勧めします、 液体の粘度は低いままで、肺は初日に効率的に液体を排出することができます。心肺ブロックを脱イオン水に浸し、水中の気管と動脈カニューレにそれぞれ取り付けられた60ccの注射器を使用して、肺を脱イオン水で膨らませて灌流します。脱イオン水で気道洗浄と血管洗浄を効果的に繰り返します。

さらに4回、5回の洗浄後、それぞれ約0.5〜1リットルの合計5回のすすぎを行い、肺を水から取り出し、ブロックをTriton溶液に浸します。トリトン溶液で肺を膨らませて灌流します。前回と同様に、インストールを2回繰り返し、Triton溶液で水没した臓器を摂氏4度で一晩インキュベートします。

一晩のインキュベーション後、トリトン溶液から肺ブロックを取り出し、脱イオン水で外部から洗浄します。次に、ブロックを新鮮な脱イオン水に沈めました。脱イオン水を気管と肺動脈に5回注入して、トリトン溶液と細胞の破片を洗い流します。

脱イオン水から肺を取り出し、2%デオキシナトリウムコートまたはSDC溶液に浸します。同様に、SDC溶液で膨らませて灌流します。3日目に肺をSDC溶液に摂氏4度で一晩浸します。

組織を脱イオン水で再度外部から、気道と血管系を通して5回洗浄します。.前と同様に、脱イオン水から組織を取り出し、1モルの塩化ナトリウム溶液に浸します。前と同様に塩化ナトリウム溶液で膨潤して灌流し、脱イオン水で5回のすすぎで肺の塩化ナトリウム溶液をきれいに洗浄した後、組織を室温で塩化ナトリウム溶液に1時間浸します。.

以前と同様に、それらを新鮮なDNA溶液に浸し、この溶液を気道と血管系に注入します。肺をDNA溶液中で室温で1時間インキュベートします。次に、DNA溶液から肺を取り出し、PBS溶液で外部洗浄します。

肺をPBS溶液に浸し、この溶液を気道と血管系を通して5回洗浄します。前回と同様に、肺をPBS溶液に入れ、密閉容器に入れて4日目に摂氏4度で一晩保存します。気道と血管系を通して、新鮮な氷のように冷たいPBS溶液で肺を5回洗います。

その後、使用するまで摂氏4度の滅菌密閉容器にPBS溶液で保管してください。回路図に従って、バイオリアクターコンポーネントを層流フードの下に組み立てます。テキストプロトコールでは、バイオリアクターで使用する直前に、細胞培養インキュベーターの5%CO2雰囲気に平衡化された培地をメインチャンバーに充填し、気管および血管カニューレアダプターを肺カニューレに適用します。

肺を培養培地に浸し、カニューレアダプターを改造した蓋の適切なポートに取り付けて、メインバイオリアクターチャンバーに臓器を取り付けます。接続したら、フタをしっかりとしっかりと固定します。シリンジポートと18ゲージの針が取り付けられた60 CCCシリンジを使用してチューブから空気を吸引する間、チャンバーは再び開くことはありません。

密閉された連続した接続された臓器付きバイオリアクターチャンバーを組織培養インキュベーターに移し、温度とガスを平衡化します。主室に取り付けられたシリンジポンプを使用して、約2分ごとに約1回の満息で肺を換気し、蠕動ポンプを介して血管系を毎分約10ミリリットルで灌流します。呼吸ループの三方向ストップコックに取り付けられたシリンジポートから穏やかに注入することにより、細胞懸濁液で肺を膨らませます。

肺を摂氏37度、気道や血管灌流なしで一晩5%CO2で静的に保持し、細胞が脱細胞化した肺マトリックスに付着できるようにします。一晩のインキュベーション後、標準的な気道換気プログラムと培養を再開し、血管座位のために臓器を3〜7日間培養します。この2つのコンパートメントを接続するチューブ内に配置されたストップコック上のバルブを回転させることで、メインチャンバーから内皮着座リザーバーへの流路の方向性を変えることができ、播種が完了したらマグネティックスターで穏やかに攪拌しながら、蠕動ポンプで内皮細胞を徐々に播種します。

ストンプ灌流を行い、約4〜6時間静的にインキュベートします。メインチャンバー培地で毎分約10ミリリットルの速度で血管灌流を再開します。気道換気培養期間と並行して、継続的な血管灌流を伴って3〜7日間培養します。

脱細胞化プロセス全体を通じて、MCCAの肺は進行性の美白を示し、プロセスの終わりには半透明の外観になりました。しかし、肺は肉眼的な解剖学的特徴を維持し、主に弾力性を保ち、液体で膨張した後に自然な反動を生成することができました。ミクロレベルです。

組織学的超微細構造は、脱細胞化後も無傷のままでした。それが気管支呼吸気管支肺胞嚢です。血管と毛細血管は、低倍率顕微鏡ではまだ非常に明確に区別できました。

しかし、組織学的微小解剖学は、肺の肉眼解剖学的構造と超微細構造が脱細胞化によって軽度に乱された一方で、ここに見られるように組織には無傷の細胞が完全に欠けていることを示しました。脱細胞化組織には微量のDNAしか残っていませんでした。また、アルコール沈殿により濃縮し、0.8%AROSゲル中で可視化した微量DNAは、ほとんどが低分子量分解フラグメントで構成されていました。

細胞タンパク質除去の効率は、天然および脱細胞化肺タンパク質の両方のウェスタンブロット分析によって評価されました。βアクチンに対する抗体を用いたライセートであるβアクチンは、天然の肺溶解物では容易に検出されましたが、脱細胞化した肺ライセートでは検出されませんでした。このことから、マカ骨髄由来間葉系幹細胞またはBMCによる気道播種およびバイオリアクター培養の14日後に、脱細胞化が細胞を劇的に枯渇させ、細胞関連タンパク質物質を除去したことが示唆されています。脱細胞化したマカ肺の実質は効果的に形成されました。

BMCは、歯槽中隔を覆いながら、透明で開いた歯槽内腔を維持していました。大きな気道の剥離したマトリックスは、バイオリアクターを使用してBMCによっても化され、主茎気管支の管腔表面は、14日間の培養後にBMCのような扁平上皮の単層で裏打ちされました。ここに示すバイオリアクターでは、血管系に微小血管内皮細胞を播種し、内皮培養培地を毎分5ミリリットルで一定に血管灌流した後、脱細胞化したレウス肺葉が見られます。

組織学的解析により、肺実質の小血管系を覆う細胞が明らかになりました。場合によっては、細胞が内腔を横切るいくつかの細胞突起を介してマトリックスに付着しているように見えましたが、血管の他の断面では、細胞が内皮表面に透明な内腔で裏打ちされていることが示されました。この手順に従います。

免疫組織化学、ウェスタンブロット、定量的リアルタイムPCRなどの他の方法を実行して、播種された幹細胞が無細胞肺マトリックス上で培養された肺系譜細胞に分化するのか、それともバイオリアクター内の成熟した上皮細胞および内皮細胞と分化するのかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、非ヒト霊長類の肺を脱細胞化し、その後得られた無細胞肺をバイオリアクターシステムで幹細胞、上皮細胞、および内皮細胞を培養するための足場として使用する方法について十分に理解できるはずです。ヒト以外の霊長類組織を扱うことは非常に危険であり、フェイスシールドやラテックスまたはニトリル手袋の二重層を含む完全な個人用保護具を着用するなどの予防措置を、この手順を実行するときは常に服用する必要があることを忘れないでください。